專利名稱：一種異種骨移植材料的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學生物材料技術領域，具體涉及一種異種骨移植材料的制
備方法。
背景技術：
異種骨是采用動物源性如豬或牛等的骨組織，經(jīng)過處理降低其免疫原性，用作骨移植材料，在臨床上植入患者骨缺損處，起到填充、支撐的作用，并最終改建成宿主的自身骨組織，從而達到治療的目的。公告號為CN1456363，名稱為異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法的專利，公開了一種異 種骨膠原基質(zhì)制備的新方法，但該專利對異種骨膠原的制備方法未做詳述，所提到的部分脫鈣會引起骨材料的力學強度明顯下降；公告號為CN1188015，名稱為新型塊形脫脂去抗原異種骨移植材料及其制備方法的專利，采用脫脂、去抗原及部分脫鈣的方法處理異種骨，骨礦成分與膠原蛋白的含量比例約為I : I，導致所制備材料力學強度明顯下降；公告號為CN1296804，名稱為強力抗感染型重組合異種骨的制備方法的專利，采用抗菌劑與重組合異種骨復合，使材料既有骨誘導活性又有抗感染性，但重組合異種骨要復合骨形態(tài)發(fā)生蛋白，劑量難于控制，加之受體個體差異的不確定性，如果劑量過大容易誘發(fā)骨腫瘤。由此可見現(xiàn)有的異種骨制備方法制備過程大多比較繁瑣，或引入的化學試劑過多容易引起殘留，或清洗效果難以保證，關鍵性的，未有針對性地對異種骨材料進行病毒滅活處理，以確保移植的安全性，都難以提供一種既保留生物活性與力學強度、又安全有效的異種骨移植材料。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對目前異種骨移植材料存在的制備過程繁瑣、清洗效果難以保證、化學物質(zhì)引入過多易發(fā)生殘留、沒有進行病毒滅活等不足，而提供一種方法比較簡單、清洗效果好、既降低了異種骨材料的免疫原性，又能保留骨誘導活性與力學強度的異種骨移植材料的制備方法。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的而采取的技術方案為
一種異種骨移植材料的制備方法，包括以下步驟
1)取材健康合格的動物，生長6個月以上，取其髂骨與四肢長骨，即異種骨；
2)深低溫冷凍將所取異種骨儲存于深低溫冰箱中保存；
3)成型將深低溫冷凍后的異種骨表面軟組織剔除干凈，鋸裁成型；
4)清洗將成型的異種骨浸于水中，超聲條件下清洗2 5次，以骨組織不顯血色為
準；
5)除病毒將步驟(4)所得異種骨，采用次氯酸鈉溶液浸泡，以滅活可能潛在的病毒，每小時換液一次，然后用水在超聲條件下清洗2 5次；
6)脫脂將步驟(5)所得異種骨，用碳酸鈉溶液進行脫脂清洗，每小時換液一次；
7)酶處理將脫脂后的異種骨，采用胰酶溶液處理；8)清洗經(jīng)胰酶溶液處理的異種骨，在超聲條件下用水清洗干凈；
9)冷凍干燥清洗干凈的異種骨，冷凍干燥至含水的質(zhì)量分數(shù)為2-10%；
10)滅菌凍干的異種骨，用不少于兩層袋包裝后，進行鈷-60Y射線輻照滅菌。其中所述的深低溫保存條件為-70度以下保存不少于I個月。所述的次氯酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)為O. 05% 5%，處理時間為O. 5 16小時。所述的碳酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)為O. 05% 5%，水溫35 70度，處理時間為O. 5 20小時。所述的胰酶溶液的濃度為O. I 10g/L，水溫30 60度，處理時間為O. 5 20小時。
所述的冷凍干燥至含水量為5%。所述的鈷-60 Y射線輻照滅菌劑量為15 30kGy。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下有益效果
(1)本發(fā)明采用深低溫冷凍的方法保存異種骨，降低了其免疫原性；
(2)本發(fā)明采用超聲條件下清洗的辦法，提高了清洗的效率與效果；
(3)本發(fā)明采用次氯酸鈉溶液對異種骨組織進行病毒滅活，杜絕病毒傳播的可能性；
(4)本發(fā)明采用碳酸鈉溶液進行脫脂，脫脂效果好，并且不引入其它可能對人健康有影響的化學試劑；
(5)本發(fā)明進一步采用酶處理異種骨，對其膠原結構進行切割，進一步降低其免疫原性。
圖I是實施例I制備的豬源性異種骨數(shù)碼照片；
圖2是實施例I制備的豬源性異種骨放大25倍的掃描電鏡 圖3是實施例I制備的豬源性異種骨放大2000倍的掃描電鏡 圖4是新鮮豬源性異種骨放大了 200倍的光學顯微鏡 圖5是實施例I制備的豬源性異種骨放大200倍的光學顯微鏡圖，
圖6是實施例I制備的豬源性異種骨體外細胞毒性試驗的細胞生長曲線圖。
具體實施例方式實施例I
一種異種骨移植材料的制備方法，包括以下步驟
1)取材健康合格的豬，生長7個月，取其髂骨與四肢長骨，即豬源性異種骨；
2)深低溫冷凍將所取豬源性異種骨儲存于深低溫冰箱中在-70度保存I個月；
3)成型將深低溫冷凍后的豬源性異種骨表面軟組織剔除干凈，鋸裁成5mm X 5mm X 20mm 的骨條；
4)清洗將成型的豬源性異種骨浸于純化水中，超聲條件下清洗2次使骨組織不顯血
色；
5)除病毒將步驟(4)所得豬源性異種骨，采用質(zhì)量分數(shù)為O.05%的次氯酸鈉溶液浸泡16小時，以滅活可能潛在的病毒，每小時換液一次，然后用純化水在超聲條件下清洗3次；6)脫脂將步驟(5)所得豬源性異種骨，用溫度為35度，質(zhì)量分數(shù)為O.05%的碳酸鈉溶液進行脫脂清洗20小時,每小時換液一次；
7)酶處理將脫脂后的豬源性異種骨，采用溫度為30度，濃度為O.lg/L的胰酶溶液處理20小時；
8)清洗經(jīng)胰酶溶液處理的豬源性異種骨，在超聲條件下用純化水清洗干凈；
9)冷凍干燥清洗干凈的豬源性異種骨，用冷凍干燥機冷凍干燥至含水的質(zhì)量分數(shù)為
2% ；
10)滅菌凍干的豬源性異種骨，用不少于兩層袋包裝后，進行鈷-60Y射線輻照滅菌，輻照滅菌劑量為15kGy。進了進一步表明本實施例制備的豬源性異種骨的各種性能，本實施例還做了如下 實驗
I、觀察其形態(tài)結構以及清洗的效果。附圖I是利用數(shù)碼相機對本實施例制備的豬源性異種骨拍照進行大體觀察，同時采用離子濺射儀對豬源性異種骨表面噴金后，用JSM6360LV低真空掃描電子顯微鏡觀察，掃描拍片，Smile View軟件分析測量其腔隙直徑，附圖2是異種骨放大25倍的掃描電鏡圖，附圖3是放大了 2000倍的掃描電鏡圖。圖I、圖2和圖3的觀察結果顯示，與人松質(zhì)骨結構相似，本實施例制備的豬源性異種骨呈蜂窩狀三維多孔網(wǎng)狀立體結構，孔隙分布均勻，材料的腔隙直徑大小在150 μ m-600 μ m之間，在其松質(zhì)骨小梁上有大量直徑在IOym -100 μ m的小孔，這樣的三維孔隙結構，植入體內(nèi)時，有利于宿主組織與細胞的長入、營養(yǎng)成分的進入，便于宿主成骨相關細胞的遷徙、貼附與長入，進而發(fā)生爬行取代。制備的豬松質(zhì)骨清洗徹底，無軟組織與細胞組分的殘留。2、組織學觀察
將新鮮的異種骨和本實施例制備的豬源性異種骨，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察其顯微結構，從而觀察處理與清洗的效果，以及處理方法對異種骨組織的顯微結構的影響。附圖4是新鮮異種骨光學顯微鏡圖，附圖5是本實施例制備的豬源性異種骨光學顯微鏡圖，從兩個附圖可以看出，制備出來的異種骨材料清洗效果好，顯微結構保持良好。3、異種骨力學強度檢測，目的是比較制備過程對異種骨材料的力學強度是否影響。表I是將本實施例制備的豬源性異種骨加工成IOmmX IOmmX 20mm的骨塊，于處理的不同階段取材，分新鮮豬骨組、次氯酸鈉處理組、胰酶處理后組、凍干輻照組，用RGT-20A微機控制電子萬能材料試驗機檢測樣品的抗壓性能，試驗條件為室溫，濕度為30%，加載速度為 5mm/min0表I異種骨力學強度檢測數(shù)據(jù)
權利要求
1.一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是包括以下步驟 1)取材健康合格的動物，生長6個月以上，取其髂骨與四肢長骨，即異種骨； 2)深低溫冷凍將所取異種骨儲存于深低溫冰箱中保存； 3)成型將深低溫冷凍后的異種骨表面軟組織剔除干凈，鋸裁成型； 4)清洗將成型的異種骨浸于水中，超聲條件下清洗2 5次，以骨組織不顯血色為準； 5)除病毒將步驟(4)所得異種骨，采用次氯酸鈉溶液浸泡，以滅活可能潛在的病毒，每小時換液一次，然后用水在超聲條件下清洗2 5次； 6)脫脂將步驟(5)所得異種骨，用碳酸鈉溶液進行脫脂清洗，每小時換液一次； 7)酶處理將脫脂后的異種骨，采用胰酶溶液處理； 8)清洗經(jīng)胰酶溶液處理的異種骨，在超聲條件下用水清洗干凈； 9)冷凍干燥清洗干凈的異種骨，冷凍干燥至含水的質(zhì)量分數(shù)為2-10%；10)滅菌凍干的異種骨，用不少于兩層袋包裝后，進行鈷-60Y射線輻照滅菌。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的深低溫保存條件為-70度以下保存不少于I個月。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的次氯酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)為O. 05% 5%，處理時間為O. 5 16小時。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的碳酸鈉溶液的質(zhì)量分數(shù)為O. 05% 5%，水溫35 70度，處理時間為O. 5 20小時。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的胰酶溶液的濃度為O. I 10g/L，水溫30 60度，處理時間為O. 5 20小時。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的冷凍干燥至含水量為5%。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種異種骨移植材料的制備方法，其特征是所述的鈷-60Y射線輻照滅菌劑量為15 30kGy。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學生物材料技術領域，具體涉及一種異種骨移植材料的制備方法。本發(fā)明主要解決目前異種骨移植材料存在的制備過程繁瑣、清洗效果難以保證、化學物質(zhì)引入過多易發(fā)生殘留、沒有進行病毒滅活等不足。本發(fā)明一種異種骨移植材料的制備方法包括取材、深低溫冷凍、成型、清洗、除病毒、脫脂、酶處理、清洗、冷凍干燥和滅菌十個步驟，本發(fā)明的制備方法具有方法簡單、清洗效果好、既降低了異種骨材料的免疫原性，又能保留骨誘導活性與力學強度的優(yōu)點。
文檔編號A61L27/36GK102755665SQ20121026732
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權日2012年7月31日
發(fā)明者張育敏, 李寶興, 李寶明, 李靖, 楊婷, 陳學英 申請人:中國輻射防護研究院