專利名稱：微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種生物堿的提取方法，尤其涉及微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法。
背景技術：
目前，雙水相體系(ATPS)用于中草藥有效成分分離純化的研究報道還較少。林強等利用こ醇/磷酸氫ニ鉀的新型體系萃取甘草中的有效成分，對溶劑、鹽的種類等因素進行考察，優(yōu)化了萃取條件，在最優(yōu)萃取條件下，甘草酸鹽在兩相中的分配系數(shù)可以達到
12.8，收率高達98. 3%，方法簡單易行。此外，ATPS也被用于黃酮類化合物的提取分離中。張春秀等采用PEG/磷酸鹽體系對銀杏葉浸提液中的黃酮類化合物進行了分離富集，并對PEG的分子量及濃度，磷酸鹽的濃度以及溫度對萃取的影響。最終選擇了 PEG1500，并在25°C下 進行萃取，黃酮類化合物的萃取率可達到98. 2%。彭勝等采用PEG4000/葡聚糖40000(D40)研究了萃取分離杜仲黃酮的エ藝條件，考察了 ATPS的形成、相圖，以及各影響因素對杜仲黃酮萃取效果的影響。結果表明當質量分數(shù)為11%的PEG4000和質量分數(shù)為8%的D40最佳萃取エ藝條件下，杜仲黃酮的萃取率為75. 82%。不難發(fā)現(xiàn)，用于萃取純化分離天然產物有效成分的ATPS多為高聚物/高聚物或高聚物/無機鹽等傳統(tǒng)的雙水相體系，采用低分子量有機溶劑/無機鹽的新型雙水相體系萃取生物堿類有效成分的研究還未見有報道。反膠束體系，其中的表面活性劑的極性頭排列在一起形成一個極性內核，該核溶解了水后形成“水池”，可通過靜電作用カ選擇性的增溶帶異種電荷的物質，且可使目標物與外界的有機溶劑隔絕開來，萃取環(huán)境溫和，可保持生物活性物質的活性。因此廣泛應用于蛋白質和氨基酸等極性物質的分離純化。在國外，目前反膠束還是主要用于蛋白質和氨基酸以及核酸等生物大分子的萃取和分離，并逐漸有新反膠束體系被報道。Goto等用A0T/D0LPA混合反膠束萃取a -胰凝乳蛋白酶，發(fā)現(xiàn)混合反膠束體系的萃取能力高于單ー的AOT反膠束體系。在國內，反膠束萃取也發(fā)展得十分迅速，陳復生等首次應用反膠束萃取技術同時分離花生中的油和蛋白；張潔等采用SDS/異辛烷/正辛醇反膠束體系對大豆蛋白進行萃取，并用響應面實驗對影響萃取的因素進行考察和優(yōu)化，得到了最佳萃取エ藝。此外，超聲波等也被用于輔助反膠束萃取，孟憲鋒等利用超聲波輔助AOT/異辛烷反膠束萃取紅花餅柏蛋白，分析和討論了超聲萃取時間、溫度、餅柏量以及增溶水量Wtl對萃取的影響，得到在最優(yōu)萃取エ藝，在最佳萃取エ藝下蛋白質萃取率達到58. 3%。目前，反膠束萃取也開始應用于植物小分子有效成分的萃取分離方面的研究。陳明拓等人用AOT/異辛烷反膠束對粗苦參堿中的苦參堿進行了萃取研究，通過正交實驗優(yōu)化萃取エ藝和條件，得出影響生物堿萃取的主要因素為水相酸度，次要因素為水相的溫度，而反膠束的Wtl及離子強度對萃取率的影響較小，在最優(yōu)萃取エ藝下苦參堿的萃取率為70.3%。首次應用反膠束萃取生物堿類有效成分，為生物堿的提取分離提供了新的思路。但該研究僅以AOT反膠束進行了萃取，未考察比較不同反膠束體系對苦參生物堿的萃取，所得萃取率也較低，純度不高，有待改善和提高?？鄥槎箍苹睂僦参飦碓吹某Ｓ弥兴?，是植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，含有喹諾里西啶類生物堿、異戊烯基類黃酮和齊墩果烯型三萜等成分?？鄥⑸飰A主要包括苦參堿和氧化苦參堿，此外還含有槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿、羥基苦參堿、n-甲基金雀花堿、安那吉堿、巴普葉堿和去氫苦參堿(苦參烯堿)等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案為
微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法，包括以下步驟
1)制備こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑，其中硫酸銨質量分數(shù)為18%，こ醇質量分數(shù)為28% ;制備SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑；
2)將苦參或山豆根粉碎，與こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑混合，微波輔助提取，提取液冷卻后，離心分相，上相旋干；
3)旋干后的殘渣用酸溶解，水稀釋并調節(jié)pH至5，得苦參生物總堿水溶液；
4)將苦參生物總堿水溶液、SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑混合，攪拌萃取，靜置分相，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與KCl溶液混合，攪拌反萃取，靜置，合并下層水相，旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得苦參生物總堿粗品；
5)采用硅膠柱層析法分離苦參生物總堿粗品，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，收集洗脫液，采用薄層層析法合并各洗脫液，濃縮，分別重結晶，真空干燥，得苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿單體。優(yōu)選的，SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑中含水量為I. 25 mol/L, SDBS濃度為0. 05mol/L, KCl濃度為0. 05 mol/L，異辛烷、正辛醇的體積比4:1。優(yōu)選的，步驟2)微波輔助提取條件微波功率780 W、溫度90で、提取時間5 min。優(yōu)選的，步驟2)粉碎后的苦參或山豆根與こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑按I g 60mL比例混合。優(yōu)選的，以生物堿苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和氧化槐果堿總量計，步驟
3)苦參生物總堿水溶液濃度為0. 2 0. 3 mg/mL。優(yōu)選的，步驟4)苦參生物總堿水溶液與SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑按I :I的體積比混合。優(yōu)選的，步驟4)攪拌萃取時間為5 min,攪拌反萃取時間為20 min。優(yōu)選的，步驟4)反膠束層與I mol/L KCl溶液按I :1的體積比混合。優(yōu)選的，步驟4)將苦參生物總堿水溶液、SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑混合，攪拌萃取，靜置分相，上層為反膠束層，下層水相重復萃取，合并反膠束層，并與KCl溶液混合，攪拌反萃取，靜置，重復反萃取，合并下層水相，旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得苦參生物總堿粗品。優(yōu)選的，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫氯仿甲醇的體積比為9:1 7:3。優(yōu)選的，薄層層析法以體積比為7:3:0.05的氯仿甲醇濃氨水為展開劑，改良碘化鉍鉀為顯色劑。
本發(fā)明方法采用了こ醇-硫酸銨雙水相體系，不僅加入了極性較小的こ醇，而且加入了強電解質硫酸銨，增強體系的介電常數(shù)，在微波輔助作用下，硫酸銨可瞬間極化，カロ強體系對微波的吸收，可看作是ー個特殊的微波介質。采用該雙水相體系為提取劑，在微波的輔助作用下直接從苦參或山豆根藥材中萃取苦參生物堿，微波可使藥材迅速細胞破壁，苦參生物堿快速溶出后由于雙水相體系選擇性分配的特點，進入上相，實現(xiàn)提取與純化ー體化，大大減少了雜質，簡化了純化步驟。由于雙水相萃取的分離原理是苦參生物堿在上下兩相的選擇性分配，在提取過程中一些極性相近的雜質也可隨苦參生物堿一起分配到上相，因此純化效果不能令人滿意。本發(fā)明應用的SDBS (十二烷基苯磺酸鈉)-異辛烷-正辛醇反膠束體系，其極性內核帶負電荷，調節(jié)PH可使苦參生物堿接受質子帶正電荷，而通過靜電作用力選擇性增溶帶正電荷的苦參生物堿，提高萃取的選擇性，純化效果較雙水相萃取更好。將反膠束萃取與微波輔助萃取、雙水相萃取技術聯(lián)用，即可實現(xiàn)優(yōu)勢互補，可快速簡便的純化苦參生物堿，得到雜質含量低的苦參生物堿粗品。
本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明方法將反膠束萃取與微波輔助萃取、雙水相萃取技術聯(lián)用，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，方法簡單、快速有效、無污染對設備要求低，易于連續(xù)生產和放大，萃取得到的苦參生物堿，總生物堿純度可達90. 92%以上，收率達到55. 38 mg/g(以苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿總量計)；與常規(guī)萃取純化方法比較，產品純度可提高約40%，收率可提高2倍，廣品純度尚，且有機溶劑殘留少。本發(fā)明通過分離純化得到的苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿單體純度可達94%以上，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的得率分別為10. 08%,44. 24%和37. 12%，其純度分別為98. 07%、96. 62% 和 94. 37%。本發(fā)明純化過程使用有機溶劑少，萃取劑可再生重復利用，不僅可節(jié)約成本且減少了環(huán)境污染，更符合緑色化學的要求。本發(fā)明所制備的苦參生物堿產品(苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿)，可廣泛應用于制備抗癌、抗心率失常、抗炎抑菌、抗肝損傷等藥物中，具有廣泛的應用前景。


圖I是本發(fā)明方法提取苦參生物堿技術路線 圖2為分離得到的氧化苦參堿的高效液相色譜 圖3為分離得到的槐定堿的高效液相色譜 圖4為分離得到的苦參堿的高效液相色譜圖。
具體實施例方式下對結合具體的實施例對本發(fā)明作進ー步的說明，但并不局限如此。微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法，包括以下步驟
(I)制備こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑
稱取硫酸銨，加水超聲溶解，并加入一定體積的無水こ醇，攪勻，靜置，分相，得乙醇-硫酸銨雙水相萃取劑，其中的硫酸銨質量分數(shù)為18%，こ醇質量分數(shù)為28%。
(2)制備SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑
將SDBS加入溶劑異辛烷及助溶劑正辛醇(異辛烷與正辛醇體積比為4:1)，超聲溶解后加入濃度為0. 05 mol/L的KCl水溶液，在25°C下以180 r/min恒溫振搖2 h，靜置過夜，得含水量I. 25 mol/L，SDBS濃度為0.05 mol/L，KCl濃度為0. 05 mol/L的SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑。(3)微波輔助雙水相萃取苦參生物堿
將苦參粉碎至80目，與こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑按I g 60 mL混合，在微波功率為780W、溫度為90°C下微波提取5 min，提取液冷卻后，以3500 r/min轉速離心5 min分相，上相旋干。(4)樣品處理
旋干后的殘渣用PH=2的鹽酸溶液溶解(以恰好溶解為宜)，加水稀釋(控制所含苦參堿、 氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和氧化槐果堿的總濃度為0. 2 0. 3 mg/mL)，調節(jié)pH至5，得苦參生物總堿水溶液。此步驟得到的苦參生物總堿水溶液經HPLC分析，得總生物堿收率高達55. 38 mg/g (即每克苦參提取到55. 38毫克總生物堿)，純度均可達90. 92%以上(即總生物堿中各生物堿的純度均可達90. 92%以上)，所述總生物堿由苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和氧化槐果堿五種生物堿組成?？梢姡景l(fā)明將反膠束萃取與微波輔助萃取、雙水相萃取技術聯(lián)用能達到較高提取率，較高純度。(5)反膠束萃取分離苦參生物總堿
將苦參生物總堿水溶液、SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑按I :1體積比混合，在室溫下電磁攪拌萃取5 min，靜置分相，重復萃取一次，將合并的上層反膠束層與I mol/L KCl溶液按I :1體積比混合，攪拌反萃取20 min，靜置，重復反萃取兩次，合并下層水相，將下層水相旋轉蒸發(fā)，加入甲醇鹽祈，過濾，洗滌，取濾液旋干，真空干燥得苦參生物總堿粗品。(6)苦參生物總堿的分離純化
采用硅膠柱層析法分離精制苦參生物堿。干法上樣準確稱取2. 5 g苦參生物總堿粗品，加入5 gl00目硅膠，溶于氯仿-甲醇(V/V=9:1)中，攪勻，水浴揮干得到樣品膠(棕色)。在層析柱下端裝入脫脂棉，取50 g 300 400目硅膠，氯仿溶解，邊攪拌邊裝入層析柱中，洗耳球敲實。打開閥，使上端液面與硅膠面相切，關閥，均勻裝入樣品膠后再在上層裝入一層2 3 cm硅膠。洗脫采用氯仿甲醇=9:1 7:3 (V/V)進行洗脫，分別收集洗脫液。各洗脫液采用薄層層析法(TLC)法點樣分析，以氯仿-甲醇-濃氨水(氯仿甲醇濃氨水體積比為7:3:0. 05)為展開劑，以改良碘化鉍鉀為顯色劑。依據TLC分析結果，合并各洗脫液，減壓濃縮，水浴揮干，稱重。以石油醚重結晶苦參堿，正己烷重結晶槐定堿，氧化苦參堿以丙酮重結晶，結晶經低溫真空干燥分別得苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿単體。(8)反膠束溶液的純化再生
取反萃取后上層反膠束層置于具塞三角瓶中，按含水量I. 25 mol/L，滴加適量的水于三角瓶中，在25で下以180 r/min振搖2 h，再轉入分液漏斗中靜置，放出下層微量水，重復操作兩次，得純化后的反膠束體系。取該純化后的反膠束按(5)相同方法重復用于苦參生物堿的萃取分離。實施例分離得到的苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿3種單體經紅外光譜分析和標準品對比，證明為與標準品為同一物質。實施例將苦參生物總堿粗品通過硅膠柱層析法進行純化，獲得了苦參堿、槐定堿以及氧化苦參堿3種苦參生物堿單體，通過HPLC及紅外光譜分析、標準品確證，分離結果見表I和圖I。圖2 圖4分別為分離得到的氧化苦參堿、槐定堿和苦參堿3種單體的高效液相色譜圖。
權利要求
1.微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法，包括以下步驟 1)制備こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑，其中硫酸銨質量分數(shù)為18%，こ醇質量分數(shù)為28%；制備SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑； 2)將苦參或山豆根粉碎，與こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑混合，微波輔助提取，提取液冷卻后，離心分相，上相旋干； 3)旋干后的殘渣用酸溶解，水稀釋并調節(jié)pH至5，得苦參生物總堿水溶液； 4)將苦參生物總堿水溶液、SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑混合，攪拌萃取，靜置分相，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與KCl溶液混合，攪拌反萃取，靜置，合并下層水相，旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得苦參生物總堿粗品； 5)采用硅膠柱層析法分離苦參生物總堿粗品，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，收集洗脫液，采用薄層層析法合并各洗脫液，濃縮，分別重結晶，真空干燥，得苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿單體。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于=SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑中含水量為I. 25 mo I/LjSDBS濃度為0. 05mol/L,KCl濃度為0. 05 mo I/L，異辛烷、正辛醇的體積比4 :1。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)微波輔助提取條件微波功率780W、溫度90で、提取時間5 min。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)粉碎后的苦參或山豆根與こ醇-硫酸銨雙水相萃取劑按I g 60 mL比例混合。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于以生物堿苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿和氧化槐果堿總量計，步驟3)苦參生物總堿水溶液濃度為0. 2 0. 3 mg/mL。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)苦參生物總堿水溶液與SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑按I :1的體積比混合。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在干步驟4)攪拌萃取時間為5min，攪拌反萃取時間為20 min。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)反膠束層與Imol/L KCl溶液按I 1的體積比混合。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)將苦參生物總堿水溶液、SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束萃取劑混合，攪拌萃取，靜置分相，上層為反膠束層，下層水相重復萃取，合并反膠束層，并與KCl溶液混合，攪拌反萃取，靜置，重復反萃取，合并下層水相，旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得苦參生物總堿粗品。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫氯仿甲醇的體積比為9:1 7:3。
全文摘要
本發(fā)明公開了微波輔助雙水相-反膠束萃取分離苦參生物堿的方法，以苦參或山豆根藥材為原料，利用微波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系進行萃取，苦參生物堿在雙水相間分配萃取到上相，得到初步純化；再利用SDBS-異辛烷-正辛醇反膠束體系對苦參生物堿選擇性萃取，得到雜質含量低的苦參生物堿粗品，然后分離純化得苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿。本發(fā)明方法將反膠束萃取與微波輔助萃取、雙水相萃取技術聯(lián)用，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，方法簡單、快速有效、無污染對設備要求低，易于連續(xù)生產和放大，萃取得到的苦參生物堿，純度可達90.92%以上，其收率高達55.38mg/g；本發(fā)明分離純化得到的苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿單體純度高，達94%以上，且有機溶劑殘留少。
文檔編號A61K36/489GK102772483SQ201210257210
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權日2012年7月24日
發(fā)明者范華均 申請人:廣東藥學院