專利名稱：一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多糖的制備方法，尤其涉及一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法。
背景技術(shù)：
多糖是天然產(chǎn)物中存在的除蛋白質(zhì)、核酸之外的又一生物活性大分子，作為信息分子決定一些細胞和分子的表型和抗原性結(jié)構(gòu)，控制細胞分裂或分化、調(diào)節(jié)細胞的生長和衰老，是一種無細胞毒的免疫促進劑。動物體一系列生理和病理過程與糖鏈參與細胞間的識別有直接關(guān)系。一個血紅細胞表面就有50萬個糖蛋白分子，而人體內(nèi)免疫球蛋白IgG糖鏈上單糖組成及糖形的稍微改變就會引發(fā)某一疾病，如當糖鏈中半乳糖低于正常人時就會產(chǎn)生類風濕病。因此，近年來，國內(nèi)外對天然產(chǎn)物多糖的研究十分重視。天然多糖因其獨特的功能和很低的毒性，已在抗腫瘤藥、治療艾滋病等抗病毒藥、延緩衰老藥等幾個方·面得到開發(fā)和利用。在棗多糖的藥理活性研究方面，Yamada等的研究表明從棗中分離純化得到的多糖具有免疫活性；友田正司的研究表明日本大棗多糖具有抗腫瘤的藥理活性；ZhihuiZhao等的研究表明，棗果中的I種中性多糖及4種酸性多糖表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。國內(nèi)許多研究表明，棗多糖可增強小鼠腹腔巨噬細胞的活性；能促進小鼠脾細胞增殖；并具有清除體內(nèi)氧自由基，抗衰老的作用，并且參與了細胞信號傳導。關(guān)于棗多糖提取的專利報道近年來主要有申琳和生吉萍“利用紅棗制取棗多糖的方法及棗多糖”(申請?zhí)朇N201010606048. 9)，李進偉和范柳萍“一種金絲小棗酸性多糖提取及結(jié)構(gòu)表征”(申請?zhí)朇N201010580105. 0)，劉東鋒、郭琴及楊成東“一種拐棗多糖的制備方法”(申請?zhí)朇N201010558105. 0)，劉玉林、孫曙光及王中山“棗多糖精制方法”(申請?zhí)朇N201010102224. 5)，王青寧、趙秋萍、呂興連、張飛龍、李瀾及王正民“沙棗多糖的提取方法”(申請?zhí)朇N200910021709. 9)，趙玉英“廣棗多糖及其制取工藝”(申請?zhí)朇N200710117623. 7)，劉金福、張平平及李托平“冬棗多糖的提取方法”(申請?zhí)朇N200610014444. 6)。這些專利報道極大地豐富了長棗多糖提取純化手段，但并沒有針對長棗這一寧夏特有的優(yōu)勢品種進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，其工藝步驟是一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長棗為原料，其工藝過程包括粉碎過篩、水浴浸提、脫色、分離純化、冷凍干燥，其分離純化過程為I)制備DEAE-52纖維素填充柱DEAE_52纖維素分別用0. 5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理，裝入填充柱；
2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0. I
0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每管流速為3 4min，每管收集5ml，用分光度計測定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分；3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干；4)過DEAE-52凝膠柱進行純化，得到分級純化的長棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-I，LJU-2, LJU-3, LJU-4, LJU-5)；上述粉碎過篩是在高速粉碎機上進行，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運用高速粉碎機將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，篩上部分返回重復粉碎、過篩；上述水浴浸提的溫度是80 100°C ；上述冷凍干燥是將分離出的多糖液體在真空濃縮機中濃縮至原體積的1/3左右，·再進行真空冷凍干燥；上述脫色是將提取液反復經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變。再加無水乙醇沉出后凍干待用。本發(fā)明的特色在于長棗多糖提取工藝中達到提高提取率、縮短提取時間、減少能耗、有效保存長棗多糖生物活性等目的，并且純化得到一個單一組分多糖(LJU-3)，本發(fā)明彌補了長棗多糖的含量及抗腫瘤活性不清的不足。應用本發(fā)明獲得的產(chǎn)品進行了抑制腫瘤細胞增殖實驗(MTT法)癌細胞的接種量為180 ii L/孔，恒溫培養(yǎng)約24小時后吸凈微孔中培養(yǎng)液并添加含不同濃度的待測化合物培養(yǎng)液，陽性對照組加20 u L5-氟尿嘧啶使其終濃度為100mg/L，陰性對照加入20 ii L RPMI1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。然后加入20 y L MTT (5mg/Ml)至每個微孔中，在37°C培養(yǎng)4小時。傾凈微孔中所有的液體，空氣自然干燥，每孔加入200 ii L酸性異戊醇(200 u L異戊醇加入0. 05MHC1)，于平板震蕩器上震蕩30min，490nm酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光值。試驗設(shè)計每處理重復六次，結(jié)果為六組數(shù)據(jù)的平均值。在本發(fā)明中，對長棗多糖抗腫瘤活性實驗結(jié)果如下(I)對LJU-3來講，在細胞培養(yǎng)液中，LJU-3以198 400mg/L的水平能顯著抑制人肝癌細胞株Bel7402，178 400mg/L能顯著抑制人胃癌細胞株BGC823、167 400mg/L能顯著抑制人鼻咽癌細胞株KB。(2)在 5O 400mg/L 范圍內(nèi)，LJU-0、LJU-U LJU-2, LJU-4 及 LJU-5 對 Bel7402、BGC823及KB三種腫瘤細胞的抑制率均小于50%，說明它們對這三種腫瘤不敏感。結(jié)果表明，長棗多糖能抑制癌細胞在體外的增殖，增殖的抑制率意味著對癌癥的抑制，實驗證明長棗多糖能顯著抑制人肝癌細胞株Bel7402，人胃癌細胞株BGC823及人鼻咽癌細胞株KB，這就是說長棗多糖具有抗癌活性。本發(fā)明的技術(shù)效果是克服長棗多糖抗腫瘤活性不清的不足，以提高長棗得率，有效保存長棗多糖生物活性。
具體實施例方式選取干燥的寧夏靈武長棗，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運用高速粉碎機將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，將篩子上部的渣子重新放入粉碎機中重新粉碎。將一定質(zhì)量的棗粉樣品以固液比I :4在80 100°C水浴浸提2小時左右。離心過濾后，將濾渣重新進行水浴浸提，反復進行3次。將得到的清液反復經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變。加無水乙醇沉出后凍干待用。將DEAE-52纖維素分別用0. 5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理。將脫色和透析過的多糖液通過裝有纖維素的填充柱，透析所用的膜為纖維素半透膜，利用反滲透理論，將水和小分子去出；分別用雙蒸水和0. I 0. 5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，流速為I管/7分鐘，每管收集10ml，用分光度計測定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分。透析袋透析除鹽，濃縮后醇 沉，離心凍干。最后過DEAE-52凝膠柱進行純化，得到分級純化的長棗單一組分多糖。將分離出的多糖樣品在真空濃縮機中進行濃縮至原體積的1/3左右，將濃縮好的糖液進行真空冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長棗為原料，其工藝過程包括粉碎過篩、水浴浸提、脫色、分離純化、冷凍干燥，其特征在于分離純化過程為 1)制備將DEAE-52纖維素填充柱DEAE-52纖維素分別用0.5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理，裝入填充柱； 2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0.I 0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每管流速為3 4min，每管收集5ml，用分光度計測定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分； 3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干； 4)過DEAE-52凝膠柱進行純化，得到分級純化的長棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-I,LJU-2, LJU-3, LJU-4, LJU-5)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述粉碎過篩是在高速粉碎機上進行，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運用高速粉碎機將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，篩上部分返回重復粉碎、過篩。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述水浴浸提的溫度是80 100°C。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述冷凍干燥是將分離出的多糖液體在真空濃縮機中濃縮至原體積的1/3左右，再進行真空冷凍干燥。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述脫色是將提取液反復經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變，再加無水乙醇沉出后凍干待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長棗為原料，其分離純化過程為1)制備將DEAE-52纖維素填充柱DEAE-52纖維素分別用0.5～1mol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0.5～1mol/L鹽酸溶液進行堿洗—酸洗—堿洗—超純水洗處理，裝入填充柱；2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0.1～0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每管流速為3～4min，每管收集5ml，用分光度計測定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分；3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干；4)過DEAE-52凝膠柱進行純化，得到分級純化的長棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-1，LJU-2，LJU-3，LJU-4，LJU-5)。
文檔編號A61P35/00GK102786603SQ20121024447
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者劉曉連, 盧君逸, 李亞蕾, 李文霞, 李海峰, 楊波, 柳楊, 章中, 羅瑞明 申請人:寧夏大學