專利名稱：一種組織修復(fù)材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種組織修復(fù)材料及其制備方法和用途，屬生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
創(chuàng)面是正常皮膚或組織在外界致傷因子以及機(jī)體內(nèi)在因素下導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)，皮膚的正常功能也受損。創(chuàng)面主要分為急性創(chuàng)面、慢性創(chuàng)面。常見的急性創(chuàng)面有手術(shù)切ロ、皮膚擦傷、燒傷等；常見的慢性創(chuàng)面有褥瘡、下肢血管性潰瘍、糖尿病性足潰瘍以及其他難愈合創(chuàng)面。創(chuàng)面一旦形成，機(jī)體就會(huì)迅速作出反應(yīng)，啟動(dòng)愈合過程進(jìn)行修復(fù)。普通的急性創(chuàng)面，可通過機(jī)體的自身修復(fù)進(jìn)行創(chuàng)面愈合，而大多慢性創(chuàng)面，特別是對(duì)于糖尿病性足潰瘍等難愈合創(chuàng)面，則需要藥物輔助。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)是典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子,支持感覺神 經(jīng)和交感神經(jīng)細(xì)胞的存活，促進(jìn)其生長、分化，維持其功能。近年來，大量研究表明NGF可用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，也有學(xué)者將NGF應(yīng)用于糖尿病潰瘍患者的臨床治療，發(fā)現(xiàn)NGF可促進(jìn)潰瘍愈合。但是神經(jīng)生長因子半衰期短，體內(nèi)平均滯留時(shí)間僅有約3. 5小時(shí)，穩(wěn)定性較差，局部一次性給藥很快被代謝，限制了它在臨床上的廣泛應(yīng)用。小腸黏膜下層(small intestine submucosa, SIS),為小腸的組成結(jié)構(gòu)之一,是ー種可降解的天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料，含有多種生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-0 (transforming growth factor- ^ , TGF-0 )、腫瘤壞死因子-a (tumor necrosisfactor-a , TNF-a )、喊性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等，但經(jīng)檢測，SIS中不含有NGF。SIS具有低免疫原性，不影響受體對(duì)細(xì)菌和病毒的免疫反應(yīng)；良好的生物力學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞相容性、組織相容性及體內(nèi)降解能力；促進(jìn)血管再生等優(yōu)點(diǎn)。因此，已將SIS運(yùn)用于肌腱、韌帶、膀胱等創(chuàng)傷修復(fù)中。專利申請?zhí)?00710177285. 6中，公開了 SIS的制備方法將小腸黏膜下層以任意順序進(jìn)行消毒、脫脂、脫細(xì)胞、去垢處理后，制備而成。目前，還未見將SIS與NGF聯(lián)合用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種組織修復(fù)材料。本發(fā)明的另ー目的在于提供這種組織修復(fù)材料的制備方法和用途。本發(fā)明提供了ー種組織修復(fù)材料，它是由小腸黏膜下層和神經(jīng)生長因子組成的。其中，它是由如下重量配比的原料制備而成的小腸黏膜下層(SIS) I飛份，神經(jīng)生長因子(NGF) IX 10_5 5X 10_5份。進(jìn)ー步地，它是由如下重量配比的原料制備而成的小腸黏膜下層2份，神經(jīng)生長因子1X10—5份。更進(jìn)一歩地，所述的小腸黏膜下層為小腸黏膜下層無細(xì)胞基質(zhì)；神經(jīng)生長因子為3 -神經(jīng)生長因子。
其中，其制備方法如下取小腸黏膜下層，按(I 3) : (80^120) W/V與0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下攪拌至凝膠狀，再加入神經(jīng)生長因子，混勻，冷凍干燥后，消毒，即得。本發(fā)明還提供了上述的組織修復(fù)材料的制備方法，它具有如下操作步驟取小腸黏膜下層，按(I 3) : (80^120) W/V與0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下攪拌至凝膠狀，再加入神經(jīng)生長因子，混勻，冷凍干燥后，消毒，即得。進(jìn)ー步地，它具有如下操作步驟取小腸黏膜下層，按2:100W/V與0. 5Mこ酸混合，4°C下攪拌至凝膠狀，再向凝膠狀液體中加入神經(jīng)生長因子至100ng/ml，混勻，冷凍干燥后，
消毒，即得。
更進(jìn)一歩地，所述小腸黏膜下層是由如下方法制備的(I)取小腸，刮除空腸漿膜層、黏膜層及肌層，去離子水清洗后，剪斷；(2)加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脫脂后，去離子水沖洗；(3)再用胰蛋白酶消化，去離子水沖洗；(4)最終再以十二烷基硫酸鈉水溶液浸泡，去離子水沖洗后，即得小腸黏膜下層。本發(fā)明還提供了上述的組織修復(fù)材料在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物中的用途。進(jìn)ー步地，所述的藥物是治療糖尿病足潰瘍、促進(jìn)成纖維細(xì)胞増殖、促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥物。本發(fā)明中，NGF在単獨(dú)使用或與SIS簡單混合使用時(shí)，會(huì)很快失活，不利于對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)；但將NGF與SIS按照本發(fā)明特定方法制備成復(fù)合材料后，不僅能夠有效延長NGF的作用時(shí)間，同吋，與単獨(dú)使用SIS相比，NGF-SIS復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞的増殖活性顯著增強(qiáng)，表明本發(fā)明NGF-SIS復(fù)合材料發(fā)揮了協(xié)同增效作用，為臨床用藥提供了一種新的選擇。


圖ISIS 掃描電鏡觀察(A : X 500 ;BX 1000)圖2NGF-SIS對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響(** :與對(duì)照組比p〈0. 01)圖3NGF-SIS對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響(* :與對(duì)照組比p〈0. 05)圖4人真皮成纖維細(xì)胞接種于NGF-SIS(A-2h、B-4h、C-ld、D_5d電鏡觀察(X 1000)圖5 人真皮成纖維細(xì)胞接種于 NGF-SISS (A-2h、B_4h、C_ld、D_3d、E_5d)HE 染色(XlOO)圖6人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于NGF-SIS (A_2h、B_4h、C_ld、D_5d)電鏡觀察(XlOOO)圖7人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于NGF-SIS (A-2h、B_4h、C_ld、D_3d、E_5d)電鏡觀察(XlOO)圖8NGF對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響圖9NGF對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞hCOLlAl和hC0L3AlmRNA表達(dá)的影響圖10各組人真皮成纖維細(xì)胞的遷移(倒置顯微鏡X 100);其中，A劃痕后0h，B對(duì)照組培養(yǎng)24h后，C50ng/ml濃度組培養(yǎng)24h后，D100ng/ml濃度組培養(yǎng)24h后，E200ng/ml濃度組培養(yǎng)24h后圖IlNGF對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的影響；其中，* :與對(duì)照組比p〈0. 05 :與對(duì)照組比 p〈0. Ol ；# :與 100ng/ml 和 200ng/ml 組比 p〈0. 05圖12 免疫熒光；其中，A，C:trkANGFR 檢測，AX 100，C X 200 ;B, D:p75NTR 檢測，BX100, DX200圖13NGF對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響圖14NGF對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響圖15NGF對(duì)Ang_2mRNA表達(dá)的影響
圖16NGF對(duì)Ti e_2mRNA表達(dá)的影響圖17NGF對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響；其中，林與對(duì)照組比p〈0. 01 ；## :與50ng/ml 和 100ng/ml 組比 p〈0. 0具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明組織修復(fù)材料的制備取小腸黏膜下層(SIS)，按2:100W/V與0. 5Mこ酸混合，4°C下組織勻漿機(jī)間歇攪拌Ih至凝膠狀，置于自制圓柱形模具中。再向凝膠狀的SIS中添加NGF至100ng/ml，攪拌均勻。經(jīng)過-20°C過夜預(yù)凍后，冷凍干燥，環(huán)氧こ烷消毒，即得本發(fā)明組織修復(fù)材料(NGF-SIS)0經(jīng)測定，本發(fā)明組織修復(fù)材料中NGF含量為5ng/mg ;使用時(shí)，取適量NGF-SIS加水膨脹后，敷貼于創(chuàng)ロ。本發(fā)明中所述的小腸黏膜下層為小腸黏膜下層無細(xì)胞基質(zhì)，目前主要的制備方法是取空小腸，水洗凈后，去除漿膜層、肌層和黏膜層后，分別經(jīng)脫脂、除蛋白、去垢后，凍干、消毒即得。本發(fā)明中采用以下方式取4h內(nèi)市售新鮮豬空腸清洗后進(jìn)行以下處理制備SIS，備用(I)機(jī)械處理刮除空腸漿膜層、黏膜層及肌層，去離子水清洗后將其剪成長20 30cm ；(2)脫脂加入等體積三氯甲烷-甲醇溶液，4°C過夜，去離子水沖洗；(3)胰蛋白酶消化4°C條件下用0. 25%胰蛋白酶800ml消化過夜，去離子水沖洗；(4)去垢劑處理4 °C條件下加入0. 5%十二燒基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate, SDS) 800ml過夜，去離子水沖洗，即得SIS。本發(fā)明也可采用現(xiàn)已報(bào)道的方法制備SIS，如，羅靜聰，等，小腸黏膜下層細(xì)胞相容性的研究，生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004年21卷5期；或者如，申請?zhí)朇N200710177285. 6，發(fā)明名稱ー種SIS組織修復(fù)材料的制備方法。實(shí)施例2本發(fā)明組織修復(fù)材料中NGF的濃度優(yōu)選I、主要試劑與儀器I. I 試劑重組人@ -NGF (Peprotech 公司，美國)；P -NGF 抗體(abeam 公司，英國)；MTT(Sigma公司，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBC0公司，美國)；探針及引物(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；I. 2 儀器倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；突光顯微鏡(Olympus公司，日本)；連續(xù)光譜微孔板光密度測讀儀(Molecular Devices公司，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司，美國)；Gel DoclOOO凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)；2實(shí)驗(yàn)方法2. I細(xì)胞培養(yǎng)2. I. I人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用酶消化法進(jìn)行人真皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)。取2 12歲兒童包皮(四川大學(xué)華西醫(yī)院行包皮環(huán)切術(shù)者自愿捐贈(zèng))，去除皮下脂肪及部分殘留血跡后，0. 25%透明質(zhì)酸酶4°C過夜消化；次日剝離表皮，將真皮剪碎后，加入0. 1% I型膠原酶37°C振蕩水浴搖床中消化45min ;終止消化，1200r/min (離心半徑13. 7cm)離心5min，以含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸接種培養(yǎng)。每隔3d更換I次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80% 90%吋，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2. I. 2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系購買于美國標(biāo)準(zhǔn)品收藏中心ATCC，以含5%FBS的L-DMEM正常培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80% 90%時(shí)傳代培養(yǎng)。2. 2NGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響2. 2. INGF對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后以4X 103個(gè)/孔密度接種于96孔板。在含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，再用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。之后分別加入NGF濃度為25、50、100、200、400ng/ml含0. 5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，每濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20 ill MTT，37°C孵育3. 5h后吸棄，每孔加入50 u I DMSO,振蕩lOmin，于連續(xù)光譜測讀儀490nm處測定吸光度(A)值。2. 2. 2NGF對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞以2 X 103個(gè)/孔密度接種于96孔板。過夜培養(yǎng)后，分別加入NGF濃度為6. 25,12. 5、25、50、100、200ng/ml和NGF抗體(I U g/ml)無血清培養(yǎng)液，每濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20 u I MTT,37°C孵育3. 5h后吸棄；每孔加入50iU DMS0，振蕩lOmin，于連續(xù)光譜測讀儀490nm處測定吸光度(A)值。2. 3NGF對(duì)細(xì)胞功能的影響2. 3. INGF對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞膠原合成的影響取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以I X 105個(gè)/孔密度接種于6孔板，含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后，再用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后分別加入NGF濃度為50、100、200ng/ml含0. 5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析按Trizol試劑說明書方法提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以cDNA為模板采用TaqMan熒光探針技術(shù)進(jìn)行Col I和Col III核酸定量。引物及TaqMan探針序列如表I。擴(kuò)增條件94°C、2min，94°C、20s, 52 56°C、20s，60°C、30s，45 個(gè)循環(huán)。表I hC0LlAl、hC0L3Al、P-actin 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物
權(quán)利要求
1.ー種組織修復(fù)材料，其特征在于它是由小腸黏膜下層和神經(jīng)生長因子組成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組織修復(fù)材料，其特征在于它是由如下重量配比的原料制備而成的 小腸黏膜下層I飛份，神經(jīng)生長因子1父10-5 5\10-5份。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織修復(fù)材料，其特征在于它是由如下重量配比的原料制備而成的 小腸黏膜下層2份，神經(jīng)生長因子IX 10_5份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意ー項(xiàng)所述的組織修復(fù)材料，其特征在于所述的小腸黏膜下層為小腸黏膜下層無細(xì)胞基質(zhì)；神經(jīng)生長因子為￠-神經(jīng)生長因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意ー項(xiàng)所述的組織修復(fù)材料，其特征在于其制備方法如下 取小腸黏膜下層，按(I 3) : (8(T120)W/V與0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下攪拌至凝膠狀，再加入神經(jīng)生長因子，混勻，冷凍干燥后，消毒，即得。
6.權(quán)利要求1-4任意ー項(xiàng)所述的組織修復(fù)材料的制備方法，其特征在于它具有如下操作步驟 取小腸黏膜下層，按(I 3) : (8(T120)W/V與0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下攪拌至凝膠狀，再加入神經(jīng)生長因子，混勻，冷凍干燥后，消毒，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于它具有如下操作步驟 取小腸黏膜下層，按2:100W/V與0. 5Mこ酸混合，4°C下攪拌至凝膠狀，再向凝膠狀液體中加入神經(jīng)生長因子至100ng/ml，混勻，冷凍干燥后，消毒，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于所述小腸黏膜下層是由如下方法制備的 (1)取小腸，刮除空腸漿膜層、黏膜層及肌層，去離子水清洗后，剪斷； (2)加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脫脂后，去離子水沖洗； (3)再用胰蛋白酶消化，去離子水沖洗； (4)最終再以十二烷基硫酸鈉水溶液浸泡，去離子水沖洗后，即得小腸黏膜下層。
9.權(quán)利要求1-5任意ー項(xiàng)所述的組織修復(fù)材料在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療糖尿病足潰瘍、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織修復(fù)材料，它是由小腸黏膜下層(SIS)和神經(jīng)生長因子(NGF)組成的。本發(fā)明中，NGF在單獨(dú)使用或與SIS簡單混合使用時(shí)，會(huì)很快失活，不利于對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)；但將NGF與SIS按照本發(fā)明特定方法制備成復(fù)合材料后，不僅能夠有效延長NGF的作用時(shí)間，同時(shí)，與單獨(dú)使用SIS相比，NGF-SIS復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，表明本發(fā)明NGF-SIS復(fù)合材料發(fā)揮了協(xié)同增效作用。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102743791SQ20121024771
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者楊志明, 羅靜聰, 解慧琪, 錢志勇 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院