專利名稱：用配體-免疫原綴合物治療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療特征為存在致病細胞群體的疾病的方法和藥用組合物。更具體地講，將細胞靶向配體-免疫原復(fù)合物給予患病宿主、最好與免疫系統(tǒng)刺激物或其它治療因子聯(lián)合給予，以增強和/或再指導(dǎo)宿主對所述致病細胞的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
哺乳動物免疫系統(tǒng)提供了識別和消除腫瘤細胞、其它致病細胞和侵入的外源病原體的工具。雖然免疫系統(tǒng)正常提供一道強防線，但仍有許多情況下癌細胞、其它致病細胞或病原體避過宿主的免疫應(yīng)答，并且增殖或持續(xù)存在并伴隨宿主發(fā)病。已經(jīng)開發(fā)了化療藥和放射療法來消除復(fù)制中的腫瘤。然而，目前可利用的化療藥和放射治療方案中的大多數(shù) (即使不是全部)都有毒副作用，因為它們發(fā)揮作用不僅破壞癌細胞，而且也影響正常宿主細胞，例如造血系統(tǒng)的細胞。此外，化療藥在宿主產(chǎn)生抗藥性時功效有限。外源病原體也可以通過避過有效的免疫應(yīng)答或在由于藥療或其它健康問題宿主免疫系統(tǒng)無應(yīng)答的情況下在宿主中增殖。雖然已經(jīng)研制了許多治療化合物，但許多病原體抗這類治療劑，或已經(jīng)變?yōu)榭惯@類治療劑。癌細胞和感染性生物對治療藥產(chǎn)生抗性的能力、以及目前可利用的抗癌藥的毒副作用使得非常需要開發(fā)對致病細胞群體具特異性并且宿主毒性降低的新療法。研究人員已經(jīng)開發(fā)了通過將細胞毒性化合物特異性靶向這類細胞破壞癌細胞的治療方案。這些方案利用與同癌細胞特有的或過量表達的受體結(jié)合的配體綴合的毒素，以嘗試最大限度地減少所述毒素傳遞至正常細胞。采用這種方法，已經(jīng)研制了一些由針對致病細胞上特定受體、與毒素(例如蓖麻毒蛋白、假單胞菌外毒素、白喉毒素和腫瘤壞死因子)聯(lián)合的抗體組成的免疫毒素。這些免疫毒素靶向帶有所述抗體所識別的特定受體的腫瘤細胞(Olsnes, S.，Immunol. Today, 10,第 291-295 頁，1989 ；Melby, E. L.，Cancer Res.，53⑶，第1755-1760頁，1993 ；Better, M. D.，1991年5月30日公開的PCT公開說明書WO91/07418)。選擇性靶向宿主中癌細胞群體或外源病原體的另一種方法是增強宿主針對所述致病細胞的免疫應(yīng)答，從而無需給予也可能表現(xiàn)出獨立的宿主毒性的化合物。一種已報道的免疫療法的策略是使抗體例如遺傳工程多聚抗體結(jié)合于腫瘤細胞表面，以在所述細胞表面展示所述抗體的恒定區(qū)，從而通過各種免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的過程誘導(dǎo)腫瘤細胞殺傷(DeVita, V. T. , Biologic Therapy of Cancer,第 2 版，Philadelphia, Lippincott,1995 ；Soulil lou，J. P.，美國專利5，672，486)。然而，這種方法由于難以確定腫瘤特異性抗原而復(fù)雜化。依賴于宿主免疫活性的另一種方法是將抗T細胞受體抗體或抗Fe受體抗體靶向腫瘤細胞表面，以促進免疫細胞與腫瘤的直接結(jié)合(Kranz，D.M.，美國專利5，547，668)。也介紹了一種基于疫苗的方法，該方法依賴于包含與細胞因子融合的抗原的疫苗，所述細胞因子修飾所述疫苗抗原的免疫原性，從而刺激針對所述病原體的免疫應(yīng)答(Pillai，S.，1991年2月7日公開的PCT公開說明書WO 91/11146)。該方法依賴于所報道的免疫應(yīng)答的間接調(diào)節(jié)。另一種用于殺傷不想要的細胞群體的方法利用與抗原聯(lián)合的IL-2或抗胸腺細胞球蛋白的Fab片段，以消除不想要的T細胞；然而，根據(jù)所報道的實驗數(shù)據(jù)，該方法看來僅消除了50%的靶細胞群體，并且在體內(nèi)導(dǎo)致非特異性細胞殺傷(即50%的不是T細胞的外周血淋巴細胞也被殺傷(Pouletty，P.，1997年10月16日公開的PCT公開說明書W097/37690))。因此，仍非常需要針對治療特征為受影響宿主中存在致病細胞群體的疾病狀態(tài)的療法。本發(fā)明涉及一種通過增強宿主免疫系統(tǒng)識別致病細胞群體并對其應(yīng)答而消除宿主中這類細胞群體的方法。有效地增強所述細胞病原體的抗原性，以增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的致病細胞群體的消除。該方法避免或減少了對細胞毒性或抗微生物治療藥的應(yīng)用。該方法包括給予配體-免疫原綴合物，其中所述配體能夠在體內(nèi)特異性結(jié)合獨特表達、優(yōu)先表達或過量表達配體結(jié)合部分的致病細胞群體，而所述配體綴合的免疫原能夠激發(fā)抗體產(chǎn)生，或更優(yōu)選能夠被宿主動物體內(nèi)內(nèi)源抗體或共同給予的外源抗體所識別。通過所述免疫·原綴合的配體與所述致病細胞獨特表達、過量表達或優(yōu)先表達的受體、轉(zhuǎn)運蛋白或其它表面呈遞蛋白結(jié)合，指導(dǎo)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的致病細胞的消除。所述致病細胞獨特表達、過量表達或優(yōu)先表達的表面呈遞蛋白是在非致病細胞上不存在的或以較低量存在的受體，提供了一種選擇性消除所述致病細胞的方法?？梢詫⒅辽僖环N另外的治療因子例如免疫系統(tǒng)刺激物、細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、細胞毒性免疫細胞或抗微生物藥共同給予宿主動物，以增強治療功效。在一個實施方案中，本發(fā)明方法包括下述步驟給予能夠在體內(nèi)高親和性特異性地結(jié)合所述靶致病細胞群體上獨特表達、優(yōu)先表達或過量表達的細胞表面蛋白的配體，所述配體與所述宿主動物中已經(jīng)存在的或可以被激發(fā)的先天性免疫或獲得性免疫所針對的免疫原綴合，任選地共同給予至少一種作為內(nèi)源免疫應(yīng)答激活劑或細胞毒性化合物的治療因子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括給予宿主動物一種配體-免疫原綴合物組合物，其中所述配體是葉酸或另一種葉酸受體結(jié)合配體。所述配體通過例如共價結(jié)合與能夠在宿主動物體內(nèi)激發(fā)抗體應(yīng)答的免疫原綴合，或者更優(yōu)選與結(jié)合于宿主動物體內(nèi)現(xiàn)有內(nèi)源抗體(因先天性免疫或獲得性免疫而產(chǎn)生的)或共同給予的抗體(即通過被動免疫)的免疫原綴合。可以與所述配體-免疫原綴合物的給予結(jié)合，將至少一種另外的不能與所述配體-免疫原復(fù)合物特異性結(jié)合、但能夠刺激或增強內(nèi)源免疫應(yīng)答的治療因子、細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑(例如炎性因子或促炎因子)、化療藥、細胞毒性免疫細胞或抗微生物藥給予宿主動物。依照本發(fā)明的另一實施方案，提供一種增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)的所述細胞群體的方法，其中所述細胞群體的成員具有配體可及的結(jié)合部位。所述方法包括下述步驟給予所述宿主一種配體-免疫原綴合物組合物和至少一種另外的組合物，所述組合物包含所述配體和一種免疫原的復(fù)合物，其中已知所述免疫原為所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫細胞直接識別，所述至少一種另外的組合物包含一種治療因子，所述因子選自細胞殺傷齊U、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不結(jié)合所述配體-免疫原綴合物。依照本發(fā)明的一個替代實施方案，提供一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強所述細胞群體的內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除的方法，其中所述群體表達配體的結(jié)合部位。所述方法包括下述步驟給予所述宿主一種組合物，所述組合物包含所述配體和一種免疫原的復(fù)合物；給予所述宿主針對所述免疫原的抗體；以及給予所述宿主至少一種另外的治療因子，所述因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和不結(jié)合所述配體-免疫原復(fù)合物的內(nèi)源免疫應(yīng)答刺激物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，提供一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強所述細胞群體的內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體。所述方法包括下述步驟給予所述宿主一種組合物，所述組合物包含免疫原的共價連接綴合物和一種配體,其中已知所述免疫原為所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫細胞直接識別，而所述配體包含具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中與所述免疫原的共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的Y-羧基。在另一實施方案中，將至少一種另外的包含一種治療因子的組合物給 予所述宿主，所述因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不結(jié)合所述配體-免疫原綴合物。在本發(fā)明的再一實施方案中，提供一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強所述細胞群體的內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體。所述方法包括下述步驟給予所述宿主一種組合物，所述組合物包含免疫原的共價連接綴合物和一種配體，其中已知所述免疫原為所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原被所述宿主的免疫細胞直接識別，而所述配體包含具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中與所述免疫原的共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的α-羧基。在另一實施方案中，將至少一種另外的包含一種治療因子的組合物給予所述宿主，所述因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不結(jié)合所述配體-免疫原綴合物。在本發(fā)明的再一實施方案中，所述靶致病細胞群體是癌細胞群體。在另一實施方案中，所述靶細胞群體是病毒感染的內(nèi)源細胞。在另一實施方案中，所述靶細胞群體是外源生物群體，例如細菌、支原體、酵母或真菌。所述配體-免疫原綴合物結(jié)合于腫瘤細胞或致病生物表面，并且用所述免疫原“標記”所述靶細胞群體的細胞膜，從而觸發(fā)免疫介導(dǎo)的針對所述被標記的細胞群體的應(yīng)答。以被動免疫給予所述宿主的抗體或所述宿主系統(tǒng)中由于現(xiàn)有的先天性免疫或者獲得性免疫而存在的抗體，與所述免疫原結(jié)合并觸發(fā)內(nèi)源免疫應(yīng)答?？贵w與所述細胞結(jié)合的配體-免疫原綴合物結(jié)合，引起補體介導(dǎo)的細胞毒性、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性、抗體調(diào)理作用和吞噬作用、抗體誘導(dǎo)的發(fā)送細胞死亡或靜息信號的受體聚集、或者由于抗體與細胞結(jié)合的配體-免疫原綴合物結(jié)合刺激的任何其它體液或細胞免疫應(yīng)答。在免疫細胞可以直接識別抗原而無需預(yù)先抗體調(diào)理的情況下，可以發(fā)生直接的致病細胞殺傷。外源病原體或者受感染的內(nèi)源細胞或腫瘤內(nèi)源細胞的消除可以通過給予能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的治療因子、細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、細胞毒性免疫細胞或抗微生物藥來進一步增強。在一個實施方案中，所述細胞毒性免疫細胞是一種經(jīng)分離、離體擴充、然后注射到宿主動物中的細胞毒性免疫細胞群體。在本發(fā)明的另一實施方案中，使用免疫刺激物，所述免疫刺激物是白介素例如IL-2、IL-12或IL-15或者IFN例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ或者GM-CSF。在另一實施方案中，所述免疫刺激物可以是一種細胞因子組合物，所述組合物包含細胞因子的組合，例如IL-2、IL-12或IL-15與IFN-α、IFN-β或IFN- Y、或者GM-CSF聯(lián)合、或者其任何有效的組合、或者細胞因子的任何其它有效組合。在本發(fā)明的再一實施方案中，提供一種藥用組合物，所述藥用組合物包含治療有效量的配體-免疫原綴合物、一種治療因子及其藥學(xué)上可接受的載體的組合物，所述配體-免疫原綴合物能夠與宿主動物體內(nèi)的致病細胞群體特異性地結(jié)合，促進通過獲得性或先天性免疫應(yīng)答、共同給予的抗體、或通過所速宿主體內(nèi)的免疫細胞直接地特異性地消除所述細胞，所述治療因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。在一個實施方案中，所述藥用組合物為胃腸外緩釋劑型。在另一實施方案中，所述治療因子是一種免疫刺激物，包括選自以下的一種化合物白介素例如IL-2、IL-12、 IL-15、IFN 例如 IFN- α、IFN- β 或 IFN- Y 和 GM-CSF 或其組合。發(fā)明詳沭提供治療性治療患有癌癥的宿主或感染致病生物的宿主的方法。所述方法通過賦予/標記所述致病細胞抗原性、導(dǎo)致所述細胞被宿主免疫系統(tǒng)識別并消除，導(dǎo)致增強所述致病細胞群體的免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除。所述方法利用能夠高親和性結(jié)合癌細胞或其它病原體的配體-免疫原綴合物。所述高親和性結(jié)合可以是所述配體固有的，所述高親和性結(jié)合可以利用化學(xué)修飾的配體或者由于所述綴合物中存在的所述配體和所述免疫原之間的特定化學(xué)鍵合而得到改進(增強)。所述方法也可以利用聯(lián)合療法，采用所述配體-免疫原綴合物和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的另外的治療因子、細胞殺傷劑、化療藥、腫瘤滲透增強劑、細胞毒性免疫細胞或抗微生物藥，以增強所述致病細胞群體的免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除。本發(fā)明的方法可用來在帶有致病細胞群體的宿主動物中增強所述致病細胞群體的內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除。本發(fā)明適用于引起各種各樣病狀例如癌癥和傳染病的致病細胞群體。因此，致病細胞群體可以是致腫瘤的癌細胞群體，包括良性腫瘤和惡性腫瘤，或者它可以是非致腫瘤的。所述癌細胞群體可以自發(fā)產(chǎn)生，獲得通過諸如宿主動物的生殖系中存在的突變或體細胞突變而產(chǎn)生，或者它可以被化學(xué)、病毒或放射誘導(dǎo)。本發(fā)明可以用來治療諸如癌癥、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑素瘤、間皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻煙癌、白血病和骨髓瘤。所述癌細胞群體可以包括但不限于口腔癌、甲狀腺癌、內(nèi)分泌癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、喉癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、乳癌、睪丸癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌和肺癌。致病細胞群體也可以是外源病原體或帶有外源病原體例如病毒的細胞群體。本發(fā)明適用于諸如細菌、真菌、病毒、支原體和寄生蟲的外源病原體?？梢杂帽景l(fā)明治療的病原體可以是任何本領(lǐng)域熟知的在動物體內(nèi)致病的感染性生物，包括諸如以下的生物革蘭氏陰性或革蘭氏陽性球菌或桿菌的細菌、DNA病毒和RNA病毒，包括但不限于諸如乳頭瘤病毒、細小病毒、腺病毒、皰疫病毒和痘苗病毒的DNA病毒、以及諸如沙粒病毒、冠形病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、細小核糖核酸病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和彈狀病毒的RNA病毒。特別感興趣的是抗生素抗性細菌，例如抗生素抗性鏈球菌(Streptococcus species)和葡萄球菌(Staphlococcus species),或者是對抗生素敏感但引起用抗生素治療的復(fù)發(fā)性感染、以致最終產(chǎn)生抗性生物的細菌。這類生物可以用本發(fā)明的配體-免疫原綴合物與低于正常給予患者的劑量的抗生素聯(lián)合治療，以避免產(chǎn)生這些抗生素抗性細菌菌株。本發(fā)明也適用于任何真菌、支原體種、寄生蟲或在動物中致病的其它感染性生物?？梢杂帽景l(fā)明方法治療的真菌的實例包括生長為霉或酵母樣的真菌，包括例如引起諸如以下疾病的真菌癬、組織胞漿菌病、芽生菌病、曲霉病、隱球菌病、孢子絲菌病、球孢子菌病、類球孢子菌病和念珠菌病。本發(fā)明可以用來治療寄生蟲感染，包括但不限于由以下寄生蟲引起的感染體絳蟲、血吸蟲、組織蛔蟲、變形蟲和瘧原蟲屬(Plasmodium)、錐蟲屬(Trypanosoma)、利什曼原蟲屬(Leishmania)和弓形體屬(Toxoplasma)種。特別感興趣的寄生蟲是表達葉酸受體并結(jié)合葉酸的寄生蟲；然而，在文獻中關(guān)于對感染性生物表現(xiàn)出高親和性的配體有大量的參考文獻。例如，已知其抗生素活性并且與細菌細胞壁前體特異性結(jié)合的青霉素和頭孢菌素同樣可以用作制備按照本發(fā)明使用的配體-免疫原綴合物的配體。本發(fā)明的配體-免疫原綴合物也可以針對帶有內(nèi)源病原體的細胞群體，其中所述病原體特異性抗原優(yōu)先在帶有所述病原體的細胞表面表達，并且用作與所述抗原特異性結(jié)合的配體的受體。 本發(fā)明的方法可以用于人類臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。因此，帶有致病生物群體并且用配體-免疫原綴合物治療的宿主動物可以是人類，或者在獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用的情況下，可以是實驗室動物、農(nóng)用動物、馴養(yǎng)動物或野生動物。本發(fā)明可以適用于包括但不限于以下的宿主動物人類；實驗室動物，諸如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠等)、兔、猴、黑猩猩；馴養(yǎng)動物，例如狗、貓和兔；農(nóng)用動物，例如牛、馬、豬、綿羊、山羊；和關(guān)養(yǎng)的野生動物，例如熊、熊貓、獅、虎、豹、大象、斑馬、長頸鹿、大猩猩、海豚和鯨。所述配體-免疫原綴合物最好胃腸外給予宿主動物，例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈給予?；蛘?，所述綴合物可以通過其它藥物有用的方法給予宿主動物，可以使用任何有效的劑量和合適的治療劑型，包括緩釋劑型。本發(fā)明的方法可以與腫瘤的手術(shù)去除、放射療法、化學(xué)療法或生物療法例如包括但不限于以下的其它免疫療法聯(lián)合應(yīng)用單克隆抗體療法、用免疫調(diào)節(jié)藥治療、免疫效應(yīng)細胞的繼承性轉(zhuǎn)移、用造血生長因子、細胞因子和疫苗接種治療。按照本發(fā)明，所述配體-免疫原綴合物可以選自各種各樣的配體和免疫原。所述配體必須因為所述致病細胞上優(yōu)先表達所述配體結(jié)合可及的所述配體的受體，而能夠特異性地消除宿主動物體內(nèi)的致病細胞群體。可接受的配體包括葉酸、葉酸類似物和其它葉酸受體結(jié)合分子、其它維生素、通過文庫篩選鑒定的肽配體、腫瘤特異性肽、腫瘤特異性適體(aptamer)、腫瘤特異性糖類、腫瘤特異性單克隆抗體或多克隆抗體、抗體的Fab或scFv(即單鏈可變區(qū))片段例如針對EphA2或轉(zhuǎn)移性癌細胞上特異性表達或特有可及的其它蛋白的抗體的Fab片段、得自組合文庫的小有機分子、生長因子例如EGF、FGF、胰島素和胰島素樣生長因子和同源多肽、促生長素抑制素及其類似物、運鐵蛋白、脂蛋白復(fù)合物、膽鹽、選擇蛋白、類固醇激素、含Arg-Gly-Asp肽、類視黃醇、各種半乳凝素(Galectin)、δ -阿片樣物質(zhì)受體配體、縮膽囊素A受體配體、血管緊張肽ATl或ΑΤ2受體特異性配體、過氧化物酶體增殖活化受體Y配體、內(nèi)酰胺抗生素、小有機分子包括抗微生物藥、和與優(yōu)先在腫瘤細胞或感染性生物表面表達的受體特異性結(jié)合的其它分子、或任何這些分子的片段。在與感染性生物結(jié)合的配體的情況下，感興趣的是本領(lǐng)域已知優(yōu)先與所述微生物結(jié)合的任何分子，例如抗生素或其它藥物。本發(fā)明也適用于作為根據(jù)特定受體的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計以適合所述受體的結(jié)合口袋的分子的配體(例如抗微生物藥)、或其它細胞表面蛋白，并且其中所述受體在腫瘤、細菌、病毒、支原體、真菌、寄生蟲或其它病原體表面上優(yōu)先表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，也考慮了可以利用配體與任何腫瘤抗原或在腫瘤細胞表面優(yōu)先表達的其它分子的結(jié)合。所述配體的結(jié)合部位可以包括能夠與受體特異性結(jié)合的任何分子的受體，其中所述受體或其它蛋白在致病細胞群體上優(yōu)先表達，包括例如生長因子、維生素、肽(包括阿片樣肽)、激素、抗體、糖類和小有機分子的受體。所述結(jié)合部位也可以是任何分子例如抗生素或其它藥物的結(jié)合部位，其中本領(lǐng)域已知所述部位優(yōu)先存在于微生物上。例如，所述結(jié)合部位可以是細菌細胞壁中內(nèi)酰胺抗生素(例如青霉素)的結(jié)合部位，或者是病毒表面特有存在的抗病毒藥的結(jié)合部位。本發(fā)明也適用于根據(jù)所述受體的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計以適合于
所述受體結(jié)合部位的配體(例如抗微生物藥)的結(jié)合部位，并且其中所述受體優(yōu)先在所述致病細胞或生物表面表達。也設(shè)想了腫瘤特異性抗原可以用作本發(fā)明方法中配體的結(jié)合部位。可以用作配體-免疫原綴合物的結(jié)合部位的腫瘤特異性抗原的一個實例是Ephrin蛋白家族成員(例如EphA2)的胞外表位。EphA2表達限于正常細胞的細胞間連接，但在轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中EphA2分布在整個細胞表面上。因此，轉(zhuǎn)移細胞上EphA2對于與例如免疫原綴合的抗體Fab片段的結(jié)合而言是可及的，而所述蛋白對于正常細胞上Fab片段的結(jié)合將是不可及的，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性癌細胞特異性的配體-免疫原綴合物。本發(fā)明還設(shè)想了聯(lián)合應(yīng)用配體-免疫原綴合物，以將所述致病細胞的靶向最大化，以供獲得性或先天性免疫應(yīng)答或通過共同給予的抗體進行消除。用于本發(fā)明的可接受的免疫原是能夠在宿主動物體內(nèi)誘發(fā)抗體產(chǎn)生、或者先前已經(jīng)在宿主動物體內(nèi)誘發(fā)了抗體產(chǎn)生、引起現(xiàn)有免疫或者作為先天性免疫系統(tǒng)組成部分的免疫原?；蛘?，可以將針對所述免疫原的抗體給予所述宿主動物，以建立被動免疫。用于本發(fā)明的合適免疫原包括已經(jīng)通過正常的計劃接種或先前天然接觸諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒、破傷風(fēng)、斑疹傷寒、風(fēng)疹、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳、結(jié)核病的因子和流感抗原的因子和α -半乳糖基已經(jīng)產(chǎn)生的現(xiàn)有免疫所針對的抗原或抗原肽。在這種情況下，所述配體-免疫原綴合物將用來將先前獲得的體液免疫或細胞免疫再導(dǎo)向宿主動物體內(nèi)的致病細胞群體，以消除所述外源細胞或致病生物。其它合適的免疫原包括所述宿主動物已經(jīng)通過抗非天然抗原或半抗原(例如異硫氰酸熒光素或二硝基苯基)的免疫產(chǎn)生的新免疫所針對的抗原或抗原肽、以及存在的先天性免疫所針對的抗原(例如超抗原和胞壁酰二肽)?？梢岳萌我槐绢I(lǐng)域熟知的形成復(fù)合體的方法，將本發(fā)明的配體和免疫原綴合。這可以包括將所述配體與所述免疫原或者直接、或者通過一個連接基團(例如二價接頭)通過共價鍵、離子鍵或氫鍵結(jié)合。所述綴合物通常通過所述配體與所述免疫原通過在所述復(fù)合體相應(yīng)組分上的酸、醛、羥基、氨基或聯(lián)亞氨基之間形成酰胺鍵、酯鍵或亞氨基鍵(imino bond)共價連接。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述配體是葉酸、葉酸類似物、或任何其它葉酸受體結(jié)合分子、以及通過利用三氟乙酸酐通過蝶酰疊氮化物中間體制備葉酸的Y-酯的方法、與所述免疫原綴合的葉酸配體。這種優(yōu)選方法導(dǎo)致合成僅通過葉酸的谷氨酸基團的Y-羧基與所述免疫原綴合的葉酸配體，其中所述Y-綴合物以高親和性與所述葉酸受體結(jié)合，避免了 α-綴合物和Y-綴合物的混合物的形成?；蛘?，可以從中間體制備純α-綴合物，其中所述Y-羧基被選擇性封閉，形成α-綴合物，隨后用本領(lǐng)域熟知的有機合成方案和方法將Y-羧基去封閉。特別是，可以用其它的維生素作為可供制備依照本發(fā)明的綴合物的配體。例如，可以用生物素和核黃素以及葉酸形成配體-免疫原綴合物(參見美國專利第5，108, 921,5, 416, 016 5,635, 382號，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。本發(fā)明的配體-免疫原綴合物增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的致病細胞群體的消除。所述內(nèi)源免疫應(yīng)答可以包括體液應(yīng)答、細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、以及宿主動物內(nèi)源的任何其它免疫應(yīng)答，包括補體介導(dǎo)的細胞裂解、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、導(dǎo)致吞噬作用的抗體調(diào)理作用、抗體結(jié)合時產(chǎn)生細胞凋亡信號、抗增殖或分化的受體聚集、以及所傳遞的抗原/半抗原的直接免疫細胞識別。也設(shè)想了所述內(nèi)源免疫應(yīng)答將采用細胞因子分泌，所述細胞因子調(diào)節(jié)諸如免疫細胞增殖和遷移的過程。所述內(nèi)源免疫應(yīng)答可以包括諸如B細胞、T細胞(包括輔助T細胞和細胞毒性T細胞)、巨噬細胞、天然殺傷細胞、嗜中性粒細胞、LAK細胞等的免疫細胞類型的參與。 體液應(yīng)答可以是通過諸如正常計劃接種或者用天然抗原或誘導(dǎo)新的免疫的非天然抗原或半抗原(例如異硫氰酸熒光素)主動免疫的過程而誘導(dǎo)的應(yīng)答。主動免疫包括多次注射正常免疫接種方案計劃之外的非天然抗原或半抗原，以誘導(dǎo)新的免疫。體液應(yīng)答也可以由先天性免疫而產(chǎn)生，其中宿主動物具有天然的現(xiàn)有免疫，例如針對α -半乳糖基的免疫?；蛘?，可以通過將例如從血清收集的天然抗體或可以是或不是遺傳工程抗體(包括人源化抗體)的單克隆抗體的抗體給予宿主動物，建立被動免疫。用特定量的抗體試劑產(chǎn)生被動免疫，并且應(yīng)用其中被動給予的抗體針對所述免疫原的配體-免疫原綴合物，將提供針對其它潛在抗原的患者現(xiàn)有抗體效價并非治療上有用時使用的一組標準試劑的優(yōu)勢。被動給予的抗體可以與所述配體-免疫原綴合物“共同給予”，共同給予定義為在給予所述配體-免疫原綴合物之前、同時或之后給予抗體。設(shè)想了所述現(xiàn)有的抗體、誘導(dǎo)的抗體、或被動給予的抗體將會通過使所述配體-免疫原綴合物優(yōu)先結(jié)合所述腫瘤細胞或感染性生物而再導(dǎo)向這些侵入性細胞或生物，從而通過補體介導(dǎo)的裂解、ADCC、抗體依賴性吞噬作用或受體的抗體聚集殺傷所述致病細胞。細胞毒性過程也可能涉及其它免疫應(yīng)答類型例如細胞介導(dǎo)的免疫、以及當被吸引的抗原呈遞細胞吞噬所述不想要的細胞時產(chǎn)生的并且將天然腫瘤抗原或外源病原體抗原傳遞給免疫系統(tǒng)以消除帶有所抗原的細胞或生物的再次應(yīng)答。可以將包含治療因子的至少一種另外的組合物聯(lián)合給予宿主，或者作為以上詳述的方法的佐劑給予宿主，以增強致病細胞群體的內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除，或者可以給予不止一種另外的治療因子。所述治療因子可以選自能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物、化療藥、抗微生物藥或能夠補償所給予的配體-免疫原復(fù)合體的功效的其它治療因子。本發(fā)明的方法可以通過下述方法進行除給予上述綴合物之外，將能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的包括但不限于以下的因子的化合物或組合物給予宿主細胞因子或免疫細胞生長因子，例如白介素 1-18、干細胞生長因子、堿性 FGF、EGF、G-CSF, GM-CSF, FLK-2 配體、HILDA、MIP-I α、TGFa、TGFP、M_CSF、IFNa , IFN β , IFNy、可溶性 CD23、LIF 和它們的組合。
也可以使用這些細胞因子的治療有效組合。在一個優(yōu)選實施方案中，例如將治療有效量例如約5000IU/劑/天至約500，OOOIU/劑/天范圍的量(以每日多劑量的方案)的IL-2和有效量例如約7500IU/劑/天至約150，000IU/劑/天范圍的量(以每日多劑量的方案給予)的IFN-α與葉酸連接的異硫氰酸熒光素一起使用，以消除帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)的這類細胞群體。在另一優(yōu)選實施方案中，使用治療有效量的IL-12和IFN-α，在再一優(yōu)選實施方案中，使用治療有效量的IL-15和IFN-α。在一個替代的優(yōu)選實施方案中，聯(lián)合應(yīng)用IL-2、IFN-a或IFN-Y和GM-CSF。最好是，所用的治療因子例如IL-2、IL-12、IL-15、IFN- a、IFN- Y和GM-CSF (包括其組合)激活天然殺傷細胞和/或T細胞。或者，所述治療因子或其組合(包括白介素與干擾素和GM-CSF組合)可以激活其它免疫效應(yīng)細胞，例如巨噬細胞、B細胞、嗜中性粒細胞、LAK細胞等。本發(fā)明也考慮了應(yīng)用細胞因子的任何其它有效組合，包括其它白介素和干擾素和集落刺激因子的組合。本身有細胞毒性并且可以用來增強腫瘤滲透性、適用于本發(fā)明方法的化療藥包括腎上腺類皮質(zhì)激素、烷化劑、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、雌激素、抗代謝物例如阿糖胞苷、嘌呤類似物、嘧啶類似物和氨甲蝶呤、白消安、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬和其它鉬化合物、他莫昔芬、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、植物生物堿、潑尼松、羥基脲、替尼泊苷、抗生素例如絲裂霉素C 和博來霉素、氮芥、nitrosureas、長春新堿、長春堿、炎性因子和促炎因子、以及本領(lǐng)域熟知的任何其它化療藥?？梢宰鳛榻o予本發(fā)明綴合物輔助給予的其它治療藥包括青霉素、頭孢菌素、萬古霉素、紅霉素、克林霉素、利福平、氣霉素、氣基糖昔、慶大霉素、兩性霉素B、阿昔洛韋、曲氟尿苷、更昔洛韋、齊多夫定、金剛烷胺、利巴韋林和本領(lǐng)域熟知的任何其它抗微生物化合物。致病細胞群體的消除將包括腫瘤塊或致病生物的減少或消除，產(chǎn)生治療反應(yīng)。就腫瘤而言，所述消除可以是消除原發(fā)性腫瘤細胞或已經(jīng)轉(zhuǎn)移或在與原發(fā)性腫瘤分離過程中的細胞。按照本發(fā)明，也考慮了防止腫瘤在通過任何治療方法(包括手術(shù)除去腫瘤、放射療法、化學(xué)療法或生物療法)除去后復(fù)發(fā)的預(yù)防性治療。所述預(yù)防性治療可以是用所述配體-免疫原綴合物的初次治療(例如以每日多劑量的方案)和/或可以是另外的治療或初次治療后間隔數(shù)天或數(shù)月后的系列治療。本發(fā)明也涉及藥用組合物，所述藥用組合物包含“標記”宿主動物中致病細胞群體有效量的配體-免疫原綴合物，以通過內(nèi)源免疫應(yīng)答或通過共同給予的抗體進行特異性消除。所述組合物還包含增強所述致病細胞消除有效量的另外的因子，所述另外的因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。所述藥用組合物含有治療有效量的所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子，所述因子可以包括細胞因子例如IL-2、IL-12或IL-15或細胞因子包括IL_2、IL-12或IL-15和干擾素例如IFN-α或IFN- Y的組合、以及干擾素、白介素和集落刺激因子例如GM-CSF的組合。所述配體-免疫原綴合物的單位日劑量可以根據(jù)宿主的身體狀況、待治療的病癥、所述綴合物的分子量、其給藥途徑和組織分布、以及共同使用其它治療性治療(例如放射療法)的可能性而大大改變。給予患者的有效量基于體表面積、患者體重和醫(yī)師對患者病癥的評價。有效量可以在約lng/kg至約lmg/kg、更優(yōu)選在約I μ g/kg至約500 μ g/kg、最優(yōu)選在約I P g/kg至約100 μ g/kg范圍內(nèi)變動。
給予所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子以將現(xiàn)有抗體重新導(dǎo)向腫瘤細胞或感染性生物或誘導(dǎo)針對所述免疫原的體液應(yīng)答的任何有效方案都可以使用。例如，可以將所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子作為一劑給予，或者可以將它們分開以每日多劑方案給予。此外，可以使用一種交錯的方案例如每周1-3天作為每日治療的替代方案，為了限定本發(fā)明，這類間歇性或交錯的每日方案被認為是每日治療的等同方案，認為在本發(fā)明范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述宿主用多次注射所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子來治療，以消除致病細胞群體。在一個實施方案中，給所述宿主注射多次(最好約2次多至約50次)所述配體-免疫原綴合物，例如以12-72小時間隔或以48-72小時間隔注射。在初次注射后，以數(shù)天或數(shù)月的間隔給予所述患者額外的所述配體-免疫原綴合物的注射，所述額外注射防止疾病復(fù)發(fā)?；蛘?，初次注射所述配體-免疫原綴合物可以防止疾病復(fù)發(fā)。可以在給予所述配體-免疫原綴合物之前、之后或同時給予所述宿主動物所述治療因子，所述治療因子可以作為含有所述綴合物的同一組合物的部分給予，或者作為不同于所述配體-免疫原綴合物的組合物的部分給予。任何這類含有治療有效量的所述治療因子的組合物都可以用于本發(fā)明。另外，可以使用不止一種類型的配體-免疫原綴合物。例如，宿主動物可以用異硫氰酸熒光素和二硝基苯基預(yù)先免疫，隨后用與相同或不同配體連 接的異硫氰酸熒光素和二硝基苯基用一個共同給藥方案中來治療。就化療藥和抗微生物藥而論，所述治療因子可以以亞適劑量與所述配體-免疫原綴合物在一個聯(lián)合療法中一起給予，以避免所述宿主動物產(chǎn)生針對所述化療藥或抗微生物藥的抗性。所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子最好胃腸外注射，這種注射可以是腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射或鞘內(nèi)注射。所述配體-免疫原綴合物和所述治療因子也可以采用慢速泵給予。胃腸外劑型的實例包括所述活性劑在等滲鹽水、5%葡萄糖或其它眾所周知的藥學(xué)上可接受的液體載體(例如液體乙醇、二醇、酯和酰胺)中的水溶液。按照本發(fā)明的胃腸外劑型可以為可重建凍干制劑的形式，包含所述劑量的配體-免疫原綴合物和治療因子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，可以給予任何數(shù)目的本領(lǐng)域已知的緩釋劑型，例如美國專利第4，713，249,5, 266，333和5，417，982號中描述的生物可降解糖類基質(zhì)，所述文獻的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
具體實施例方式實施例I葉酸-異硫氰酸熒光素綴合物對帶有肺部腫瘤移植物的小鼠存活的影響將6-8周齡( 20-22克)雌性Balb/c小鼠用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的牛血清白蛋白(BSA)、利用市售佐劑(例如弗氏佐劑Titer Max -Gold)在多個部位皮下免疫。確定所有小鼠體內(nèi)抗FITC抗體效價高(通過小鼠血清樣品的ELISA測定結(jié)果來證明)之后，給每只動物腹膜內(nèi)注射5X105M109細胞，這是一種表達高水平葉酸受體的同源肺癌細胞系。癌癥病灶附著(attach)并生長。移植癌細胞后4天和7天時，給所有動物腹膜內(nèi)注射或者磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或者特定量的通過Y羧基連接的乙二胺橋與葉酸綴合的FITC0葉酸-FITC的注射濃度為O (PBS對照)、4· 5、45、450和4500nmole/kg,每種葉酸-FITC濃度注射8只小鼠，總共注射40只小鼠。然后給予所有小鼠一系列5個5000IU重組人IL-2的每日注射(第8天至第12天)，以刺激免疫系統(tǒng)。然后，通過監(jiān)測與對照動物相比葉酸-FITC治療的小鼠隨時間而變的存活率，評估這種免疫療法的功效。如圖I所示，用葉酸-FITC治療的小鼠的平均存活是劑量依賴性的，而對照小鼠表現(xiàn)出腫瘤移植后平均存活23天，而葉酸-FITC小鼠隨所述綴合物劑量的增加存活越來越長。低至45nmole/kg的葉酸-FITC能夠促進小鼠的長期存活，而較高劑量成比例地更為有效。雖然發(fā)現(xiàn)所述葉酸-FITC在腫瘤中濃縮，但在腎組織中存在一些葉酸-FITC (但與其它正常組織中的水平不相當)。有證書的獸醫(yī)學(xué)病理學(xué)家在尸體剖檢中沒有檢測到腎毒性或正常器官的毒性。實施例2用與異硫氰酸熒光素綴合的葉酸使正常組織與腫瘤組織成像所述方法與實施例I中所述方法相似，只是給動物注射24JK-FBP腫瘤細胞，在注射葉酸-FITC后不久處死小鼠，將組織制作薄切片，用聚焦熒光顯微鏡術(shù)通過FITC免疫熒 光進行檢查，以將葉酸-FITC定位于特定的組織，包括腫瘤、腎、肝和肌肉組織。圖2顯示了作為對照的各種組織薄切片的相差顯微照片以及熒光顯微照片。發(fā)現(xiàn)葉酸-FITC特異性地定位于腫瘤組織和葉酸受體特別豐富的腎近端小管細胞中。實施例3用與異硫氰酸熒光素綴合的葉酸或藻紅蛋白標記的山羊抗小鼠IgG使腫瘤組織成像所述方法與實施例2中所述方法相似，只是使用M109細胞，通過FITC熒光(綠色圖象)和藻紅蛋白(PE)熒光(紅色圖象)檢查組織。對于PE熒光，將所述熒光標記與山羊抗小鼠IgG抗體連接，以用于檢測內(nèi)源小鼠抗FITC抗體與葉酸-FITC綴合物的結(jié)合，所述綴合物在腫瘤細胞上積累。比較葉酸-FITC治療的腫瘤組織和未經(jīng)治療的腫瘤組織，也通過相差顯微鏡術(shù)，如實施例2中所述，檢查兩種類型的樣品。FITC熒光證明葉酸定位于腫瘤組織(圖3)。PE熒光證明與葉酸-FITC綴合物結(jié)合的內(nèi)源小鼠抗FITC抗體定位于腫瘤細胞。其它研究(未顯示)證明缺乏這類IgG與正常組織包括腎的結(jié)合。沒有抗體與位于腎組織的葉酸-FITC結(jié)合是因為這樣一個事實如果葉酸受體在腎近端小管細胞的頂部膜上，貝1J抗體不能接觸腎的該區(qū)域。相差圖象(透射圖象(transmitted image))顯示了經(jīng)治療和未經(jīng)治療的腫瘤組織的形態(tài)，顯示出經(jīng)治療樣品中的細胞死亡。實施例4葉酸異硫氰酸熒光素綴合物對實體瘤生長的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在用FITC預(yù)先免疫后每只動物在肩部皮下注射I X 106M109細胞(第0天)。腫瘤細胞移植后用葉酸-FITC的免疫包括1500nmol/kg葉酸-FITC，以48小時間隔以6個腹膜內(nèi)劑量給予(第7、9、11、13、15和17天)。測量所得的肩部實體瘤，測定腫瘤大小增加的百分率。圖4所示的腫瘤生長曲線表明，當動物用葉酸-FITC與IL-2聯(lián)合治療時，實體瘤的生長顯著受到抑制。實施例5細胞因子聯(lián)合治療的效應(yīng)所述方法與實施例I中所述方法相似，只是動物通過在腫瘤細胞移植后第4天和第7天注射2劑1500nmol/kg葉酸-FITC或氨基熒光素后，5次每日注射(第8天至第12天)5000IU重組人IL-2與或者IFN- a (5次每日注射2. 5 X IO4U/天)、IL-12 (5次每日注射0.5iig/天)或TNF-a (于第8、10和12天3次每日注射2 y g/天)來治療。此外，為了減少獲得長期存活數(shù)據(jù)所需的時間，將腫瘤細胞腹膜內(nèi)移植到肝附近。因此，與實施例I中所示的小鼠相比，有腫瘤小鼠的壽命一般縮短。圖5所示的結(jié)果證明，單獨的IL-2在促進動物長期存活方面比用IL-2和IL-12或用IL-2和TNF-a聯(lián)合治療更為有效。相反，用IL-2和IFN-a聯(lián)合治療在促進長期存活方面比單獨的IL-2更為有效。注射氨基熒光素與各種細胞因子組合作為對照，因為該化合物不與葉酸結(jié)合，并且不會使抗熒光素抗體再靶向腫瘤細胞。實施例6
多次注射葉酸異硫氰酸熒光素綴合物的效應(yīng)所述方法與實施例I中所述方法相似，只是以48小時的間隔，給動物腹膜內(nèi)注射，6次每日注射(腫瘤細胞移植后第7、9、11、13、15和17天)1500nmol/kg葉酸-FITC。結(jié)果表明(圖6)，與于腫瘤細胞移植后第4天和第7天2次注射葉酸-FITC相比，多次注射葉酸-FITC改進用葉酸-FITC和IL-2治療的動物的長期存活。實施例7葉酸異硫氰酸熒光素綴合物和IL-2的協(xié)同效應(yīng)所述方法與實施例I中所述方法相似，只是給動物注射1500nmole/kg葉酸-FITC，某些動物或者用單獨的葉酸FITC或者單獨的IL-2治療。此外，如實施例5中所述，腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞。進行該實驗(參見圖7)以確定葉酸-FITC和IL-2是否協(xié)同起作用，以促進有腫瘤小鼠的長期存活。對照組(n = 8)以及用IL-2、葉酸-FITC或葉酸-FITC+IL-2治療的組(n = 8)的平均存活時間分別為18天、19天、22天和42天。圖7所示結(jié)果表明，葉酸-FITC和IL-2促進有腫瘤小鼠的長期存活的能力是強協(xié)同的，單獨的低劑量的IL-2在缺乏葉酸-FITC時對所述小鼠的存活效應(yīng)可忽略，葉酸-FITC僅有微小的效應(yīng)。實施例8NK細胞與葉酸異硫氰酸熒光素綴合物和IL-2的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)所述方法與實施例7中所述方法相似，只是一組動物用多克隆兔子抗小鼠NK細胞抗體(抗脫唾液酸 GMl ；ffako Pure Chemical Industries, Ltd.，Richmond, Va.)與葉酸-FITC和IL-2聯(lián)合治療。每只小鼠于腫瘤移植后第1、4、9和14天注射0.2ml抗體儲備液的I : 10稀釋液，以達到耗竭NK細胞。對照組和用葉酸-FITC+IL-2或葉酸-FITC+IL-2+ a -NK Ab治療組的平均存活時間分別為18天、42天和18. 5天。圖8所示的結(jié)果表明，NK細胞介導(dǎo)用葉酸-FITC和IL-2聯(lián)合治療引起的有腫瘤小鼠長期存活的協(xié)同增強。實施例9抗M109腫瘤細胞的細胞免疫的產(chǎn)生所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天給動物注射PBS (對照)或共同注射葉酸-FITC (1500nmole/kg)、IL-2 (250, OOOIU/ 劑)和 IFN-a (25，000U/ 劑)。另外，通過在初始腫瘤細胞移植后第62天注射5X 105M109細胞，在初始腫瘤細胞移植后第96天注射I. 5 X 106M109細胞，或在初始腫瘤細胞移植后第127天注射2. 5 X IO5Line I細胞(一種Balb/c自發(fā)肺癌)，來攻擊動物。如圖9所示，注射5X105M109細胞的對照小鼠的平均存活時間為18. 5天。注射
1.5X106M109細胞的對照小鼠的平均存活時間為18天。注射2. 5X IO5Line I細胞的對照小鼠的平均存活時間為23. 5天。注射5X105M109細胞、用葉酸-FITC與IL-2和IFN-a聯(lián)合治療、第62天用5X 105M109細胞攻擊、第96天用I. 5X106M109細胞攻擊、以及第127天用2. 5 X IO5Line I細胞攻擊的小鼠的平均存活時間超過192天。圖9所示結(jié)果表明，在用葉酸-FITC與IL-2和IFN-a聯(lián)合治療的動物中產(chǎn)生長期持續(xù)的細胞類型特異性細胞免疫。這種長期持續(xù)的免疫保護移植有M109細胞并接受葉酸靶向的免疫療法的動物以免在通過隨后注射M109細胞攻擊時疾病復(fù)發(fā)。在最后一次用Line I細胞攻擊后，在這些動物中的存活時間可能是因為在Line I細胞上存在的葉酸受體水平低于M109細胞上存在的受體，并且因為在M109細胞和Line I細胞之間存在共享的腫瘤抗原，引起能夠與Line I細胞交叉反應(yīng)的M109特異性細胞免疫應(yīng)答。 實施例10IL-2劑量對用葉酸-異硫氰酸熒光素綴合物治療小鼠存活的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且動物在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天用PBS(對照)治療，或給動物共同注射葉酸-FITC (1500nmole/kg)和 5 X IO3IU (I X)、0. 5 X IO5IU (10 X)、
2.5 X IO5IU (50 X)或5 X IO5IU (100 X)劑量的IL-2。另外，動物用FITC標記的匙孔賊血藍蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC標記的BSA免疫。如

圖10所示，移植有M109細胞并用葉酸-FITC治療的小鼠的平均存活時間當IL-2的劑量增加至高于5X IO3IU IL-2劑量時增力口。相反，在對照小鼠(注射M109細胞并用PBS治療的小鼠)和僅用IL-2治療的小鼠的平均存活時間之間沒有實質(zhì)上的差異。實施例11IFN-a增強用葉酸-異硫氰酸熒光素綴合物和IL_2治療小鼠的存活所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天動物用PBS(對照)治療，或給動物共同注射葉酸-FITC (1500nmole/kg)和 IL-2 (5000IU/劑)或葉酸-FITC (1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/劑)和IFN-a (25，000U/劑)。給另外一組小鼠共同注射葉酸-FITC、IL-2和IFN-a，但動物不用BSA-FITC預(yù)先免疫。圖11顯示，用PBS治療的對照小鼠的平均存活時間為18. 5天，共同注射葉酸-FITC和IL-2的小鼠的平均存活時間為20. 5天，共同注射葉酸-FITC、IL-2和IFN- a的小鼠的平均存活時間超過60天，而共同注射葉酸-FITC、IL-2和IFN-a、但沒有預(yù)先免疫的小鼠的平均存活時間為24. 3天。注射葉酸-FITC和IL-2的小鼠的平均存活時間與對照小鼠沒有實質(zhì)上的差異，因為給所述小鼠注射5000IU的IL-2，如實施例10中所述，采用第7、8、9、11和14天的方案，增加用葉酸-FITC治療小鼠的平均存活時間需要高于5000IU的IL-2劑量。圖11所示的結(jié)果表明，IFN-a進一步增強由于用葉酸-FITC和IL-2治療移植有腫瘤細胞的小鼠而發(fā)生的平均存活時間的增加。實施例12⑶8+T細胞耗竭對葉酸靶向免疫療法的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天動物用PBS (對照)治療，或給動物共同注射葉酸-FITC(1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/劑)和 IFN-a (25，OOOU/劑)。給另外一組小鼠共同注射氨基熒光素(1500nmole/kg)、IL-2和IFN-a或共同注射葉酸-FITC、IL-2,IFN-a和抗⑶8+T細胞抗體(以腹水的形式，并且在第2、3、7、11和15天給予)。如圖12所示，抗⑶8+T細胞抗體抑制用葉酸-FITC、IL-2和IFN-a治療小鼠的平均存活時間的增加，表明CD8+T細胞在通過葉酸靶向免疫療法激活細胞免疫應(yīng)答中起作用。注射氨基熒光素以及IL-2、IFN-a細胞因子組合作為對照，因為該化合物不與葉酸結(jié)合，并且不會將抗熒光素抗體再導(dǎo)向腫瘤細胞。圖12顯示，氨基熒光素與IL-2和IFN-a —起的效力在增加移植有M109細胞的小鼠平均存活時間方面比葉酸-FITC、IL-2和IFN-a低得多。實施例13GM-CSF對IL_2和IFN- a增強的葉酸靶向免疫療法的增大效應(yīng)
所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞。另外，如圖13所示，給動物注射多種細胞因子，包括IL-2(5000IU/劑)、IFN-a (25，000U/劑)和GM-CSF(3000IU/劑)。在移植M109細胞并且隨后在第4天和第7天注射2劑1500nmole/kg葉酸-FITC后，于第8天至第12天以一系列5次每日注射共同注射所述細胞因子。圖13所示結(jié)果表明，用PBS治療小鼠的平均存活時間為19天，注射IL-2、IFN-a和GM-CSF但無葉酸-FITC的小鼠的平均存活時間為22天，注射葉酸-FITC、IL-2和IFN- a的小鼠的平均存活時間為38天，而注射葉酸-FITC、IL_2、IFN- a和GM-CSF的小鼠的平均存活時間超過57. 5天。結(jié)果表明，GM-CSF在也用IL-2和IFN-a治療的小鼠中進一步增進葉酸靶向的腫瘤細胞殺傷。注射PBS、IL-2、IFN-a和GM-CSF的小鼠的平均存活時間與對照小鼠沒有顯著差異，表明利用葉酸-FITC靶向腫瘤特異性免疫應(yīng)答的重要性。實施例14IFN-a劑量對用葉酸-異硫氰酸熒光素綴合物治療小鼠存活的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且動物用PBS(對照)治療，或給動物共同注射葉酸-FITC(1500nmole/kg)和 I. 5 X IO5IU/ 劑(6X)、7. 5X IO4IU/ 劑(3 X )、2. 5 X IO4IU/ 劑(IX)或和
7.5X IO3IU(0. 3X)劑量的IFN-a。另外，動物用FITC標記的匙孔M血藍蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC標記的BSA免疫，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天給動物注射葉酸-FITC和IFN-a。如圖14所示，移植有M109細胞并用葉酸-FITC治療的小鼠的平均存活時間當IFN-a的劑量增加至高于0. 8X IO4IU/劑的IFN-a劑量時增加。實施例15二硝基苯基作為免疫原對葉酸靶向免疫療法的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天動物用PBS (對照)治療，或給動物共同注射二硝基苯基(DNP) (1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/劑 / 天)和 IFN-a (2. 5X IO4單位/天)或共同注射葉酸-二硝基苯基(DNP) (1500nmole/kg)、IL-2(5000IU/劑/天)和IFN-a (2.5X104單位/天)。另外，動物用DNP標記的匙孔賊.血藍蛋白(KLH)免疫。如圖15所示，與對照小鼠(用PBS治療)或用DNP、IL-2和IFN- a治療小鼠相比，用葉酸-DNP、IL-2和IFN-a治療小鼠的平均存活時間增加。因此，DNP也是用于葉酸靶向免疫療法中的一種有效的免疫原。實施例16葉酸異硫氰酸熒光素綴合物和IFN-a的協(xié)同效應(yīng)所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天動物用PBS (對照)、單獨的IFN-a (7. 5X104單位/劑)或單獨的葉酸FITC(1500nmole/kg)治療，或者給動物共同注射葉酸FITC (1500nmole/kg)和IFN-a (7. 5 X IO4單位/劑)。另外，動物(每組5只小鼠)用FITC標記的匙孔賊.血藍蛋白(KLH)免疫，而不是用FITC標記的BSA免疫。如圖16所示，用PBS (對照)、IFN- a、葉酸-FITC或葉酸-FITC+IFN- a治療組的平均存活時間分別為17天、17天、23天和33天。這些結(jié)果表明，IFN-a同IL-2—樣，與葉酸-FITC協(xié)同作用，促進有腫瘤小鼠的長期存活。 實施例17二硝基苯基作為免疫原和高濃度的細胞因子對小鼠長期存活的影響所述方法與實施例I中所述方法相似，只是在實施例5中所述的位置腹膜內(nèi)移植所述腫瘤細胞，并且在腫瘤細胞移植后第7、8、9、11和14天動物用PBS(對照)治療，或給動物共同注射PBS、IL-2(2.5X105單位/天)和IFN-a (7. 5X IO4單位/天)或共同注射葉酸-二硝基苯基(DNP) (1500nmole/kg)、IL-2 (2. 5 X IO5 單位 / 天)和 IFN- a (7. 5 X IO4單位/天)。另外，動物用DNP標記的匙孔賊血藍蛋白(KLH)免疫。如圖17所示，與對照小鼠(用PBS治療)或用PBS、IL-2和IFN- a治療小鼠相比，用葉酸-DNP、IL-2和IFN- a治療小鼠的平均存活時間增加。用葉酸-DNP、11-2和正^[1 (11-2和正^[1的濃度分別為2. 5X IO5單位/天和7. 5X IO4單位/天)治療的小鼠被完全治愈。
權(quán)利要求
1.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述細胞群體的成員具有配體可及的結(jié)合部位，所述方法包括下述步驟給予所述宿主 一種配體-免疫原綴合物組合物,所述組合物包含所述配體和一種免疫原的復(fù)合物，其中已知所述免疫原被所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源抗體或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原直接被所述宿主體內(nèi)的免疫細胞所識別；和 至少一種另外的組合物，所述組合物包含一種治療因子，所述治療因子選自細胞殺傷齊U、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述致病細胞群體是一種癌細胞群體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述癌細胞群體是致瘤性的。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述致病細胞群體是一種外源病原體或帶有外源病原體的內(nèi)源細胞群體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述外源病原體選自細菌、真菌、病毒、支原體和寄生蟲。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體是能夠與細胞膜受體特異性結(jié)合的維生素。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述配體選自葉酸和其它葉酸受體結(jié)合配體。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體通過包括共價鍵、離子鍵或氫鍵的鍵合與所述免疫原化學(xué)上復(fù)合(complex)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述配體是具有僅通過所述配體的谷氨酰Y-羧基部分與所述免疫原共價連接的一個谷氨酰部分的葉酸類似物。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述配體是具有僅通過所述配體的谷氨酰α-羧基部分與所述免疫原共價連接的一個谷氨酰部分的葉酸類以物。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述免疫原和所述配體之間的共價連接是與所述免疫原直接共價連接或通過一個二價接頭的共價連接。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體是能夠結(jié)合受體的小有機分子，并且其中所述受體在所述致病細胞群體表面優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述小有機分子是一種抗微生物藥。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體是內(nèi)酰胺抗生素。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體結(jié)合部位是一種在轉(zhuǎn)移性癌細胞上優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達的抗原。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述配體結(jié)合部位是EphA2。
17.權(quán)利要求I的方法，其中所述免疫原是分子量低于20，000道爾頓的有機分子。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述有機分子是熒光素或二硝基苯基。
19.權(quán)利要求I的方法，其中所述免疫原是α-半乳糖基。
20.權(quán)利要求I的方法，其中所述抗體對于所述宿主而言是外源的，并且將所述抗體與所述綴合物組合物共同給予。
21.權(quán)利要求I的方法，其中所述治療因子包括細胞因子。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組合。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組合與IFN-α或IFN-Y的聯(lián)合。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組合與IFN- α或IFN- Y或其組合、和GM-CSF的聯(lián)合。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療因子包括至少一種NK細胞或T細胞刺激物。
26.權(quán)利要求I的方法，其中所述配體-免疫原綴合物組合物以多次注射給予。
27.權(quán)利要求I的方法，其中所述宿主動物已經(jīng)預(yù)先天然接觸了所述免疫原，使得所述宿主動物通過存在針對所述免疫原的內(nèi)源抗體證明、具有針對所述免疫原的現(xiàn)有免疫。
28.權(quán)利要求I的方法，其中所述宿主動物已經(jīng)預(yù)先通過非天然過程接觸了所述免疫原，導(dǎo)致引發(fā)所述宿主動物針對所述免疫原的免疫應(yīng)答。
29.權(quán)利要求28的方法，其中導(dǎo)致引發(fā)所述動物免疫應(yīng)答的所述非天然過程是接種疫苗。
30.權(quán)利要求28的方法，其中導(dǎo)致引發(fā)所述免疫應(yīng)答的所述非天然過程是主動免疫。
31.權(quán)利要求I的方法，其中所述內(nèi)源免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述體液應(yīng)答是一種獲得性免疫應(yīng)答。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述體液應(yīng)答是一種先天性免疫應(yīng)答。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述獲得性應(yīng)答通過給予所述宿主動物一種疫苗組合物而被誘導(dǎo)。
35.權(quán)利要求I的方法，其中所述內(nèi)源免疫應(yīng)答包括細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
36.權(quán)利要求I的方法，其中所述內(nèi)源免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
37.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述群體表達配體的結(jié)合部位，所述方法包括下述步驟 給予所述宿主一種包含所述配體和一種免疫原的復(fù)合物的組合物； 給予所述宿主針對所述免疫原的抗體；和 給予所述宿主至少一種另外的治療因子，所述治療因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和不與所述配體-免疫原復(fù)合物結(jié)合的內(nèi)源免疫應(yīng)答的刺激物。
38.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體，所述方法包括下述步驟給予所述宿主 一種組合物，所述組合物包含免疫原和配體的共價連接綴合物，其中已知所述免疫原被所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源抗體或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原直接被所述宿主體內(nèi)的免疫細胞所識別； 所述配體包括具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中與所述免疫原的共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的Y-羧基。
39.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體的結(jié)合部位，所述方法包括下述步驟給予所述宿主 一種組合物，所述組合物包含免疫原和配體的共價連接綴合物，其中已知所述免疫原被所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源抗體或外源抗體所識別，或者已知所述免疫原直接被所述宿主體內(nèi)的免疫細胞所識別； 所述配體包括具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中與所述免疫原的共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的α-羧基。
40.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體的結(jié)合部位，所述方法包括下述步驟給予所述宿主 一種組合物，所述組合物包含免疫原的共價連接綴合物，其中已知所述免疫原被所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源抗體或外源抗體所識別,或者已知所述免疫原直接被所述宿主體內(nèi)的免疫細胞所識別； 一種配體，所述配體包括具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中所述共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的Y -羧基；和 至少一種另外的包含治療因子的組合物，所述治療因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。
41.一種在帶有致病細胞群體的宿主動物體內(nèi)增強內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的特異性消除所述群體的方法，其中所述群體優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達葉酸受體，所述方法包括下述步驟給予所述宿主 一種組合物，所述組合物包含免疫原的共價連接綴合物，其中已知所述免疫原被所述宿主體內(nèi)的內(nèi)源抗體或外源抗體所識別,或者已知所述免疫原直接被所述宿主體內(nèi)的免疫細胞所識別； 一種配體，所述配體包括具有谷氨?；鶊F的葉酸或葉酸類似物，其中所述共價連接僅通過所述谷氨?；鶊F的α -羧基；和 至少一種另外的包含治療因子的組合物，所述治療因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。
42.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含治療有效量的配體-免疫原綴合物，所述配體-免疫原綴合物能夠與宿主動物體內(nèi)的致病細胞群體特異性地結(jié)合，以通過獲得性或先天性免疫應(yīng)答、共同給予的抗體或通過所述宿主體內(nèi)的免疫細胞直接特異性地消除所述細胞；一種治療因子，所述治療因子選自細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合；和一種其藥學(xué)上可接受的載體。
43.權(quán)利要求42的藥用組合物，所述藥用組合物為胃腸外緩釋劑型。
44.權(quán)利要求42的藥用組合物，其中所述治療因子是一種免疫刺激物。
45.權(quán)利要求44的藥用組合物，其中所述免疫刺激物包含選自以下的化合物或其組合IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-γ 和 GM—CSF。
全文摘要
提供了用于增強宿主動物體內(nèi)內(nèi)源免疫應(yīng)答介導(dǎo)的消除致病細胞群體的方法和藥用組合物，其中所述致病細胞優(yōu)先表達、獨特表達或過量表達特定配體的結(jié)合部位。本發(fā)明包括將與免疫原綴合的所述配體給予帶有所述致病細胞群體的宿主動物。所述宿主動物體內(nèi)的現(xiàn)有抗體或者給予所述宿主動物以建立針對所述免疫原的被動免疫的抗體，與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合，導(dǎo)致通過所述宿主的免疫應(yīng)答消除所述致病細胞。給予至少一種選自以下的另外的治療因子細胞殺傷劑、腫瘤滲透增強劑、化療藥、抗微生物藥、細胞毒性免疫細胞和能夠刺激內(nèi)源免疫應(yīng)答的化合物，其中所述化合物不與所述配體-免疫原綴合物結(jié)合。
文檔編號A61P31/12GK102805868SQ201210241198
公開日2012年12月5日 申請日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者P·S·羅, Y·盧 申請人:普渡研究基金會