專利名稱：抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物在制備抑制或去除腫瘤細(xì)胞中雙微體藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物在制備抑制或去除腫瘤細(xì)胞中雙微體藥物中的應(yīng)用。通過去除腫瘤細(xì)胞中雙微體數(shù)目、減少雙微體攜帶癌基因擴(kuò)增而有效降低含有雙微體的惡性腫瘤細(xì)胞的惡性程度。本發(fā)明屬于腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙微體(doubleminutes 或 double minute chromosomes, DMs)是只存在于腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中的基因擴(kuò)增的主要細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志，為細(xì)胞中位于染色體外、小的、成對(duì)存在的無中心粒的染色質(zhì)小體，是染色體外遺傳單位的一種主要存在形式。1962年首次在一些惡性腫瘤細(xì)胞和滲出液及肺癌胸水的轉(zhuǎn)移細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種染 色體外的微體。目前已在白血病、惡性淋巴瘤等多種血液系統(tǒng)腫瘤，和肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤等實(shí)體性腫瘤中都可檢測(cè)到雙微體，雙微體是惡性腫瘤基因擴(kuò)增的主要的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記。不同類型的腫瘤細(xì)胞中雙微體具有較高的異質(zhì)性，攜帶癌基因和多藥耐藥性基因擴(kuò)增使細(xì)胞具有選擇優(yōu)勢(shì)，這些基因的擴(kuò)增是導(dǎo)致癌癥發(fā)生，發(fā)展，及癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要元素。減少或去除細(xì)胞內(nèi)的雙微體，從而減少癌基因和耐藥基因的擴(kuò)增及其蛋白的功能，是一種有效的減少癌細(xì)胞惡性的方法。從腫瘤細(xì)胞中消除雙微體上擴(kuò)增的癌基因和耐藥基因，能夠降低其致癌性或恢復(fù)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，因此，去除雙微體是治療以基因擴(kuò)增為標(biāo)志的疾病的可行途徑。目前羥基脲應(yīng)用于腫瘤治療，但對(duì)腫瘤并沒有較強(qiáng)的特異性，羥基脲半衰期短，高劑量，易產(chǎn)生快速耐受性。針對(duì)腫瘤的特點(diǎn)進(jìn)行特異性治療可以提高腫瘤治療的敏感性和特異性，有的放矢，我們針對(duì)腫瘤細(xì)胞最基本特征，即增殖能力強(qiáng)這一特點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行干預(yù)，預(yù)通過減少腫瘤細(xì)胞中雙微體數(shù)目和攜帶癌基因和耐藥基因擴(kuò)增，從而控制腫瘤細(xì)胞的惡性程度，針對(duì)腫瘤細(xì)胞中雙微體的靶向性治療將會(huì)成為一種新的腫瘤治療策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)目前腫瘤治療的效果欠佳，從而提供一種針對(duì)含有雙微體的腫瘤的靶向生物治療策略，通過選擇抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物去除細(xì)胞中雙微體數(shù)目和攜帶基因擴(kuò)增而降低含有雙微體的腫瘤細(xì)胞的惡性程度。本發(fā)明針對(duì)含有雙微體的腫瘤細(xì)胞，選擇抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物吉西他濱、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇低濃度作用，其劑量低于對(duì)照組羥基脲上千倍，發(fā)現(xiàn)吉西他濱、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇可通過去除細(xì)胞中的雙微體數(shù)目和減少攜帶癌基因擴(kuò)增，而有效降低含有雙微體的腫瘤細(xì)胞的惡性程度。因此，本發(fā)明提出了抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物在制備抑制或去除腫瘤細(xì)胞中雙微體藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的化合物為吉西他濱、喜樹堿、苦參堿或紫杉醇其中至少一種或其組合。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為I、檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)特征選擇含有雙微體的人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598為研究對(duì)象。(I)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)；(2)細(xì)胞中期核型標(biāo)本制備以及檢測(cè)細(xì)胞株含有雙微體的信息。2、細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑對(duì)細(xì)胞中雙微體的影響
選用低濃度各種細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑持續(xù)作用此種細(xì)胞，優(yōu)化條件，檢測(cè)細(xì)胞中雙微體的變化。選用4種與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)的抑制劑①吉西他濱，核糖核苷酸還原酶抑制劑，作用于細(xì)胞周期DNA合成期(購自法國禮來公司)10-羥基喜樹堿，選擇性抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topol)(購自上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司)；③苦參堿，阻滯細(xì)胞在G0/G1期，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II (Τ0Ρ0 II)(購自中國蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司)；④紫杉醇，微管穩(wěn)定劑，抑制細(xì)胞有絲分裂，停止在細(xì)胞周期G2期和M期(購自上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司)。以已知有作用的羥基脲(購自上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司)作為陽性對(duì)照。(I)雙微體數(shù)目檢測(cè)抑制劑作用后，按照常規(guī)方法進(jìn)行中期核型制備，計(jì)數(shù)50-100個(gè)核型中的雙微體數(shù)目。(2)雙微體攜帶基因擴(kuò)增水平檢測(cè)已知人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598細(xì)胞中雙微體上攜帶EIF5A2和MYCN基因擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)方法檢測(cè)抑制劑作用下EIF5A2和MYCN基因的擴(kuò)增水平。3、細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(I)繪制細(xì)胞生長曲線檢測(cè)加入抑制劑作用后的細(xì)胞增殖能力變化；(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)加入抑制劑后的細(xì)胞周期變化；分別收集加入抑制劑和對(duì)照組細(xì)胞，依cycle TEST PLUS DNA試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的改變。(3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制劑作用后的細(xì)胞克隆形成能力；(4)侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。應(yīng)用BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber對(duì)抑制劑和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行重
組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)。由此方案可特異性地選擇細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑作用含有雙微體的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑通過減少細(xì)胞中雙微體的數(shù)目而有效降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度。本發(fā)明的方法的有益效果是對(duì)于雙微體陽性的腫瘤細(xì)胞的生物治療提供新的靶向性治療方案，提高治療的特異性。針對(duì)含有雙微體的腫瘤細(xì)胞，通過用細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑作用可以減少腫瘤細(xì)胞中的雙微體數(shù)目及攜帶癌基因的擴(kuò)增，從而有效降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度。


圖I是人卵巢癌UACC-1598及4號(hào)單克隆細(xì)胞中期染色體核型分析圖；圖2是人卵巢癌UACC-1598及4號(hào)單克隆細(xì)胞雙微體數(shù)目統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖；圖3是羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞中雙微體數(shù)目統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖；圖4是喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用后的卵巢癌細(xì)胞中雙微體數(shù)目統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖；圖5是羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞雙微體攜帶基因擴(kuò)增實(shí)時(shí)定量PCR柱狀圖；圖6是喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用后的卵巢癌細(xì)胞雙微體攜帶基因擴(kuò)增實(shí)時(shí)定量PCR柱狀圖； 圖7是羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞生長曲線圖；圖8是喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用后卵巢癌細(xì)胞生長曲線圖；圖9是羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力統(tǒng)計(jì)圖；圖10是喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用后卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力統(tǒng)計(jì)圖；圖11是羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞的重組基底膜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例I、檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)特征選擇含有雙微體的人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598為研究對(duì)象。為了解人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598含有雙微體的情況，首先制備中期染色體標(biāo)本。將處于對(duì)數(shù)生長期的UACC-1598細(xì)胞加入終濃度為O. 01 μ g/mL的秋水仙素，37°C繼續(xù)培養(yǎng)l_2h，將細(xì)胞用吸管吹打下來，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中1000r/min離心8min,PBS沖洗兩次,加入37°C預(yù)熱的O. 075mol/L的KCL，在37°C水浴中低滲作用ll_15min，逐滴加入ImL新鮮固定液(甲醇冰醋酸=3:1)進(jìn)行預(yù)固定，1500r/min離心5min,棄上清加入IOmL固定液,輕輕混勻，室溫固定30min, 1500r/min離心5min,重復(fù)一次,棄上清，加入適當(dāng)固定液混勻，將細(xì)胞懸液以一定高度滴于預(yù)冷的載玻片上，室溫晾干。Giemsa染液染色5min,流水沖洗,晾干。置于顯微鏡下觀察，拍照。我們從培養(yǎng)的UACC-1598細(xì)胞中分離含有雙微體多的單克隆細(xì)胞株，UACC-1598-4，如圖I所示為典型的細(xì)胞中期分裂相(箭頭所示為雙微體)，來說明接下來的抑制劑作用對(duì)雙微體減少的影響更為顯著。計(jì)數(shù)50-100個(gè)UACC-1598細(xì)胞和UACC-1598-4細(xì)胞分裂相中的雙微體數(shù)目，結(jié)果如圖2所示。由此，選擇含有雙微體的細(xì)胞株UACC-1598-4為研究對(duì)象進(jìn)行研究。實(shí)施例2、細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑對(duì)細(xì)胞中雙微體的影響細(xì)胞中雙微體的產(chǎn)生及維持存在是隨細(xì)胞周期進(jìn)行的一種緩慢過程和狀態(tài)。優(yōu)化條件后用低濃度細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)分別以終濃度為150 μ M和5/10/20nM持續(xù)作用卵巢癌細(xì)胞UACC-1598-42周、喜樹堿以Ing/mL的終濃度作用卵巢癌細(xì)胞UACC-1598-43周、苦參堿以31. 25ng/mL的終濃度作用卵巢癌細(xì)胞UACC-1598-42周、紫杉醇以O(shè). 05ng/mL的終濃度作用卵巢癌細(xì)胞UACC-1598-41周，細(xì)胞在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，檢測(cè)對(duì)卵巢癌中雙微體的影響。I、雙微體數(shù)目檢測(cè)按上述劑量和時(shí)間采用細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑作用卵巢癌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中雙微體的數(shù)目情況。結(jié)果通過分別計(jì)數(shù)每組60-100例中期分裂相的雙微體，我們檢測(cè)到在加入羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇持續(xù)作用卵巢癌細(xì)胞后，雙微體數(shù)目明顯減少，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析SNK兩兩比較法(Student-Newman-Neuls), P〈0. 05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3和4)。通過以上實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用可減少腫瘤細(xì)胞中的雙微體數(shù)目，說明細(xì)胞進(jìn)程抑制劑可減少腫瘤細(xì)胞中的雙微體數(shù) 目。2、雙微體攜帶基因水平檢測(cè)已知UACC-1598-4細(xì)胞中雙微體上攜帶EIF5A2和MYCN基因擴(kuò)增，接下來，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)抑制劑作用下EIF5A2和MYCN基因的擴(kuò)增水平。①實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)雙微體攜帶基因擴(kuò)增水平按上述劑量和時(shí)間各種抑制劑作用后，按QIAamp DNA Extract Kit說明書操作提取細(xì)胞總DNA。檢測(cè)已知的UACC-1598-4細(xì)胞中雙微體上攜帶的基因EIF5A2和MYCN的DNA擴(kuò)增水平。檢索NCBI Gene數(shù)據(jù)庫，獲得EIF5A2和MYCN基因序列，應(yīng)用Primer3. O software設(shè)計(jì)并合成基因特異性引物。所用引物由Invitrogen公司合成,序列如下hMYCN-F :5’-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3’hMYCN-R :5，-GCAACGGCATTCTCTCAG-3’hEIF5A2-F :5’-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3’hEIF5A2-R :5’-ACAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3’hACTB-F :5，-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3’ hACTB-R : 5，-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3’將qPCR反應(yīng)體系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型熒光定量PCR儀SYBR Green I/HRM Dye (465-510)系統(tǒng)下運(yùn)行。每一樣本測(cè)量3次，按照說明書提供的最佳反應(yīng)條件，94°C 4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，共 45 個(gè)循環(huán)；EIF5A2 和 MYCN 的 DNA擴(kuò)增水平以ACTB為內(nèi)參進(jìn)行比較，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)方差分析SNK兩兩比較法(Student-Newman-Neuls)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如圖5和6所示，羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用后，與對(duì)照組相比，EIF5A2和MYCN的DNA擴(kuò)增水平明顯下降。說明抑制劑會(huì)通過減少UACC-1598-4細(xì)胞中雙微體數(shù)目而減少雙微體上攜帶EIF5A2和MYCN的基因擴(kuò)增。3、細(xì)胞周期進(jìn)程抑制劑對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(I)繪制細(xì)胞生長曲線檢測(cè)抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響將加入各種抑制劑和對(duì)照組UACC-1598-4細(xì)胞分別按每孔O. 5 X IO4個(gè)接種入96孔板培養(yǎng)。次日開始每天取3孔計(jì)數(shù)，取平均值作為日平均細(xì)胞數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖7和8所示。與對(duì)照組細(xì)胞相比，加入羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇后細(xì)胞生長速度明顯降低，說明抑制劑可降低細(xì)胞增殖能力。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期用羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作用的卵巢癌細(xì)胞，雙微體數(shù)目及攜帶基因擴(kuò)增減少，細(xì)胞周期是否會(huì)發(fā)生變化，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。分別收集抑制劑作用的卵巢癌細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，胰酶消化，全培養(yǎng)液終止消化，1500r/min離心5min沉淀細(xì)胞,之后用冷的PBS洗3次重懸細(xì)胞，1500r/min離心5min。之后用75%的％冷乙醇，4° C固定過夜(超過24h)，之后再用冷的PBS洗兩遍。依cycleTEST PLUS DNA試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，重復(fù)3次。結(jié)果如表I和表2所示，羥基脲(HU)、吉西他濱(GEM)、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇作 用后，細(xì)胞周期分布中，Gl期細(xì)胞分布減少，S+G2期細(xì)胞分布增多，卡方檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DNA合成減慢，細(xì)胞增殖不旺盛。表I羥基脲(HU)和吉西他濱(GEM)作用后卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布
權(quán)利要求
1.抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物在制備抑制或去除腫瘤細(xì)胞中雙微體藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的化合物為吉西他濱、喜樹堿、苦參堿或紫杉醇其中至少一種或其組合。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物在制備抑制或去除腫瘤細(xì)胞中雙微體藥物中的應(yīng)用，屬于腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明針對(duì)含有雙微體的腫瘤細(xì)胞，選擇抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的化合物吉西他濱、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇進(jìn)行低濃度作用，其劑量低于對(duì)照組羥基脲上千倍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉西他濱、喜樹堿、苦參堿和紫杉醇可通過去除細(xì)胞中的雙微體數(shù)目和減少攜帶癌基因擴(kuò)增，從而有效降低含有雙微體的腫瘤細(xì)胞的惡性程度。本發(fā)明的提出提高了惡性腫瘤治療的特異性，是對(duì)現(xiàn)有治療方案的改進(jìn)，對(duì)于臨床治療具有指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)A61K31/7068GK102755345SQ20121025749
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者于丹紅, 于旸, 傅松濱, 孫冬琳, 孫文靖, 孟祥寧, 金焰, 陳 峰 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)