專利名稱：一種石斑魚虹彩病毒(sgiv)滅活疫苗的轉瓶生產方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水產動物疫苗領域，具體涉及一種石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法。
背景技術：
石斑魚肉質鮮美蛋白含量高，是一種經濟價值極高的食用魚類，也是我國創(chuàng)匯的優(yōu)良魚類品種。但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，各種病害特別是病毒性疾病頻繁爆發(fā)，造成了重大的經濟損失。虹彩病毒是石斑魚的重要致病病原，它可以造成魚類的死亡率從30%(成魚中)到100%(幼苗階段)。這種病毒在亞洲，特別是在22°C以上的高水溫，極易感染中國、日本和東南亞等國養(yǎng)殖的海水名貴魚類，如石斑魚、尖吻鱸、真鯛、牙鲆和大黃魚等，致使魚類大面積的死亡，造成嚴重的經濟損失，因而被稱之為“海洋口 蹄疫”。石斑魚虹彩病毒(SGIV)是從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的一株新的虹彩病毒，可導致石斑魚死亡率達90%以上，給石斑魚的養(yǎng)殖帶來巨大的經濟損失。因此，如何預防和治療虹彩病毒病已成為當今世界上石斑魚養(yǎng)殖業(yè)急需解決的重要問題。眾所周知，疫苗作為化學藥品和抗生素的替代品，是治療疾病、特別是病毒病的最好選擇。滅活疫苗具有較強的安全性和免疫原性。專利公開號為102178945A的專利申請，公開了一種制備石斑魚虹彩病毒P -丙內酯滅活疫苗的方法，制備的滅活疫苗可以使赤點石斑魚獲得十分理想的免疫保護效果，相對免疫保護率在90%以上，對防治石斑魚虹彩病毒病有很高的實踐應用價值。但是該方法只是在實驗室里制備細胞滅活疫苗，其生產成本高，勞動強度大，還無法在工業(yè)上大規(guī)模的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種生產成本低、勞動強度小，能適用于GMP條件下大規(guī)模生產安全有效的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法。本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，包括以下步驟(I)細胞的轉瓶培養(yǎng)將石斑魚脾組織細胞接入轉瓶中，加入細胞生長液，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，轉速為16 20轉/小時，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基；(2)病毒的擴增和收獲轉瓶培養(yǎng)石斑魚脾組織細胞直至長滿單層，接種0. 01M0I的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為16 20轉/小時，培養(yǎng)2 3小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3飛轉/小時，以擴增病毒，觀察病毒病變效應，直至細胞病變完全，然后反復凍融2 3次；(3)將凍融后的病毒液中的病毒滅活后獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。所述的石斑魚脾組織細胞是通過以下方法培養(yǎng)的將長滿單層的石斑魚脾組織細胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化廣2分鐘，加入新的細胞生長液，吹勻后分至細胞培養(yǎng)瓶中于28°C進行培養(yǎng)擴增，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基。
所述的步驟(I)具體為取1(T15個長滿單層石斑魚脾組織細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化r2分鐘，加入新的細胞生長液吹勻，然后轉移至5L轉瓶中，加入新的細胞生長液至總體積500ml，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，溫度控制為28°C，轉速為16 20轉/小時；所述的步驟(2)具體為待培養(yǎng)2 3天后，石斑魚脾組織細胞長滿單層，接種0. 01M0I的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，置于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為16 20轉/小時，培養(yǎng)2 3個小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3飛轉/小時，以擴增病毒，連續(xù)培養(yǎng)4飛天后，細胞病變完全，反復凍融2-3次，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基；所述的步驟(3)具體為將凍融后的病毒液用氫氧化鈉溶液調pH值至7. 4 7. 6，加入￠-丙內酯，￠-丙內酯與病毒液的體積比為I :500，混勻后在4°C滅活處理16 20小時，滅活期間維持pH值在7. Cl. 6之間，滅活結束后病毒液于37°C水浴水解2小時，以充分水解殘留的￠-丙內酯，由此獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。HEPES其中文名為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，其對細胞無毒性作用，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的PH范圍。L15培養(yǎng)基是現有技術中的常規(guī)培養(yǎng)基，可以從市場上購買到。應用本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法可以大規(guī)模的生產石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗，由于是工業(yè)流程化生產，其生產成本低、勞動強度小，生產出來的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗經過疫苗檢驗，從細胞水平和魚體水平證明該石斑魚虹彩病毒滅活疫苗是安全的，疫苗效力檢測證明，本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的相對保護率為87. 09T95. 7%，說明此石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗對受免石斑魚提供了顯著的保護，具有良好的免疫保護效力，且批間質量穩(wěn)定。由此可見，本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法具有生產成本低、勞動強度小的優(yōu)點，能適用于GMP條件下大規(guī)模生產安全有效的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。


圖I每尾石斑魚幼魚腹腔注射106TCID50/0. I毫升的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗，對照組注射同樣劑量的L15培養(yǎng)基，15天后攻毒，腹腔注射接種病毒，統計15天，計算各組的累積死亡率的圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。整個石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的生產均在珠江水產研究所廣州普麟生物制品有限公司的GMP車間進行，該公司擁有目前為止我國首家符合獸用生物制品GMP要求的水產疫苗生產車間。一、石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的制備實施例I :細胞生長液LeibovitZ’s-15 (L15)培養(yǎng)基，按照公司產品說明配制，另加入質量分數0. 266%NaCl,5mM HEPES,調pH至7. 2 7. 6，本實施例調pH至7. 6，經0. 22 u m濾膜過濾，使用前加入胎牛血清，使其體積分數為8 10%，本實施例為含體積分數10%胎牛血清。I、石斑魚脾組織細胞的小瓶培養(yǎng)。取長滿單層的石斑魚脾組織細胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化f 2分鐘，再加入上述細胞生長液，吹勻后分至3個細胞培養(yǎng)瓶中于28°C進行培養(yǎng)擴增。
2、細胞的轉瓶培養(yǎng)取上述15個長滿單層石斑魚脾組織細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化廣2分鐘，再加入上述細胞生長液吹勻，轉移入5L轉瓶中，加入新鮮上述細胞生長液至總體積為500ml，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，溫度控制為28°C，轉速為16轉/小時。3、病毒的擴增和收獲培養(yǎng)2天后，石斑魚脾組織細胞長滿單層，接種0. 01M0I(multiplicity of infection,感染復數)的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，置于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為16轉/小時培養(yǎng)3個小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為5轉/小時，以擴增病毒。每天觀察細胞病變效應，連續(xù)培養(yǎng)4天后，細胞病變完全(90%以上細胞出現病變)，反復凍融3次，用于以下的病毒滅活。4、病毒的滅活。病毒液用氫氧化鈉溶液調pH值至7. 4，加入P -丙內酯，￠-丙內酯與病毒液的體積比為I :500，混勻后在4°C滅活處理20小時，滅活期間不時調整pH值以 維持PH值在7. O. 6之間。滅活結束后病毒液37°C水浴水解2小時，以充分水解殘留的^ -丙內酯，由此制得2個批次石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗，即為批次I和批次2的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗。實施例2 細胞生長液LeibovitZ’s-15 (L15)培養(yǎng)基，按照公司產品說明配制，另加入質量分數0. 266%NaCl,5mM HEPES,調pH至7. 2 7. 6，本實施例調pH至7. 2，經0. 22 u m濾膜過濾，使用前加入胎牛血清，使其體積分數為8 10%，本實施例體積分數為8%胎牛血清。I、石斑魚脾組織細胞的小瓶培養(yǎng)。取長滿單層的石斑魚脾組織細胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化f 2分鐘，再加入上述細胞生長液，吹勻后分至3個細胞培養(yǎng)瓶中于28°C進行培養(yǎng)擴增。2、細胞的轉瓶培養(yǎng)取上述10個長滿單層石斑魚脾組織細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化廣2分鐘，再加入上述細胞生長液吹勻，轉移入5L轉瓶中，加入新鮮上述細胞生長液至總體積為500ml，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，溫度控制為28°C，轉速為20轉/小時。3、病毒的擴增和收獲培養(yǎng)3天后，石斑魚脾組織細胞長滿單層，接種0. 01M0I(multiplicity of infection,感染復數)的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，置于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為20轉/小時，培養(yǎng)2個小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3轉/小時，以擴增病毒。每天觀察細胞病變效應，連續(xù)培養(yǎng)6天后，細胞病變完全(90%以上細胞出現病變)，反復凍融2次，用于以下的病毒滅活。
4、病毒的滅活。病毒液用氫氧化鈉溶液調pH值至7. 6，加入P -丙內酯，￠-丙內酯與病毒液的體積比為I :500，混勻后在4°C滅活處理16小時，滅活期間不時調整pH值以維持PH值在7. O. 6之間。滅活結束后病毒液于37°C水浴水解2小時，以充分水解殘留的^ -丙內酯，由此制得2批次的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗，即為批次3和批次4的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗。二、石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的效果I、疫苗檢驗按以上實施例的方法生產了 4批次的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗，每批都進行安全性和效力檢驗。(I)細胞水平的安全性實驗 將4批次的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗分別接種石斑魚脾組織細胞，觀察細胞病變效應(cytopathic effect, CPE),連續(xù)傳3代均沒有觀察到CPE,證明滅活完全,不再具備感染性。(2)魚體水平的安全性實驗a、單劑量接種的安全性試驗每尾石斑魚幼魚腹腔接種0. Iml的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗(4批次的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗分別進行實驗)，每批疫苗接種8尾，共32尾石斑魚進行了單劑量接種的安全性試驗。試驗期間各組幼魚食欲、行為活動正常，體征未見異常表現，注射局部和全身均無任何不良反應，試驗所用幼魚全部存活。注射后第14天全部處死，解剖觀察各組試驗幼魚均未見異常病理學變化。本試驗結果說明制備的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗對幼魚無明顯的毒副作用。b、單劑量重復接種的安全性試驗每尾石斑魚幼魚腹腔接種0. Iml的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗(4批次的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗分別進行實驗)，10天后重復接種，每批疫苗接種8尾，共32尾石斑魚進行了單劑量接種的安全性試驗。整個試驗期間各組幼魚食欲、行為活動正常，試驗所用幼魚全部存活。注射后第14天全部處死，解剖觀察各組試驗幼魚均未見異常病理學變化。本試驗結果再次說明制備的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗對幼魚無明顯的毒副作用。C、一次超劑量接種的安全性試驗每尾石斑魚幼魚腹腔接種Iml的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗(4批次的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗分別進行實驗)，每批疫苗接種8尾，共32尾石斑魚進行了單劑量接種的安全性試驗。試驗期間各組幼魚食欲、行為活動正常，試驗所用幼魚全部存活。注射后第14天全部處死，解剖觀察各組試驗幼魚均未見異常病理學變化。本試驗結果進一步說明制備的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗對幼魚無明顯的毒副作用。(3)疫苗效力檢測。取使用劑量即IO6TCID 50/0. I毫升腹腔免疫石斑魚幼魚，對照組注射同樣劑量的L15培養(yǎng)基。15天后攻毒，每日統計死亡魚數，根據統計出來的各組的死亡率，依公式計算相對保護率。具體結果見圖I和表1，由圖I和表I可以看出，對照組的死亡率在90%以上，疫苗免疫組(批次1、2、3和4的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗組)的相對保護率為87. 09T95. 7%，說明此石斑魚虹彩病毒滅活疫苗對受免石斑魚提供了顯著的保護，具有良好的免疫保護效力，且批間質量穩(wěn)定。
表I :根據統計出來的各組的死亡率，依公式計算相對保護率
權利要求
1.ー種石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)細胞的轉瓶培養(yǎng)將石斑 魚脾組織細胞接入轉瓶中，加入細胞生長液，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，轉速為16 20轉/小時，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基； (2)病毒的擴增和收獲轉瓶培養(yǎng)石斑魚脾組織細胞直至長滿單層，接種0.OlMOI的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為16 20轉/小吋，培養(yǎng)2 3小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3飛轉/小吋，以擴增病毒，觀察病毒病變效應，直至細胞病變完全，然后反復凍融2 3次； (3)將凍融后的病毒液中的病毒滅活后獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。
2.根據權利要求I所述的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，所述的石斑魚脾組織細胞是通過以下方法培養(yǎng)的將長滿單層的石斑魚脾組織細胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化廣2分鐘，加入新的細胞生長液，吹勻后分至細胞培養(yǎng)瓶中于28°C進行培養(yǎng)擴增，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基。
3.根據權利要求I或2所述的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，所述的步驟(I)具體為取1(T15個長滿單層石斑魚脾組織細胞的75cm2細胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質量分數0. 25%的胰蛋白酶消化f 2分鐘，加入新的細胞生長液吹勻，然后轉移至5L轉瓶中，加入新的細胞生長液至總體積500ml，充分搖勻后置于轉瓶機上培養(yǎng)，溫度控制為28°C，轉速為16 20轉/小時；所述的步驟(2)具體為待培養(yǎng)2 3天后，石斑魚脾組織細胞長滿單層，接種0. 01M0I的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，置于28°C培養(yǎng)，轉瓶機轉速設置為16 20轉/小時，培養(yǎng)2 3個小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3飛轉/小吋，以擴增病毒，連續(xù)培養(yǎng)4飛天后，細胞病變完全，反復凍融2-3次，所述的細胞生長液為含體積分數8 10%的胎牛血清、質量分數0. 266%NaCl和5mM HEPES的L15培養(yǎng)基；所述的步驟(3)具體為將凍融后的病毒液用氫氧化鈉溶液調pH值至7. 4 7. 6，加入￠-丙內酷，￠-丙內酯與病毒液的體積比為I :500，混勻后在4°C滅活處理16 20小吋，滅活期間維持pH值在7. Cl. 6之間，滅活結束后病毒液于37°C水浴水解2小吋，以充分水解殘留的P -丙內酷，由此獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法。它包括細胞的轉瓶培養(yǎng)、病毒的擴增和收獲和病毒滅活。應用本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的轉瓶生產方法可以大規(guī)模的生產石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗，由于是工業(yè)流程化生產，其生產成本低、勞動強度小，生產出來的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗經過疫苗檢驗，從細胞水平和魚體水平證明該石斑魚虹彩病毒滅活疫苗是安全的，疫苗效力檢測證明，本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗的相對保護率為87.0%~95.7%，說明此石斑魚虹彩病毒(SGIV)滅活疫苗對受免石斑魚提供了顯著的保護，具有良好的免疫保護效力，且批間質量穩(wěn)定。
文檔編號A61K39/12GK102727879SQ20121024029
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權日2012年7月11日
發(fā)明者歐陽征亮, 秦啟偉, 魏京廣, 黃曉紅 申請人:中國科學院南海海洋研究所