專利名稱：一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨軟骨組織工程支架的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨由單一的軟骨細(xì)胞、致密膠原和糖蛋白間質(zhì)構(gòu)成，主要功能是在關(guān)節(jié)間分散與傳遞負(fù)荷，減少摩擦，使關(guān)節(jié)可以進(jìn)行光滑、無痛的活動。關(guān)節(jié)軟骨無血管、淋巴管及神經(jīng)支配，軟骨細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，因此軟骨的自我修復(fù)能力差，各種損傷、炎癥和退變均可引起不可逆性軟骨損傷，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量。目前應(yīng)用于臨床的修復(fù)方法均有明顯的各自缺陷，修復(fù)后的軟骨組織無論在生物學(xué)還是生物力學(xué)上都與天然軟骨不同，且極易發(fā)生軟化退變，導(dǎo)致療效下降。近年來，組織工程的進(jìn)步為軟骨損傷的修復(fù)提供了一個頗具前景的新方法。組織工程的三大要素是支架材料、種子細(xì)胞、生長因子。其中，支架材料在組織工程中起著至關(guān)重要的作用，它扮演著臨時細(xì)胞外基質(zhì)的角色，為細(xì)胞的黏附、生長、增殖提供三維幾何環(huán)境，也使細(xì)胞能有效地進(jìn)行新陳代謝。因此，尋找合適的材料，并制備結(jié)構(gòu)接近天然組織的支架是組織工程成功的關(guān)鍵因素之一。用于軟骨組織工程的支架厚度大致可分為兩種一是將支架的厚度控制在軟骨層內(nèi)，即單純的軟骨支架；另一種是將支架的厚度深入到軟骨下骨，成為骨軟骨(osteochondral)組織工程支架。后一種方法可利用軟骨下骨層的支架提供穩(wěn)定性，使得植入物不用縫合或膠粘而方便固定，利于臨床操作。最近對于骨軟骨缺損模型的研究還表明，保持軟骨下骨的存在會使其上軟骨層中的軟骨細(xì)胞獲得更類似于正常關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)與代謝環(huán)境，因此可使軟骨的修復(fù)效果更好。近些年來，國內(nèi)外已陸續(xù)出現(xiàn)不少有關(guān)骨軟骨組織工程支架的報道，但是這些支架都只是在材料種類或成分比例上將骨層和軟骨層的支架區(qū)分開來，而在支架的微觀結(jié)構(gòu)上并沒有考慮天然組織的復(fù)雜分層結(jié)構(gòu)。實際上，天然軟骨的細(xì)胞和基質(zhì)形態(tài)以及相應(yīng)的力學(xué)性能都隨深度發(fā)生著變化，顯示出分層結(jié)構(gòu)，各層中的細(xì)胞形態(tài)與其周圍的基質(zhì)形態(tài)有很大關(guān)聯(lián)。其中，輻射層為關(guān)節(jié)軟骨中最厚的部分，這部分的膠原纖維垂直關(guān)節(jié)面方向走行，細(xì)胞直徑大，呈柱狀排列，與軟骨表面垂直，這種構(gòu)造有利于軟骨承受壓力載荷。近期有文獻(xiàn)明確指出，軟骨組織工程想要成功，重視軟骨的分層結(jié)構(gòu)是至關(guān)緊要的，便于分層結(jié)構(gòu)恢復(fù)的策略可使修復(fù)軟骨的功能更強(qiáng)。Zehbe等用電解法制備出了具有垂直取向孔道的明膠支架，在其上培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞可以在孔道內(nèi)呈縱向排列生長。Wang等的實驗證明定向微溝槽可誘導(dǎo)細(xì)胞取向生長，進(jìn)而決定了細(xì)胞分泌的膠原纖維平行于溝槽定向排列。這些報道提示我們，把軟骨支架制備成含有垂直孔道的多層結(jié)構(gòu)，將可能使修復(fù)的軟骨在結(jié)構(gòu)與功能上都更加接近天然軟骨組織
發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，使骨層支架具有接近天然骨組織的硬度與強(qiáng)度，既利于軟骨組織的修復(fù)，又便于臨床使用支架時的操作、固定；同時，使軟骨層支架具有含垂直孔道的多層結(jié)構(gòu)，便于引導(dǎo)支架上細(xì)胞以接近天然軟骨分層結(jié)構(gòu)的狀態(tài)生長，提高軟骨損傷修復(fù)的效果。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，包括以下步驟步驟一，在質(zhì)量濃度1-2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為l_4g IOOml的溶液，置于4°C冰箱中保存待用；步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出4_10%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料；步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于-20°C冰箱中預(yù)凍1-24小時，或在_20°C下預(yù)凍I小時后轉(zhuǎn)置于4°C環(huán)境下繼續(xù)預(yù)凍24小時；步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料l_5mm，放入_20°C冰箱中預(yù)凍1-24小時，或在_20°C中冷凍I小時后再在4°C中冷藏24小時，然后在-50°C、10Pa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品；步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、10Pa條件下冷凍干燥3-10天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。本發(fā)明制備的骨軟骨雙相支架中的骨層部分支架具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布均勻，在不同的PLA濃度和預(yù)凍條件下，孔徑可在3(Γ150 μ m范圍內(nèi)調(diào)節(jié)；軟骨層部分支架上方具有圓孔型結(jié)構(gòu)，下方具有狹長的孔道結(jié)構(gòu)，孔道方向與支架的表面近似垂直。對骨軟骨雙相支架材料進(jìn)行的急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗、溶血試驗、體外細(xì)胞毒性試驗均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。將骨軟骨雙相支架應(yīng)用于兔膝關(guān)節(jié)缺損修復(fù)的試驗顯示支架材料與關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨有良好的生物相容性，修復(fù)效果良好。


圖I是實施例I制備的骨軟骨雙相支架的宏觀照片，其中左上角插圖為俯視圖。圖2是實施例I制備的骨軟骨雙相支架骨層部分支架的SEM照片。圖3是實施例2制備的骨軟骨雙相支架軟骨層部分支架的SEM照片。圖4是兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)植入實施例2的骨軟骨雙相支架材料的照片，圖中方框內(nèi)為支架材料。圖5是骨軟骨雙相支架在兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)植入12周后的標(biāo)本宏觀照片，其中A為實驗組，B為空白組。圖6是兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)植入實施例2的實驗組織切片HE染色照片，其中A-F為實驗組植入4周(A，B)、8周(C，D)和12周(E，F(xiàn))后的照片，G-L為空白組植入4周(A，B)、8周(C，D)和 12 周(E, F)后的照片。A, C，E, G，I，K 為 40 X 放大照片，B，D, F，H，J，L 為 200 X 放大照片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不局限于此或者受此限制。實施例一一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，包括以下步驟步驟一，在質(zhì)量濃度2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為2. Ig :100ml的溶液，直于4 C冰箱中保存待用；步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出6%wt的PLA溶液，取骨
粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料；步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于_20°C冰箱中預(yù)凍24小時，；步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料1mm，放入_20°C冰箱中預(yù)凍2小時，然后在-50°C、10Pa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品；步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、10Pa條件下冷凍干燥3天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。圖I為該實施例制備出的骨軟骨雙相支架的宏觀照片，左上角插圖為俯視圖。圖2為該實施例制備出的骨軟骨雙相支架的骨層部分的SEM照片，從照片中可以看出支架為多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為80-120 μ m。實施例二一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，包括以下步驟步驟一，在質(zhì)量濃度2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為3. 5g 100ml的溶液，直于4 C冰箱中保存待用；步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出8%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料；步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于-20°C冰箱中預(yù)凍I小時；步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料2. 5mm，放入_20°C冰箱中預(yù)凍4小時，然后在-50°C、10Pa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品；步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、10Pa條件下冷凍干燥10天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。圖3為該實施例制備出的骨軟骨雙相支架的軟骨層部分的SEM照片，從照片中可以看出軟骨層支架由圓形孔和垂直孔組成，圓形孔的孔徑在100-200 μ m之間，垂直孔徑向?qū)挾葹?00-300 μ m之間，垂直孔厚度為1-1. 2mm，該實施例制備出的骨軟骨雙相支架的骨層部分仍為圖I所示的多孔結(jié)構(gòu)，但孔徑縮小為60-90 μ m。下面以實施例二制備的骨軟骨雙相支架進(jìn)行相關(guān)實驗I、實施例二制備的骨軟骨雙相支架的急性全身毒性試驗一、選用實施例二制備的骨軟骨雙相支架，介質(zhì)采用生理鹽水，按Ig材料/5ml介質(zhì)的比例，浸提條件為37°C、72±2小時，無菌操作下將材料浸提液過濾、分裝于無菌瓶中，4 °C冰箱保存、備用。二、選健康小白鼠20只，體重20土3g，雌雄各半，隨機(jī)分成2組，每組10只。實驗組無菌條件下向每只小鼠腹腔內(nèi)注入50ml/kg劑量的浸提液(約Iml/只);對照組單純注入等量生理鹽水。于注射后24，48，72小時觀察記錄動物的一般狀態(tài)、毒性反應(yīng)及有無死亡。毒性表現(xiàn)評價分級a、無毒；無任何癥狀。b、輕度有輕度癥狀，但無運(yùn)動減少、呼吸困難或腹部癥狀。C、明顯有腹部刺激癥狀，呼吸困難，運(yùn)動減少，眼瞼下垂。d、重度衰竭、發(fā)紺、震顫，嚴(yán)重腹部刺激癥狀，眼瞼下垂，呼吸困難。結(jié)果腹腔注射浸提液后，實驗組小鼠的一般情況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無腹部刺激癥狀，無驚厥、癱瘓和死亡等毒性反應(yīng)及死亡現(xiàn)象，與對照組相比無明顯差異。毒性表現(xiàn)評價分級為a級無毒；無任何癥狀。2、實施例二制備的骨軟骨雙相支架的皮內(nèi)刺激試驗一、選用實施例二制備的骨軟骨雙相支架，介質(zhì)采用生理鹽水，按Ig材料/5ml介質(zhì)的比例，浸提條件為37°C、72±2小時，無菌操作下將材料浸提液過濾、分裝于無菌瓶中，4 °C冰箱保存、備用。二、選取3月齡新西蘭大白兔3只，體重2. 0-2. 5kg，雌雄不限，常規(guī)脊柱兩側(cè)背部備皮、消毒，在每只兔脊柱的兩側(cè)各選10個點，每點間隔2cm。每只兔脊柱一側(cè)的前5個點皮內(nèi)注射O. 2ml材料浸提液，作為實驗組，同側(cè)后5個點皮內(nèi)注射O. 2ml生理鹽水，作為陰性對照組；另一側(cè)前5個點皮內(nèi)注射O. 2ml20%的酒精作為陽性對照組，同側(cè)后5個點皮內(nèi)注射O. 2ml材料浸提液，作為實驗組。分別于注射后15分鐘、24，48，72小時觀察注射局部皮膚及周圍組織有無充血、水腫、壞死等反應(yīng)，并參照皮內(nèi)刺激記分標(biāo)準(zhǔn)(表I)判定試驗結(jié)果。原發(fā)刺激指數(shù)(PU):無刺激為O O. 4分；輕度刺激為O. 5 I. 9分；中度刺激為2. O 4. 9分；強(qiáng)度刺激為5. O 8. O分；總刺激評分8分。表I 皮內(nèi)刺激記分標(biāo)準(zhǔn)(Intradermal stimulation score)
權(quán)利要求
1.一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，在質(zhì)量濃度1-2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為l_4g :100ml的溶液，直于4 C冰箱中保存待用； 步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出4-10%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料； 步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于_20°C冰箱中預(yù)凍1-24小時，或在-20°C下預(yù)凍I小時后轉(zhuǎn)置于4°C環(huán)境下繼續(xù)預(yù)凍24小時； 步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料l_5mm，放入-20°C冰箱中預(yù)凍1-24小時，或在-20°C中冷凍I小時后再在4°C中冷藏24小時，然后在-50°C、IOPa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品； 步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、IOPa條件下冷凍干燥3-10天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，在質(zhì)量濃度2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為2. Ig :100ml的溶液，置于4°C冰箱中保存待用； 步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出6%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料； 步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于-20°C冰箱中預(yù)凍24小時，； 步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料1mm，放入-20°C冰箱中預(yù)凍2小時，然后在-50°C、10Pa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品； 步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、IOPa條件下冷凍干燥3天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，在質(zhì)量濃度2%的醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，混合攪拌，膠原與殼聚糖為任意比例混合，配置出膠原和殼聚糖混合物與醋酸水溶液的比例為3. 5g 100ml的溶液，置于4°C冰箱中保存待用； 步驟二，將聚乳酸(PLA)溶于1，4 二氧六環(huán)溶劑中，配置出8%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量與PLA粉體質(zhì)量相同，混合攪拌均勻，骨粉采用納米晶磷酸鈣膠原基骨修復(fù)材料； 步驟三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用與通孔直徑相同的聚四氟乙烯圓柱體從模具一端將孔洞堵住，向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，置于_20°C冰箱中預(yù)凍I小時；步驟四，向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，高出骨材料2. 5mm，放入-20°C冰箱中預(yù)凍4小時，然后在-50°C、10Pa條件下冷凍干燥72小時得到支架樣品； 步驟五，將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，在敞口容器中再次于-50°C、10Pa條件下冷凍干燥10天，以使殘留的1，4 二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。
全文摘要
一種雙相骨軟骨組織工程支架材料的制備工藝，先在醋酸溶液中加入殼聚糖和膠原粉末，置于冰箱中保存待用；再配置出PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，混合攪拌均勻；然后向模具中注入制備好的PLA/骨粉溶液，預(yù)凍；再向預(yù)凍好的模具中加入膠原/殼聚糖溶液，預(yù)凍，然后冷凍干燥得到支架樣品；最后將冷凍干燥好的骨軟骨雙相支架從模具中取出，本發(fā)明使骨層支架具有接近天然骨組織的硬度與強(qiáng)度，既利于軟骨組織的修復(fù)，又便于臨床使用支架時的操作、固定；同時，軟骨層支架具有含垂直孔道的多層結(jié)構(gòu)，便于引導(dǎo)支架上細(xì)胞以接近天然軟骨分層結(jié)構(gòu)的狀態(tài)生長，提高軟骨損傷修復(fù)的效果。
文檔編號A61L27/40GK102872480SQ20121024825
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者孫曉丹, 單程, 李程, 王夢哲, 林建華, 賴建明 申請人:清華大學(xué)