專(zhuān)利名稱(chēng)：防治胰島素抵抗和糖尿病的方法和試劑的制作方法
防治胰島素抵抗和糖尿病的方法和試劑技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及防治胰島素抵抗和糖尿病的方法和試劑。
背景技術(shù)：
糖尿病主要分為I型糖尿病和2型糖尿病兩種類(lèi)型。I型糖尿病是由于自身免疫系統(tǒng)紊亂，引起胰腺中胰島β細(xì)胞受損，導(dǎo)致胰島素分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，90%以上的糖尿病患者屬于2型糖尿病，其特點(diǎn)是胰島素刺激的靶組織出現(xiàn)胰島素抵抗癥狀，即胰島素相對(duì)不足。在正常情況下，胰島β細(xì)胞分泌的胰島素對(duì)于血糖水平的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用。胰島素通過(guò)促進(jìn)肌肉組織和脂肪組織對(duì)葡萄糖的吸收，同時(shí)抑制肝臟組織的糖異生來(lái)降低血糖水平。而在胰島素抵抗情況下，正常濃度的胰島素不能達(dá)到預(yù)期的降糖效果，機(jī)體不得不產(chǎn)生更多的胰島素來(lái)補(bǔ)償，從而維持血糖濃度的穩(wěn)定。當(dāng)β細(xì)胞分泌的胰島素不能滿足這種補(bǔ)償時(shí)，就會(huì)引起高血糖癥，表現(xiàn)為糖耐量和空腹血糖值異常，繼而引發(fā)胰島β細(xì)胞凋亡，最終發(fā)展成為2型糖尿病。可見(jiàn)，胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用。
胰島素抵抗與肥胖及靜坐的生活方式密切相關(guān)，是一種涉及多個(gè)組織器官的代謝疾病，其發(fā)病機(jī)制目前還不是完全清楚。已有的研究認(rèn)為，血液循環(huán)中的激素、細(xì)胞因子、來(lái)源于脂肪等組織的脂肪酸和葡萄糖等能源物質(zhì)與胰島素抵抗密切相關(guān)。例如，脂肪組織中脂質(zhì)的過(guò)度積累，能誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞本身對(duì)胰島素抑制的脂解作用的抵抗，這將導(dǎo)致脂肪組織釋放出更多脂肪酸和甘油進(jìn)入血液循環(huán)，繼而誘導(dǎo)肌肉和肝臟的胰島素抵抗。2型糖尿病的動(dòng)物模型中，自發(fā)突變型肥胖癥的純合子小鼠(ob/ob和db/db)被公認(rèn)為具有重要價(jià)值， 它們會(huì)在出生后2-8周先后表現(xiàn)出高胰島素血癥、高血糖和β細(xì)胞功能下降等與人類(lèi)2型糖尿病相似的癥狀。
在分子水平，胰島素通過(guò)胰島素信號(hào)通路行使其生物功能。胰島素信號(hào)通路由一個(gè)復(fù)雜、高度整合的網(wǎng)絡(luò)組成。概括起來(lái)，胰島素結(jié)合到胰島素受體后，激發(fā)其受體酪氨酸激酶活性，使其磷酸化胰島素受體底物(Insulin receptor substrate, IRS),激活的IRS隨后通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮其代謝調(diào)控作用。目前研究表明，胰島素抵抗可能通過(guò)以下幾種機(jī)制抑制胰島素信號(hào)通路①蛋白水平的下調(diào)，包括促進(jìn)通路中重要蛋白質(zhì)的降解，抑制其轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯。例如有報(bào)道顯示SREBP-Ic能抑制IRS-2的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致IRS-2蛋白水平下調(diào)。②蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，抑制其活性。例如胰島素受體和IRS能被PKC、S6K1、ERK、 JNK及ΙΚΚβ等激酶磷酸化絲氨酸殘基，抑制胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。③促進(jìn)胰島素信號(hào)通路抑制酶的酶活或表達(dá)，包括酪氨酸磷酸酶ΡΤΡ1Β、ΡΙΡ3的磷酸酶PTEN、SHIP等。④信號(hào)通路中的重要蛋白和其抑制蛋白的結(jié)合。例如炎性細(xì)胞因子IL-6等能上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)通路的抑制子(Suppressor of cytokine signaling, S0CS)的蛋白表達(dá),SOCS能結(jié)合到胰島素受體抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆病中最常見(jiàn)的一種，是一種以記憶能力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常為特征的慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增大而增加。
AD的主要病理特征是大腦內(nèi)出現(xiàn)以沉積的Αβ為中心的淀粉樣斑塊(amyloid plaque),或稱(chēng)老年斑(senile plaque)和由高度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau蛋白形成的神經(jīng)絲纏結(jié)(neurofibrillary tangle)。Αβ是細(xì)胞一種正常的代謝產(chǎn)物，能在其受體幫助下透過(guò)血腦屏障。健康人血液和腦脊液中的Αβ濃度處于一種平衡狀態(tài)。大量證據(jù)支持Αβ是AD的主要致病因子。目前被廣泛接受的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)(Amyloid cascade hypothesis)認(rèn)為,Αβ在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著主導(dǎo)作用，腦中Aβ的生成和清除的失衡， 使得Αβ在腦中積累，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元和其突觸功能的損傷，最終造成認(rèn)知的損害。
目前認(rèn)為A β主要由腦中的神經(jīng)元產(chǎn)生。A β由APP經(jīng)過(guò)β -分泌酶和Y -分泌酶酶解形成。由于Y-分泌酶的切割位點(diǎn)不同，主要產(chǎn)生兩種形式Αβ40和Αβ42。Αβ42 的聚集能力較強(qiáng)因而毒性也較大。APP和Y-分泌酶分布都相對(duì)廣泛，在很多組織中都有表達(dá)。分泌酶最初認(rèn)為只在腦中的神經(jīng)元高表達(dá)，但近來(lái)有研究顯示，分泌酶也表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和其它外周的細(xì)胞，例如脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞，這提示外周組織也可能產(chǎn)生 A β ο
研究表明，在外周組織能檢測(cè)到Αβ。Joachim等最先報(bào)道在AD病人的血管、皮膚、皮下組織和腸等非神經(jīng)組織檢測(cè)到Αβ沉積，在一部分正常的老年個(gè)體中也能在非神經(jīng)組織檢測(cè)到Αβ的沉積。Lee等報(bào)道在正常人皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪中都能檢測(cè)到Αβ的沉積。另外，包涵體肌炎的病灶處也能檢測(cè)到Αβ。這些沉積的Αβ，可能是由腦中產(chǎn)生，再經(jīng)過(guò)循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送到外周，也有可能是由外周的細(xì)胞產(chǎn)生的。但目前的研究都只檢測(cè)到外周Αβ，而它們有什么功能還不清楚，血漿中的Αβ濃度本身也并不適合作為AD的生物標(biāo)記 (Liu, J. K. , et al. , J Alzheimers Dis. 2010; 20 (4) : 1233-42.)。
除Αβ外目前還發(fā)現(xiàn)多種淀粉樣蛋白(Amyloid protein),其在各種器官和組織的異常沉積會(huì)造成系列病變。截至2010年，已知的淀粉樣蛋白有27種，其中公認(rèn)為與糖尿病有密切關(guān)系的是胰島淀粉樣多肽(IAPP)，IAPP是胰島β細(xì)胞分泌的一種正常產(chǎn)物，含37 個(gè)氨基酸，但與Αβ在序列和剪切機(jī)制上大為不同。尸體病理解剖檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，90%的2型糖尿病患者胰島中有IAPP沉積，伴β細(xì)胞數(shù)量減少，且胰島淀粉樣變性程度與糖尿病的病變程度一致，說(shuō)明IAPP與2型糖尿病發(fā)病相關(guān)。人源IAPP可誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，且二者呈劑量相關(guān)性。轉(zhuǎn)入人源IAPP基因的純合子肥胖小鼠在高糖、高脂飲食、生長(zhǎng)激素或糖皮質(zhì)激素處理后胰島內(nèi)很快出現(xiàn)大量IAPP變性沉積，β細(xì)胞凋亡水平大于復(fù)制水平，數(shù)量下降， 最終發(fā)展為2型糖尿病。這些證據(jù)表明，IAPP在胰島中變性沉積，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡，數(shù)量減少是2型糖尿病致病機(jī)制之一。但沒(méi)有在先證據(jù)顯示，同為淀粉樣蛋白的Αβ在胰島素的靶組織如肝臟等能誘導(dǎo)2型糖尿病的另一特征胰島素抵抗，或者A β在2型糖尿病的發(fā)病中具有與IAPP類(lèi)似的功能。
流行病學(xué)的研究顯示，糖尿病患者相對(duì)于正常人有高約兩倍的罹患AD的風(fēng)險(xiǎn)。雖然其機(jī)理目前仍不清楚，有人認(rèn)為糖尿病能影響A β的代謝。例如Ho等報(bào)道在AD模型小鼠中用高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗能顯著增加Αβ 40和Αβ 42的生成，同時(shí)腦中老年斑的沉積加劇，學(xué)習(xí)記憶能力的損害也惡化。Cao等報(bào)道在AD模型小鼠中用糖水誘導(dǎo)胰島素抵抗，腦中老年斑的沉積也加劇，主要是由于腦中沉積的A β 42增高了約2倍，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了學(xué)習(xí)記憶能力的損害惡化。但是Takeda等的研究表明，AD模型小鼠與2型糖尿病模型小鼠雜交的后代，顯示學(xué)習(xí)記憶能力的損害發(fā)生加劇，腦中Αβ的總量沒(méi)有變化，而是顯示腦血管出現(xiàn)炎性并伴隨淀粉樣血管病變。
綜上，盡管現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于糖尿病或胰島素抵抗與AD的關(guān)系有過(guò)研究，然而還沒(méi)有明確的、可信的結(jié)論，在機(jī)理也不明確。因此，本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步地研究Aβ與糖尿病或胰島素抵抗的相關(guān)性，并找到有用的、適于藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供防治胰島素抵抗和糖尿病的方法和試劑。
在本發(fā)明的第一方面，提供抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路激活，抑制JAK2/ STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)或活性，或抑制淀粉樣蛋白β的表達(dá)或活性的抑制劑的用途，用于制備防治或緩解胰島素抵抗或糖尿病的藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述的JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白包括JAK2蛋白， STAT3蛋白或S0CS-1蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路激活是淀粉樣蛋白 β (Αβ)導(dǎo)致的JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路激活。
在另一優(yōu)選例中，所述的淀粉樣蛋白β (Αβ)包括全長(zhǎng)的淀粉樣蛋白β，或其蛋白片段。更佳地，所述的蛋白片段選自Αβ40、Αβ42、Αβ 25-35等。
在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括(但不限于)
特異性干擾JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的干擾分子(如小干擾RNA分子或反義核苷酸)；或
特異性與JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白結(jié)合的結(jié)合分子(如抗體或配體)； 或
抑制JAK2 的 AG490 ;或
特異性干擾淀粉樣蛋白β或其前體蛋白表達(dá)的干擾分子(如小干擾RNA分子或反義核苷酸)；或
特異性與淀粉樣蛋白β結(jié)合的結(jié)合分子(如抗體或配體)；或
β -分泌酶抑制劑、Y -分泌酶抑制劑和調(diào)節(jié)劑或抗淀粉樣蛋白聚集劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是siRNA，其序列選自SEQ ID N0:2_SEQ IDNO:7 的一種或多種。
在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子具有以下結(jié)構(gòu)
Seq 正向-X-Seq 反向；
其中，核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示;Seq反向?yàn)榕cSeqra互補(bǔ)的序列；
X為位于Seq1自和Seq反自之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq1自和Seq反向不互補(bǔ)。
在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是腺病毒表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子可形成以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路激活，抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)或活性，或抑制淀粉樣蛋白β的表達(dá)或活性的抑制劑的用途，用于制備防治或緩解胰島素抵抗或糖尿病的藥物。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑包括特異性干擾JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的干擾分子；或特異性與JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白結(jié)合的結(jié)合分子；或抑制JAK2的AG490 ;或特異性干擾淀粉樣蛋白β或其前體蛋白表達(dá)的干擾分子；或特異性與淀粉樣蛋白β結(jié)合的結(jié)合分子；或β-分泌酶抑制劑、Y -分泌酶抑制劑和調(diào)節(jié)劑或抗淀粉樣蛋白聚集劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的干擾分子是SiRNA，其序列選自SEQ ID N0:2-SEQ ID NO:7的一種或多種；或所述的干擾分子具有以下結(jié)構(gòu)Seq正向Ueq反向；其中，核苷酸序列如SEQ ID N0:36所示;Seq反向?yàn)榕cSeqra互補(bǔ)的序列；X為位于Seq1自和Seq反自之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq1自和Seqfi自不互補(bǔ)。
4.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的結(jié)合分子是抗淀粉樣蛋白β的抗體或抑制淀粉樣蛋白β的合成、剪切、聚集和沉積的分子。
5.如權(quán)利要求I或4所述的用途，其特征在于，所述的抗體包括3F5，BA27，BC05，1H3， 6C8, Solanezumab, Bapineuzumab, MABT5102A,Ponezumab,Intravenous Immunoglobulin。
6.抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路激活或抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)或活性的抑制劑，其是siRNA，其序列選自SEQ ID N0:2_SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:36。
7.淀粉樣蛋白β用作檢測(cè)胰島素抵抗或糖尿病的血液標(biāo)志物的用途。
8.一種特異性識(shí)別淀粉樣蛋白β的試劑的用途，用于制備檢測(cè)胰島素抵抗或糖尿病的試劑或試劑盒。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特異性識(shí)別淀粉樣蛋白β的試劑選自特異性結(jié)合淀粉樣蛋白β的結(jié)合分子；特異性擴(kuò)增淀粉樣蛋白β或其前體蛋白的編碼基因或切割前體蛋白的蛋白酶的編碼基因的引物；或特異性識(shí)別淀粉樣蛋白β或其前體蛋白的編碼基因或切割前體蛋白的蛋白酶的編碼基因的探針。
10.一種檢測(cè)血液中胰島素抵抗或糖尿病的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有特異性識(shí)別淀粉樣蛋白β的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及防治胰島素抵抗和糖尿病的方法和試劑。首次證實(shí)了胰島素抵抗或糖尿病患者外周血中淀粉樣蛋白或蛋白片段含量顯著上升，為胰島素抵抗和2型糖尿病的診斷提供了新的途徑。并且，本發(fā)明還首次揭示了淀粉樣蛋白β(Aβ)能誘導(dǎo)外周組織產(chǎn)生胰島素抵抗，其是通過(guò)激活JAK2/STAT3-SOCS-1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。因此，可以以JAK2/STAT3-SOCS-1通路或其通路蛋白作為篩選藥物的靶點(diǎn)，研究防治或緩解胰島素抵抗或糖尿病的藥物。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102921007SQ20121028280
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者翟琦巍, 張一 , 樂(lè)穎影 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院