專利名稱：雙功能納米粒載體及雙功能納米粒制劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種納米粒載體和納米粒制劑的制備方法,具體是ー種雙功能納米粒載體及雙功能納米粒制劑的制備方法。
背景技術：
靶向納米給藥系統(tǒng)通常可分為主動靶向和被動靶向納米給藥系統(tǒng)。主動靶向給藥系統(tǒng)研究的重要方向是利用受體與配基 的專ー性結(jié)合的原理，合成具有主動靶向功能的納米粒載體。葉酸(Folate)是主動靶向配基中常用的ー種，許多腫瘤細胞膜表面都有葉酸受體過度表達。基于這種特殊的作用，可將與葉酸結(jié)合的藥物載體導入這些腫瘤細胞中。被動靶向納米給藥系統(tǒng)的ー個重要的研究方向是根據(jù)腫瘤組織微環(huán)境的酸堿失衡研制出pH敏感型的載藥納米粒。腫瘤組織微環(huán)境的pH值(5. 7 7. 8，平均值為7. 0)低于正常組織(pH=7.4)。在正常的中性pH下，該納米粒比較穩(wěn)定，但是當其進入腫瘤組織的偏酸性環(huán)境時，粒子會加速崩解，從而快速釋放納米粒中被包載的藥物，使藥物在腫瘤內(nèi)達到ー個較高的濃度以提高療效。腙鍵(-C=N-N-)在生理pH條件下很穩(wěn)定，但是在弱酸性條件下很快水解，是ー種常用的PH敏感型連接段。事實上，靶向納米給藥系統(tǒng)進入血液后容易被吞噬細胞吞噬，吞噬作用則是通過血液中親脂性的調(diào)理蛋白介導的，將納米粒直徑控制在300nm以下，并用親水性材料，如聚こニ醇(PEG)進行表面修飾，可減少吞噬細胞對納米粒的捕獲，起到“長循環(huán)”的功能。另夕卜，聚乳酸こ醇酸(PLGA)是納米粒制備的常用載體之一，具有良好的生物相容性，且無毒可生物降解，通過美國FDA認證并被收錄美國藥典，被廣泛應用于制藥、醫(yī)用工程材料領域。經(jīng)過對現(xiàn)有技術的檢索發(fā)現(xiàn)，葉酸主動靶向納米給藥系統(tǒng)治療腫瘤已見報道。KinSH, Jeong JH, Chun KW等人公開了ー種顯正電性的接有葉酸的聚合物PLL-PEG-Folate(Langmuir 2005，21:8852-8857)，實驗結(jié)果證實了葉酸的靶向作用，與對照組相比，KB細胞吸收提高5. 7倍，對葉酸受體表達的細胞具有明顯選擇性。此外，還有EanaeiliF, Ghahremani MH, Ostad SN等人公開的一種載多烯紫杉醇的PLGA葉酸祀向納米粒(J DrugTarget 2008, 16:415-423)，細胞實驗結(jié)果顯示，納米粒具有良好的靶向作用。另外，含酸敏感連接段的納米粒載體也有報道，例如Bae Y, Fukushima S, Harada A等人用腙鍵把阿霉素連接到 PEO-b-p (Asp)的天冬氨酸單兀上(Angew Chem Int Engl. 2003, 42:4640-4643),釋放試驗結(jié)果顯示，隨著PH值降低，藥物釋放明顯加快。然而，現(xiàn)有研究大多是聚合物和藥物之間用酸敏感鍵連接，大大限制了被包載藥物的種類。而且，兼具葉酸和酸敏感鍵連接基團的雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate (即pH敏感型葉酸靶向納米粒載體PLGA-PEG-Folate)未見報道，這種新型納米粒載體的研制將為納米給藥系統(tǒng)抗腫瘤治療提供新思路。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明提供ー種雙功能納米粒載體及雙功能納米粒制劑的制備方法。本發(fā)明制備的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的粒徑為146. 5±7. 3nm，具有良好的包封率、載藥量和穩(wěn)定性。本發(fā)明的第一個目的通過以下技術方案實現(xiàn)—種制備雙功能納米粒載體的方法,包括以下步驟步驟一，在4- ニ甲氨基吡啶和縮合劑存在的條件下，以PLGA-C00H和對羥基苯甲醛為原料合成帶甲醛基的酯； 步驟ニ，在對甲苯磺酸存在的條件下，帶甲醛基的酯與羧基苯肼合成得到帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物；步驟三，在N-羥基琥珀酰亞和和縮合劑存在的條件下，使NH2-PEG-NH2與所述帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物軛合；再加入葉酸、NHS和縮合剤，發(fā)生再次軛合，得到雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate。優(yōu)選的，所述雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate中，所述PEG的重均分子量為4000Da，所述PLGA的重均分子量為15000Da。優(yōu)選的，所述縮合劑為N，N’ - ニ環(huán)己基碳ニ亞胺。本發(fā)明的另ー個目的通過以下技術方案實現(xiàn)ー種制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，包括以下步驟步驟一，將硫酸長春新堿溶于Tris-HCl緩沖液，得混合溶液；步驟ニ，在超聲冰浴條件下，將所述混合溶液滴加到含有所述雙功能納米粒載體的有機溶液中，得到初乳；步驟三，在超聲冰浴條件下，將含TriS-HCl緩沖液的PVA溶液滴加至所述初乳中，得到復乳；步驟四，所述復乳經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，離心低溫凍干，得到包載有硫酸長春新堿的雙功能納米粒。優(yōu)選的，所述硫酸長春新堿與所述雙功能納米粒載體的重量比為(1.0 I. 5) :10。優(yōu)選的，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為5 7. 4。優(yōu)選的，所述初乳中的Tris-HCl緩沖液與有機溶劑的體積比為I: (5 20)。優(yōu)選的，所述有機溶劑為ニ氯甲烷或丙酮。優(yōu)選的，所述PVA溶液的pH值為5 7. 4，所述PVA溶液的重量體積百分比濃度為
0. 6 2% o優(yōu)選的，所述離心低溫凍干的具體步驟為以12000 50000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理30分鐘后低溫凍干。本發(fā)明提供的上述納米粒的應用方法為通過將所述納米粒的溶液放置于透析袋后置于釋放介質(zhì)中，經(jīng)恒溫搖床振蕩實現(xiàn)藥物釋放。所述透析袋截留分子量為3000 IOOOODa ;所述恒溫為37±0. 5°C ;所述釋放介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。本發(fā)明通過四個基本構(gòu)建單元葉酸(Folate)、聚こニ醇(PEG)、聚乳酸こ醇酸(PLGA)、pH敏感基團腙鍵(-C=N-N-),經(jīng)酰化反應、酷化反應、親核取代/加成反應以及縮合反應來合成雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate,通過復乳法將硫酸長春新堿包載于所述雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate中，制得包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒。
本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒的粒徑為146. 5±7. 3nm，具有良好的包封率、載藥量和穩(wěn)定性。與硫酸長春新堿水溶液，非修飾的PLGA-PEG納米粒相比，包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒具有良好的細胞毒性，在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的性能。因而雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate和包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑是ー種理想的藥物載體。


圖I是聚合物NH2-PEG-NH2的合成路線 圖；圖2是聚合物NH2-PEG-NH2的1HNMR結(jié)果圖；圖3是連有腙鍵的PLGA衍生物的合成路線圖； 圖4是連有腙鍵的PLGA衍生物的1HNMR結(jié)果圖；圖5是雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate的合成路線圖；圖6是雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate的1HNMR結(jié)果圖；圖7是包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒的透射電鏡圖；圖8是三種硫酸長春新堿劑型在Tris-HCl緩沖液中的釋放行為結(jié)果圖；圖9是三種硫酸長春新堿劑型在醋酸銨緩沖液中的釋放行為結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一歩理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例I本實施例涉及ー種雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate的制備方法；雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate的合成,具體包括以下步驟 (I)以HO-PEG-OH為原料，經(jīng)過三步合成NH2-PEG-NH2，合成過程如圖I所示，NH2-PEG-NH2的1HNMR結(jié)果如圖2所示；(2)以CH2Cl2為溶劑，使活化好的PLGA-C00H與對羥基苯甲醛反應，之后加入催化劑對甲苯磺酸，發(fā)生縮合反應，形成聚連有腙鍵(-NH-N=CH-)的PLGA衍生物，合成過程如圖3所示，連有腙鍵的PLGA衍生物的1HNMR結(jié)果如圖4所示；(3)連有腙鍵的PLGA衍生物羧基端活化之后，以DMF為溶剤，DCC\NHS為催化劑，與NH2-PEG-NH2發(fā)生酰化反應，再加入催化劑吡啶、DCC與反應物葉酸，生成雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate，合成過程如圖5所示，雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate的1HNMR結(jié)果如圖6所不。實施例2本實施例涉及ー種包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法；包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備，包括以下步驟(I)硫酸長春新堿溶于pH6. 8的Tris-HCl緩沖液中，配成濃溶液(稱為相I )，將PLGA-mPEG和雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate (二者質(zhì)量比為8:1)溶于有機溶劑(ニ氯甲烷或丙酮)中(稱為相II)，Tris-HCl緩沖液與有機溶劑的體積比為I: (5 20)，硫酸長春新堿投藥量為10% 15% (w/w)；(2)超聲冰浴條件下，將相I滴加到相II中，得到初乳；(3)超聲冰浴條件下，將含有0. 6% 2%PVA(w/v)且pH為5 7. 4的Tris-HCl緩沖液滴加到初乳中，得到W/0/W的復乳；(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去復乳中的有機溶劑；
(5)將步驟(4)中得到的溶液高速離心(12000 50000rpm)30min，除去游離VCR，得到帶有藍色乳光的納米粒溶液；(6)將納米粒溶液低溫凍干，即得到包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑NP2，用透射電鏡檢測，其透射電鏡結(jié)果如圖7所示。實施例3本實施例涉及ー種PLGA-mPEG納米粒的制備方法；制備方法同實施例I和實施例2，獲得PLGA-mPEG納米粒制劑NPl。實施例4包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒的釋放取硫酸長春新堿溶液(VCR-Sol )、硫酸長春新堿PLGA-mPEG納米粒(VCR-PLGA-mPEG-NPs)和硫酸長春新堿雙功能納米粒(VCR-PLGA_mPEG/PLGA-pH-PEG-Folate-NPs)置于透析袋(300(T5000Da)，于體積為50mL釋放介質(zhì)中(醋酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液)，37°C恒溫搖床震蕩，定時取樣用高效液相測定釋放介質(zhì)中VCR的含量，計算累計釋放百分率，釋放曲線如圖8和圖9所示。通過對樣品在兩種釋放介質(zhì)中的釋放性質(zhì)的研究，結(jié)果表明，VCR-Sol在兩種介質(zhì)中釋藥均快，8h藥物已基本全部釋放。在中性介質(zhì)中，兩種納米粒的釋放行為基本相似，分為突釋和緩釋兩相，但在酸性釋放介質(zhì)中，兩種納米粒的釋放行為有明顯不同，VCR-PLGA-mPEG/PLGA-pH-PEG-Folate-NPs在8h前有明顯的突釋，累計釋放百分率達到70%以上，與沒有加入PLGA-Ph-PEG-Folate的納米粒有很大差別。這說明雙功能納米粒載體確實發(fā)揮了酸性敏感的特性。實施效果對兩種納米粒NPl和NP2的粒徑、Zeta電位、藥物支載量和包封率進行表征，表征結(jié)果如表I所示。表I
PVA 含M~、 ZateIll位藥物支戰(zhàn)-W I 藥物包
趣卿j (%, w/w)滅(nm) (mV)(w/w,%) I (%)
NPI1.0122.0±9.56 -5.80±0.06 2.48土0.12 [ 34.15土4.76
NP2 t 1.0 f 148.9±12.6 l] -4.23±0.19 J 2.84土0.17 I 30.37土2.89由表I可見,所制備的兩種納米粒粒徑在100 150nm, Zeta電位在_4mv以下。將不同濃度的NP1、NP2、VCR水溶液與人乳腺癌細胞共同孵化24h，然后用MTT檢測細胞成活率，計算其IC50值。NP1、NP2, VCR原藥溶液對人乳腺癌細胞株的IC50值如表2所示。
表 權(quán)利要求
1.一種制備雙功能納米粒載體的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，在4- 二甲氨基吡啶和縮合劑存在的條件下，以PLGA-COOH和對羥基苯甲醛為原料合成帶甲醛基的酯； 步驟二，在對甲苯磺酸存在的條件下，帶甲醛基的酯與羧基苯肼合成得到帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物； 步驟三，在N-羥基琥珀酰亞和和縮合劑存在的條件下，使NH2-PEG-NH2與所述帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物軛合；再加入葉酸、NHS和縮合劑，發(fā)生再次軛合，得到雙功能納米粒載體 PLGA-PEG-Folate。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備雙功能納米粒載體的方法，其特征在于，所述雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate中，所述PEG的重均分子量為4000Da，所述PLGA的重均分子量為 15000Da。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備雙功能納米粒載體的方法，其特征在于，所述縮合劑為N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺。
4.一種制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，將硫酸長春新堿溶于Tris-HCl緩沖液，得混合溶液； 步驟二，在超聲冰浴條件下，將所述混合溶液滴加到含有權(quán)利要求I所述雙功能納米粒載體的有機溶液中，得到初乳； 步驟三，在超聲冰浴條件下，將含Tris-HCl緩沖液的PVA溶液滴加至所述初乳中，得到復乳； 步驟四，所述復乳經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，離心低溫凍干，得到包載有硫酸長春新堿的雙功能納米粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述硫酸長春新堿與所述雙功能納米粒載體的重量比為(I. O I. 5) :10o
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為5 7. 4。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述初乳中的Tris-HCl緩沖液與有機溶劑的體積比為I: (5 20)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述有機溶劑為二氯甲烷或丙酮。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述PVA溶液的pH值為5 7. 4，所述PVA溶液的重量體積百分比濃度為O. 6 2%。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9任一項所述的制備包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的方法，其特征在于，所述離心低溫凍干的具體步驟為以12000 50000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理30分鐘后低溫凍干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙功能納米粒載體及雙功能納米粒制劑的制備方法；所述方法包括如下步驟在4-二甲氨基吡啶和縮合劑存在的條件下，以PLGA-COOH和對羥基苯甲醛為原料合成帶甲醛基的酯；在對甲苯磺酸存在的條件下，帶甲醛基的酯與羧基苯肼合成得到帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物；在N-羥基琥珀酰亞和和縮合劑存在的條件下，使NH2-PEG-NH2與所述帶有酸敏感連接段腙鍵的PLGA衍生物軛合；再加入葉酸、NHS和縮合劑，發(fā)生再次軛合，得到雙功能納米粒載體PLGA-PEG-Folate。本發(fā)明制備雙功能納米粒載體在體外表現(xiàn)出良好的藥代動力學行為，具有良好的載藥量、包封率和穩(wěn)定性。
文檔編號A61K9/19GK102766262SQ201210251910
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者何慧娟, 朱濤, 沈琦, 豆立美 申請人:上海交通大學