專利名稱：殼聚糖作為免疫佐劑在制備小鼠過敏性哮喘模型中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及過敏性哮喘模型，尤其涉及殼聚糖作為免疫佐劑在制備小鼠過敏性哮喘模型中的用途。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘(哮喘)是臨床常見病和多發(fā)病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。哮喘是一種由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其主要表現(xiàn)是氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限及粘液高分泌，晚期還可出現(xiàn)氣道重塑。其發(fā)病機制尚未完全闡明。目前認為，Th2細胞的過度活化導致了 Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多，最終導致嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在氣道聚集，引起氣道炎癥。鑒于人體試驗的局限性，目前對哮喘病因、發(fā)病機制及治療等方面的研究很大程度上需要通過動物模型來進行，建立良好的支氣管哮喘動物模型具有重要意義。哮喘小鼠模型的主要特征是氣道反應(yīng)性增高，氣道以嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，氣道粘性分泌物明顯增多，血清IgE水平增高，支氣管肺泡灌洗液中Th2細胞因子水平增高等?，F(xiàn)有的較為成熟的哮喘小鼠模型有如下特點抗原系統(tǒng)致敏和局部激發(fā)相結(jié)合，致敏時需合用免疫佐劑，多采用腹腔注射、皮下注射或者兩者結(jié)合，以單獨腹腔注射最常見，激發(fā)采用霧化吸入、滴鼻甚至氣管內(nèi)滴注等方式，以霧化吸入最常用。國內(nèi)外最常用的哮喘模型為以液態(tài)氫氧化鋁凝膠為佐劑的雞卵白蛋白(OVA)進行致敏構(gòu)建小鼠哮喘模型，多采用腹腔注射致敏，能建立顯著的嗜酸性氣道炎癥。氫氧化鋁作為免疫佐劑輔助OVA抗原進行致敏的機制尚未完全闡明。目前認為，氫氧化鋁佐劑主要功能為緩釋，但同時具有對免疫細胞的激活作用，將蛋白質(zhì)和氫氧化鋁混合注射，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。氫氧化鋁凝膠對蛋白質(zhì)分子具有很好的吸附作用，對促進抗原的吸收具有重要作用。大量的臨床免疫試驗認為氫氧化鋁膠體佐劑對Th2介導的體液免疫反應(yīng)具有很強的激發(fā)作用，而對Thl介導的細胞免疫反應(yīng)的作用較弱。因此，氫氧化鋁凝膠作為常用的免疫佐劑用于哮喘模型的制備。但是該方法存在兩個問題(I)進ロ的液態(tài)氫氧化鋁凝膠價格昂貴，采用普通的氫氧化鋁溶液作為佐劑效果差，氣道嗜酸性炎癥不明顯；(2)以氫氧化鋁凝膠為佐劑的OVA誘導的哮喘小鼠模型的氣道反應(yīng)性、氣道炎性細胞因子增高不顯著，且不穩(wěn)定，時常會出現(xiàn)與正常小鼠無顯著差異或者差異不顯著，導致模型構(gòu)建失敗，影響治療藥物療效評價。氣道高反應(yīng)性、氣道炎性細胞因子增高是小鼠哮喘模型的重要特征，也是評價哮喘藥物是否有效的關(guān)鍵性指標。因此，建立氣道高反應(yīng)性更顯著更穩(wěn)定、氣道炎癥更顯著的哮喘小鼠模型對哮喘疾病的研究以及治療哮喘藥物的篩選均具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種殼聚糖作為免疫佐劑在制備、小鼠過敏性哮喘模型中的用途。本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖的用途，用于制備過敏性哮喘動物模型的免疫佐齊 。殼聚糖是ー種從甲殼類動物提取制備的生物可降解性多糖，是自然界唯一的帶正電荷的堿性氨基陽離子多糖，無毒，無致突性，毒副作用小。殼聚糖具有以下三個優(yōu)點。第一、殼聚糖促進機體對抗原的吸收、攝取和利用率。殼聚糖溶于弱酸水溶液后具有高粘性且?guī)д姡膳c帶負電荷的大分子物質(zhì)如抗原等蛋白質(zhì)藥物相互作用形成納米微粒，可與細胞膜表面負電荷相互作用粘附在細胞表面，有利于抗原更有效地被細胞內(nèi)吞，而且能保護抗原以及藥物不被體內(nèi)的酸、堿和蛋白酶所破壞，提高機體對抗原的攝取率和利用率。殼聚糖可以粘附至粘膜表面，有利于粘膜對抗原的吸收和攝取。第二、殼聚糖具有緩釋抗原的作用。許多研究均發(fā)現(xiàn)殼聚糖包載蛋白藥物體外可持續(xù)釋放7天以上。我們的研究也發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米微粒包裹的OVA體外釋放可持續(xù)6天以上。第三、殼聚糖具有很強的免疫刺激作用。國外有研究顯示，殼聚糖刺激機體免疫的作用，如激活抗原呈遞細胞，增強遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)和細胞毒性T細胞反應(yīng)。
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本發(fā)明的進ー步目的是提供應(yīng)用殼聚糖為免疫佐劑制備的小鼠過敏性哮喘模型。本發(fā)明所述的小鼠過敏性哮喘模型按以下方法建立，所述方法包括以下步驟I)制備殼聚糖醋酸溶液；2)制備殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液；3)用殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液致敏小鼠；4)對小鼠進行一次或多次呼吸道蛋白溶液霧化吸入激發(fā)，得到過敏性哮喘模型。本發(fā)明實驗中，所述的小鼠為BALB/c小鼠。本發(fā)明實驗中，所述的殼聚糖醋酸溶液制備方法如下將殼聚糖溶于1%醋酸水溶液制備成濃度為I. 5mg/ml殼聚糖醋酸溶液，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 5-5. 7,0. 22 μ m膜過濾。本發(fā)明實驗中，所述殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液通過以下步驟制備在旋渦振蕩條件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液中緩慢加入200 μ g/ml OVA水溶液，并繼續(xù)緩慢加入2. Omg/ml三聚磷酸鈉溶液,使殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比達到10 I。本發(fā)明實驗中，所述OVA水溶液和所述三聚磷酸鈉溶液均通過O. 22 μ m膜過濾。本發(fā)明實驗中，所述致敏小鼠的方法為腹腔注射。本發(fā)明實驗中，對小鼠進行三次呼吸道蛋白溶液空氣壓縮霧化吸入。本發(fā)明實驗中，對小鼠進行呼吸道蛋白溶液霧化吸入毎次35分鐘。本發(fā)明的優(yōu)點在于(I)以殼聚糖為免疫佐劑制備小鼠哮喘模型在氣道嗜酸性炎癥、氣道反應(yīng)性和氣道炎性細胞因子等各個方面均顯著優(yōu)于已有常用佐劑制備的哮喘模型。(2)殼聚糖價格低廉，來源豐富。因此，殼聚糖作為免疫佐劑用于哮喘模型的制備顯著優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑，能克服傳統(tǒng)佐劑制備模型的氣道反應(yīng)性、氣道炎性細胞因子不增高或者增高不顯著的缺點，具有方法簡單，成本低廉、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適用于哮喘的發(fā)病機制、治療藥物篩選及作用機制等多方面的研究。


圖I冗ι聚糖包裹OVA微權(quán)的權(quán)ィ5檢測結(jié)果圖2殼聚糖包裹OVA微粒的透射電鏡3氫氧化鋁凝膠包裹OVA微粒的粒徑檢測結(jié)果圖4氫氧化鋁凝膠包裹OVA微粒的透射電鏡5不同免疫小鼠哮喘模型的肺組織病理
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。一、材料與方法I、建立由殼聚糖佐劑和雞卵白蛋白誘導的小鼠過敏性哮喘模型(模型I)殼聚糖來自青島海匯公司，分子量為10萬道爾頓，脫こ酰度95%。將殼聚糖溶解于I %醋酸水溶液配制為濃度I. 5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5. 5-5. 7，無菌O. 22 μ m膜過濾。在旋渦振蕩條件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的殼聚糖溶液中緩慢加入200 μ g/ml OVA水溶液(無菌O. 22 μ m膜過濾)，靜置約10分鐘后，在旋渦振蕩條件下繼續(xù)緩慢加入2. Omg/ml三聚磷酸鈉溶液(無菌O. 22 μ m膜過濾)使殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比達到10 1，維持振蕩10-20分鐘，靜置I小時后可用于腹腔注射小鼠致敏。納米粒度儀檢測殼聚糖包裹的OVA的納米粒徑和Zeta電位，透射電鏡觀察殼聚糖包裹的OVA的形態(tài)。SPF級BALB/c雄性小鼠，5_6周，在第0、7、14天腹腔注射殼聚糖包裹的OVA溶液，劑量為200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空氣壓縮霧化器霧化吸入IOmg/ml OVA溶液(OVA溶于生理鹽水)激發(fā)小鼠，每天35分鐘。采用同樣的處理方法，以不含 OVA的同樣體積的殼聚糖納米溶液腹腔注射致敏小鼠，以生理鹽水霧化吸入激發(fā)小鼠，作為陰性對照。2、建立由氫氧化鋁凝膠佐劑和雞卵白蛋白誘導的小鼠過敏性哮喘模型(模型2)液態(tài)氫氧化鋁凝膠來自美國Sigma公司。將OVA溶于生理鹽水中，配制濃度為400 μ g/ml的溶液。將400 μ g/ml OVA溶液與氫氧化鋁凝膠以I : 3比例混合，混勻后靜置I小時后可用于腹腔注射小鼠致敏。納米粒度儀檢測吸附OVA氫氧化鋁凝膠的粒徑和Zeta電位，透射電鏡觀察氫氧化鋁凝膠包裹的OVA的形態(tài)。SPF級BALB/c雄性小鼠，5_6周，在第0，7，14天腹腔注射與氫氧化鋁凝膠混合的0VA，劑量為200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空氣壓縮霧化器霧化吸入
IOmg/ml OVA溶液(OVA溶于生理鹽水)激發(fā)小鼠，每天35分鐘。采用同樣的處理方法，以不含OVA的同樣體積的氫氧化鋁凝膠溶液腹腔注射致敏小鼠，以生理鹽水霧化吸入激發(fā)小鼠，作為陰性對照。3、建立由雞卵白蛋白誘導的小鼠過敏性哮喘模型(模型3)將OVA溶于生理鹽水中，配制濃度為100 μ g/ml的溶液?；靹蚝箪o置I小時后可用于腹腔注射小鼠致敏。
SPF級BALB/c雄性小鼠，5-6周，在第O，7，14天腹腔注射OVA溶液，劑量為200 μ I/鼠，即20 μ g OVA/鼠。第28、29、30天采用空氣壓縮霧化器霧化吸入10mg/ml OVA溶液(OVA溶于生理鹽水)激發(fā)小鼠，每天35分鐘。
以上三種模型均于最后一次激發(fā)48小時后，進行模型測試。ニ、指標測定I、氣道反應(yīng)性評價氣道反應(yīng)性包括以下兩個方面I)與哮喘組相比可以顯著降低氣道反應(yīng)性(P < O. 05)的激發(fā)濃度；2)氣道反應(yīng)性升高為基值2倍時的Mch激發(fā)濃度即PClOO，PClOO值越小，氣道敏感性越高。最后一次激發(fā)后48小時，無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠氣道反應(yīng)性。用Buxco小鼠無創(chuàng)肺功能儀檢測氣道阻力，結(jié)果以增強的呼吸間歇(Enhanced Pause,Penh)表示，通過こ酰甲膽堿(Methacholine, Mch)激發(fā)測定各濃度時的Penh值。Mch激發(fā)梯度濃度分別為3. 12、6. 25、12. 5、25、50、100mg/ml。以未吸入藥物時所測Penh值為基值，將各個濃度Penh的百分比(Penh/baseline% ),作為氣道反應(yīng)性統(tǒng)計指標。2、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)以及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞所占比例腹腔注射麻醉小鼠后，切開氣管，插管，PBS O. 8ml/次，灌洗3次，灌洗液回收率>80%。回收BALF，1500r/min離心lOmin，細胞沉淀用Iml PBS重懸，取少許滴于血細胞計數(shù)板，行細胞總數(shù)計數(shù)，算出姆毫升的細胞數(shù)。剩余細胞溶液，1500r/min離心IOmin,棄上清，用50μ1 PBS重懸細胞沉淀后涂片，晾干后行HE染色。油鏡下進行細胞分類計數(shù)，計數(shù)600個細胞，計算嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞各占的百分比。3、肺組織病理檢查取小鼠肺組織放入4%甲醛固定液中固定過夜。常規(guī)取材后，進行梯度酒精脫水，組織透明處理，浸蠟，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察肺組織炎性細胞浸潤，水腫和氣道上皮損傷情況。4、炎性指標:炎性指標為BALF上清細胞因子水平。取BALF上清液，采用ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平，ELISA試劑盒分別購自eBioscience公司和上海依科賽公司，按說明書操作。三、結(jié)果I、殼聚糖包裹0VA、氫氧化鋁包裹OVA的粒徑和Zeta電位檢測、透射電鏡觀察如附圖I和3所示，經(jīng)納米粒度儀檢測，殼聚糖包裹OVA粒徑大小為249. 9nm,多分散度為0. 175, Zeta電位為+22. lmV。氫氧化鋁包裹OVA的粒徑大小為4366nm，多分散度0. 091，Zeta電位為-13. 6mV。由以上結(jié)果可知，殼聚糖包裹OVA的粒徑顯著小于氫氧化鋁包裹0VA。而且殼聚糖包裹OVA納米粒帶正電荷，可與細胞膜表面負電荷通過靜電相互作用，有利于OVA被機體攝取和吸收。圖2和圖4所示透射電鏡圖可見殼聚糖包裹OVA粒徑大小較均一、分布均勻，無明顯凝聚現(xiàn)象，而且包裹OVA的殼聚糖微粒的中心染色更深，表明OVA被包裹在殼聚糖內(nèi)部，而未包裹OVA的殼聚糖微粒粒徑更小，微粒顏色均勻，無深染區(qū)。而氫氧化鋁包裹OVA明顯凝聚成團，導致粒徑増大。2、氣道反應(yīng)性結(jié)果如表I所示，在所有こ酰甲膽堿(Mch)激發(fā)濃度下，以殼聚糖為佐劑的哮喘組氣道反應(yīng)性與兩個對照組均有顯著差異，而且增高倍數(shù)達到2-4倍，呈顯著增高，而且在各個濃度亦顯著高于以氫氧化鋁為佐劑的哮喘組。而以氫氧化鋁為佐劑的哮喘組僅在Mch濃度為6. 25和12. 5mg/ml時氣道反應(yīng)性顯著高于自身相應(yīng)對照組，而且增高倍數(shù)均小于2。如表2所示，PC100結(jié)果表明，以殼聚糖為佐劑的哮喘組在Mch吸入濃度為5. 14mg/ml時，氣道反應(yīng)性增高為基值的2倍，顯著低于以氫氧化鋁為佐劑和無佐劑的哮喘組，表明以殼聚糖為佐劑的哮喘組的氣道敏感性顯著高于另外兩個哮喘組。而無佐劑哮喘組的氣道反應(yīng)性與對照組無差異。綜合以上結(jié)果，以殼聚糖為佐劑的哮喘模型的氣道反應(yīng)性增高顯著優(yōu)于以氫氧化鋁為佐劑和無佐劑的哮喘模型。表I各組在各濃度Mch (mg/ml)激發(fā)下的Penh/baseline (% )·
權(quán)利要求
1.殼聚糖作為免疫佐劑在制備小鼠過敏性哮喘模型中的用途。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其中所述的過敏性哮喘模型按以下方法建立，所述方法包括以下步驟 1)制備殼聚糖醋酸溶液； 2)制備殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液； 3)用殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液致敏小鼠； 4)對小鼠進行一次或多次呼吸道蛋白溶液霧化吸入激發(fā)，制備過敏性哮喘模型。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的小鼠為BALB/c小鼠。
4.如權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的殼聚糖醋酸溶液的濃度為I.5mg/ml，并用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 5. 5-5. 7。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述殼聚糖佐劑包裹的蛋白溶液通過以下步驟制備在旋潤振蕩條件下，按I : I比例向I. 5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液中緩慢加入200 u g/ml OVA水溶液，并繼續(xù)緩慢加入2. Omg/ml三聚磷酸鈉溶液，使殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比達到10 : I。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述殼聚糖醋酸溶液、OVA水溶液和所述三聚磷酸鈉溶液均通過無菌0. 22 y m膜過濾。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述致敏小鼠的方法為腹腔注射。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，對小鼠進行三次呼吸道蛋白溶液空氣壓縮霧化吸入以激發(fā)小鼠。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，對小鼠進行呼吸道蛋白溶液霧化吸入每次35分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及過敏性哮喘模型，尤其涉及殼聚糖作為免疫佐劑在制備小鼠過敏性哮喘模型中的用途。本發(fā)明對應(yīng)用殼聚糖為免疫佐劑制備的小鼠過敏性哮喘模型進行了氣道反應(yīng)性、肺組織病理檢查和炎癥指標檢驗，結(jié)果顯示，以殼聚糖為免疫佐劑制備小鼠過敏性哮喘模型在氣道嗜酸性炎癥、氣道反應(yīng)性和氣道炎性細胞因子等各個方面均顯著優(yōu)于已有免疫佐劑制備的哮喘模型。且殼聚糖價格低廉，來源豐富，殼聚糖作為免疫佐劑的小鼠哮喘模型顯著優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑，具有方法簡單，成本低廉、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。
文檔編號A61K39/39GK102727887SQ20121024125
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者卓文磊, 張巧, 林科雄, 畢玉田, 王彥, 王長征 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院