專利名稱：人異基因有核細胞工業(yè)化制備自然殺傷性細胞(nk)及注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用人臍帶血或外周血的有核細胞作為種子細胞，采用エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)方式，制備自然殺傷性細胞(NK)的方法；特別是一種人異基因有核細胞エ業(yè)化制備自然殺傷性細胞(NK)及注射液。
背景技術(shù)：
自然殺傷細胞(nature killer cell,NK cell)是人體介導(dǎo)固有免疫細胞，其表面標記的主要代表是⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，它的特點是含有穿孔素和顆粒酶，不用預(yù)先致敏就可以裂解對NK細胞敏感的腫瘤細胞，從而殺傷腫瘤細胞。自然殺傷細胞是介導(dǎo)抗 體依賴的細胞毒作用的主要細胞，它表達腫瘤細胞壞死因子家族的幾個配體，可以導(dǎo)致多種腫瘤靶細胞凋亡。這種以腫瘤細胞凋亡方式殺傷腫瘤細胞的機制比分泌性的,顆粒介導(dǎo)的殺傷還被科學(xué)家看好，因為大多數(shù)腫瘤細胞的受體對凋亡導(dǎo)致的死亡敏感，所以自然殺傷細胞(NK)在抗腫瘤方面非常有意義。自然殺傷細胞的抗腫瘤作用是國際主流醫(yī)學(xué)不爭的事實。自然殺傷細胞(NK)能導(dǎo)致多種腫瘤細胞凋亡，是腫瘤免疫治療的ー個途徑，國際醫(yī)學(xué)界的共識。而該自然殺傷細胞(NK)是人體內(nèi)淋巴細胞中的ー類，數(shù)量很少，僅占淋巴細胞總數(shù)的1-1.5%，所以，如何獲得自然殺傷細胞(NK)成了醫(yī)學(xué)界的熱點。科學(xué)家用病人自體外周血細胞加細胞誘導(dǎo)因子培養(yǎng)擴增2— 6周，使得⑶56 +和CD3+細胞增加5 —10%不等，這ー方法獲得的殺傷性淋巴細胞稱為細胞因子誘導(dǎo)殺傷性細胞CIK細胞Cytokine induced killer cell)。也有科學(xué)家采取先獲得間充質(zhì)干細胞(MSC)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的；也有用造血干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的。這些誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得自然殺傷細胞(NK)的方法都有一定局限性。對于晚期腫瘤者不是醫(yī)生認為該用細胞治療就用CIK細胞治療，往往是受到培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件的限制。自然殺傷性細胞的時間長于癌癥病人的病情發(fā)展時間，在臨床上受到一定的限制。自然殺傷性淋巴細胞是醫(yī)學(xué)界肯定的抗腫瘤細胞和抗免疫カ的細胞治療方法。在臨床上都是用病人的外圍血分離出單個核細胞加上細胞誘導(dǎo)因子在體外培養(yǎng)擴增了 2-6周，培養(yǎng)誘導(dǎo)的目的是讓單核細胞生長成T淋巴細胞(表面標志物⑶3+，⑶56+)達到一定數(shù)量后回輸給患者。正常人體內(nèi)CD3+、CD56+細胞數(shù)量很少，而用體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法擴增2-6周，⑶3+最低達到20%，⑶56+最低達到5%以上，用于個性化治療在臨床取得了一定的療效，使五年存活率明顯升高。但是，在臨床治療的開展和推廣方面還有局限性。首先，由于這項技術(shù)是以單個核細胞為載體，加上細胞誘導(dǎo)因子，培養(yǎng)擴增為殺傷性淋巴細胞用于臨床治療的。目前為止全世界絕大多數(shù)都是采用一対一的個性化治療。即采集ー份患者的單個核細胞或者是采集一份供體血液，分離出單個核細胞，在體外誘導(dǎo)擴增后用于患者治療各種實體腫瘤。這種傳統(tǒng)的治療方法首先是ー對一的個體化治療方法，只能在醫(yī)院床邊開展。
第二，這種治療方法自然殺傷性細胞制備的時間一般需要2— 6周，對于晚期腫瘤病人，尤其是手術(shù)后放療、化療的病人來講，有的病人就等不到細胞制備完成，等不到細胞回輸?shù)臅r候就與世長辭了。第三，由于ー對一的治療，也就是每ー個人要做一全套細胞誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)的過程，從實驗室管理角度講，室內(nèi)質(zhì)量控制很難，室間質(zhì)量控制更難。盡管是ー個非常好的醫(yī)療技術(shù)，但很難推廣和普及。不是每個病人都享有平等的治療機會。第四、上述方法制備的CIK細胞從理論上講是由成體干細胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)和擴增而來的，培養(yǎng)液中含有大量的成體干細胞，可以無限繁殖生產(chǎn)CIK細胞。在臨床上其擴增繁殖時間5-6周以后其繁殖速度明顯下降，繁殖的量(倍増數(shù))也明顯不及早期。而且隨著繁殖代數(shù)的増加對腫瘤細胞的免疫殺傷作用也降低。所以控制和撐握 自然殺傷性細胞(NK)的培養(yǎng)傳代的周期很重要，保持自然殺傷性細胞(NK)生物活性更重要。第五、傳統(tǒng)的方法采取腫瘤病人來源的單個核細胞或者造血干細胞為原代細胞，細胞因子誘導(dǎo)CIK細胞。這些來源腫瘤病人的單個核細胞，部分病人的單個核細胞與所患的腫瘤細胞有共同抗原性，所以用這些病人的單個核細胞作為原代細胞，誘導(dǎo)的CIK細胞的抗腫瘤能力往往較差。異基因臍帶血有核細胞中含有豐富的干細胞已經(jīng)被科學(xué)家證實，這些干細胞生物活性優(yōu)于自體骨髄、自體外周血來源的干細胞。這是一群具有多向分化潛能和増殖潛能的干細胞。干細胞種類也很豐富，含有造血干細胞(HSC)、間充質(zhì)干細胞(MSC)、不受限的體干細胞(USSCs)、類胚胎樣干細胞(CBEs)、多潛能成體祖細胞(CB-MPCs)等。異基因來源的外周血有核細胞中雖然不及臍帶血含有豐富的干細胞，但是，含有造血干細胞(HSC)、間充質(zhì)干細胞(MSC)、少量的多潛能成體祖細胞(CB-MPCs)等。從臍帶血和外周血提取分離有核細胞的方法有多種，本發(fā)明涉及的提取方法是申請人在先授權(quán)的專利“ー種有核細胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法”(專利號ZL200610106875. 5)和使用Ficoll或percoll采用密度梯度離心法分選出有核細胞技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供人異基因有核細胞エ業(yè)化制備自然殺傷性細胞(NK)及注射液。本發(fā)明的目的按照下述方案實現(xiàn)一種從臍帶血或外周血制備自然殺傷細胞(NK)的方法，包括以臍帶血或者外周血為原料，采用有核細胞分離提取方法獲得干細胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度離心法分選出有核細胞；將上述有核細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋，再加上干擾素、白介素、CD3抗體、人血白蛋白，一起灌裝至生物反應(yīng)器中進行灌流培養(yǎng)，然后進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的傳代次數(shù)不小于8代，時間不少于4周；擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為 CD3' CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中 CD16+/CD56. ^ 15%, CD37⑶56+彡50%,⑶8+/⑶57+彡8%。本發(fā)明是采用來源于臍帶血庫的臍帶血，或者來源于中心血庫的外周血，在保證來源合法、健康供體的臍帶血或外周血，從中分離提取有核細胞作為種子細胞；分離提取技術(shù)采用了申請人擁有專利權(quán)的“骨髄、臍帶血細胞處理盒”(專利號ZL200610106875. 5)分離提取臍帶血干細胞；或者使用Ficoll或percoll采用密度梯度離心法分選出有核細胞。上述細胞培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)液GT-T551或RMP1-1640 ；上述干擾素為Y -干擾素(IFN- Y )；上述白介素是以下三種之ー或其組合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7 (IL-7)；上述灌流培養(yǎng)的溫度是37°C ;上述擴增培養(yǎng)在生物反應(yīng)器里或者在エ業(yè)化使用的灌流培養(yǎng)箱中進行。擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中 CD16+/CD56+ 彡 15%，CD37CD56+ 彡 50%，CD8+/CD57+ 彡 8%。 培養(yǎng)擴增后的成品自然殺傷細胞(NK)需經(jīng)質(zhì)量控制檢測。檢測項目包括①細胞⑶表型(CD3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+)②細胞染色體核型，或采取微陣列測序檢測。③無菌檢測④細胞懸液細胞內(nèi)毒素檢測< 2EU/ml ;⑤細胞存活率檢測> 96%。本發(fā)明提供了一種人異基因有核細胞エ業(yè)化制備的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其是以合法來源的臍帶血或者外周血為原料，采用有核細胞分離提取方法獲得干細胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度離心法分選出有核細胞；將上述有核細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋，再加上干擾素、白介素、CD3抗體，一起灌裝至生物反應(yīng)器中進行灌流培養(yǎng)，然后進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的傳代次數(shù)不小于8代，時間不少于4周；擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/⑶56+彡15%，⑶37⑶56+彡50%，⑶8+/⑶57+彡8%，將以上方法獲得的細胞懸液配制成一定濃度的注射液，即為成品；上述細胞培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)液GT-T551或RMP1-1640 ；上述干擾素為Y -干擾素(IFN- Y )；上述白介素是以下三種之ー或其組合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7 (IL-7)；上述灌流培養(yǎng)的溫度是37°C ;上述人血白蛋白為藥用人血白蛋白。上述擴增培養(yǎng)在生物反應(yīng)器里或者在エ業(yè)化使用的灌流培養(yǎng)箱中進行，如美國GE公司生產(chǎn)的Wave，或者國產(chǎn)的エ業(yè)反應(yīng)釜中進行灌流培養(yǎng)箱。擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中 CD16+/CD56+ 彡 15%，CD37CD56+ 彡 50%，CD8+/CD57+ 彡 8%。培養(yǎng)擴增后的自然殺傷細胞(NK)需經(jīng)質(zhì)量控制檢測。檢測項目包括①細胞CD表型(⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+)②細胞染色體核型，或采取微陣列測序檢測。③無菌檢測④細胞懸液細胞內(nèi)毒素檢測< 2EU/ml ;⑤細胞存活率檢測> 95%。檢測合格后將細胞懸液配制為IX 106/ml的濃度，然后分裝為合格的“自然殺傷性細胞(NK)注射液”出廠，分裝量按臨床醫(yī)生的要求而定，最小為每支10毫升，供臨床使用。成品的自然殺傷性細胞(NK)注射液，必須采取冷藏運輸和保存(冷鏈)，最佳保存、運輸溫度4°C。本發(fā)明的核心就是選用異基因臍帶血來源或者外周血來源的有核細胞，經(jīng)過細胞誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)，エ業(yè)化擴增培養(yǎng)，制備成自然殺傷性細胞注射液(藥品)，直接供臨床醫(yī)生抗腫瘤治療。臨床用于治療肝癌、子宮癌、胃癌等惡性腫瘤的效果顯著。1、治療肝癌適用于肝癌手術(shù)切除后，疑似有肝癌轉(zhuǎn)移，化驗甲胎蛋白(AFP) >400ng/ml(ELISA法測定)，白細胞總數(shù)< 3. 6 X 109/し其他免疫指標明顯低下的患者。采用細胞濃度IXlO6Ail自然殺傷性細胞(NK)注射液50ml，靜脈注射，隔日一次，共5次為ー個療程。完成一個療程后，第一周末有46%的病人AFP開始下降,到第四周末有91. 5%的病人AFP可以100ng/ml以下或接近正常水平。白細胞在第一周末開始升高，兩周有91的病人升至正常水平(男3· 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16 X 109/し)，病人的一般狀況明顯好轉(zhuǎn)。根據(jù)病人的具體情況間隔3—6個月進行第二個療程和 第三療程，兩年存活率明顯升高近50%。不良反應(yīng)自然殺傷性細胞(NK)注射液靜脈注射后，偶爾有低熱，很少超過37. 60C，可用物理降溫，維持一天后自行恢復(fù)，偶爾有惡心、嘔吐。2、治療子宮癌適用于子宮癌手術(shù)切除術(shù)后，疑似有轉(zhuǎn)移的患者，臨床化驗癌胚抗原(CEA) (ELISA法測定)>20ng/ml，白細胞總數(shù)明顯低于正常水平。采用細胞濃度I X IO6/ml自然殺傷性細胞(NK)注射液50ml，靜脈注射，隔日一次，共5次為ー個療程。子宮癌患者靜脈注射自然殺傷性細胞(NK)注射液7天開始有41%的病人CEA開始下降，到第四周末有95%的病人CEA降至10ng/ml以下或接近3ng/ml正常水平。白細胞在第一周末開始升高，兩周有90%的病人升至正常水平(男3. 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16X109/L,)，病人的一般狀況明顯好轉(zhuǎn)。根據(jù)病人的具體情況間隔3— 6個月進行第二個療程和第二療程。不良反應(yīng)自然殺傷性細胞(NK)注射液靜脈注射后，偶爾有低熱，很少超過37. 60C，可用物理降溫，維持一天后自行恢復(fù)，偶爾有惡心、嘔吐。3、胃癌的治療適用于胃癌手術(shù)切除術(shù)后，有轉(zhuǎn)移的患者，臨床化驗癌胚抗原(CEA)(ELISA法測定)> 20ng/ml，白細胞總數(shù)明顯低于正常水平。采用細胞濃度I X 106/ml自然殺傷性細胞(NK)注射液50ml，靜脈注射，隔日一次，共3次為ー個療程。胃癌患者靜脈注射自然殺傷性細胞(NK)注射液7天開始有52%的病人CEA開始下降，到第四周末有90%的病人CEA降至10ng/ml以下或接近3ng/ml正常水平。白細胞在第一周末開始升高，兩周有89%的病人升至正常水平(男3. 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16X107L，)，病人的一般狀況明顯好轉(zhuǎn)。根據(jù)病人的具體情況間隔3— 6個月進行第二個療程和第三療程。不良反應(yīng)自然殺傷性細胞(NK)注射液靜脈注射后，偶爾有低熱，很少超過37. 60C，可用物理降溫，維持一天后自行恢復(fù)，偶爾有惡心、嘔吐。本發(fā)明解決了目前自然殺傷細胞或者CIK細胞在臨床治療上那種傳統(tǒng)的漫長的制備過程，讓臨床醫(yī)生隨時隨地的、方便的使用自然殺傷性細胞注射液(藥品)，盡早的治療腫瘤患者；同時將自然殺傷性細胞實現(xiàn)エ業(yè)化生產(chǎn)，使自然殺傷性細胞治療技術(shù)從ー種臨床技術(shù)，跨越為自然殺傷性細胞注射液的藥品，實現(xiàn)細胞藥品化的跨越。為エ業(yè)化生產(chǎn)細胞藥品開辟了ー個先河。為我國在細胞治療領(lǐng)域創(chuàng)立自有知識產(chǎn)權(quán)的細胞藥品爭得一席之地，力爭以自有知識產(chǎn)權(quán)的“細胞藥品”逐步走向國際市場。采用異基因臍帶血來源的有核細胞和異基因外周血來源的有核細胞，在體外用誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)自然殺傷性NK細胞有幾個優(yōu)點1、異基因臍帶血來源于臍帶血庫，能夠保證來源于健康供體，臍帶血有核細胞來源非常豐富，這一途徑來源的臍帶血有核細胞符合生物安全性需求。異基因外周血來源于各地中心血庫，能保證外周血來源于健康供體，能保證質(zhì)量，符合生物安全性需求。2、本發(fā)明采用異基因臍帶血來源和異基因外周血來源的有核細胞用細胞誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)自然殺傷性細胞的方法可以エ業(yè)化生產(chǎn)“自然殺傷性細胞NK注射液”，能按照GMP、CE或按FDA的標準要求，規(guī)范的生產(chǎn)出細胞藥品。3、エ業(yè)化生產(chǎn)的“自然殺傷性細胞NK注射液”方便臨床醫(yī)生使用，醫(yī)生像用藥品 治療ー樣方便的治療各種癌癥。4、誘導(dǎo)殺傷性淋巴細胞CIK的表面特征是⑶3+、⑶56+也有部分是⑶16+，在臨床抗腫瘤治療上僅僅是對部分腫瘤有效。自然殺傷細胞(nature killer cell, NK cell)是人體介導(dǎo)固有免疫細胞，其表面標記的主要代表是⑶3+、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+。NK的抗腫瘤的特點是可以導(dǎo)致多種腫瘤靶細胞凋亡，是以腫瘤細胞凋亡方式殺傷腫瘤細胞的。所以本發(fā)明不僅是⑶3+、⑶56+陽性，而且可以選擇性的⑶16+、⑶57+、⑶8+的陽性表達，起到對大多數(shù)惡性腫瘤有殺傷的功效。
具體實施例方式實施例1從臍帶血庫申請ー份健康供體的臍帶血(不少于50ml)，，(無遺傳病、和四項傳染病，こ肝、丙肝、艾滋、梅毒)，同時獲取可溯源的供體代碼。為了安全起見將臍帶血再取Iml樣品送第三方檢測(こ肝、丙肝、艾滋、梅毒四項)和(ΑΒ0血型，RH血型)存檔，以備將來溯源之用。確定供體臍帶血合格以后，立即制備有核細胞。有核細胞分離提取選用寧夏中聯(lián)達生物有限公司生產(chǎn)的《骨髄、臍帶血細胞處理試劑盒》，按操作說明書要求的步驟分離提取出臍帶血有核細胞。在分離過程中注意保存全部的臍帶血血清，將血清用O. 22 μ m過濾器過濾后備用。自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液的配制；將有核細胞制備過程中保留的臍帶血血清按重量1: 200的比例加入GT-T551無
血清培養(yǎng)液，總量大致在10000毫升左右。再加入重量O. 1-0. 5%的藥用人血白蛋白；按每毫升20U-200U(國際單位)白介素_2 ;每毫升5-50mg的CD3單克隆抗體；每毫升10U-100U的T -干擾素。將分離提取出的臍帶血有核細胞檢測存活率，細胞計數(shù)，計數(shù)出總數(shù)。然后按細胞數(shù)計算IXlO6Ail濃度，加入自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液。常規(guī)ー份臍帶血分離提取有核細胞IX IO8個有核細胞，自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液總量大約在100-150ml之間。(取50yL用微陣列測序檢測DNA留著等待與自然殺傷性細胞(NK)注射液成品的DNA檢測結(jié)果比較)將制備好含有臍帶血有核細胞的誘導(dǎo)自然殺傷細胞培養(yǎng)液，放入美國GE公司生產(chǎn)的Wave生物反應(yīng)器中灌流培養(yǎng)。條件37°C±0. 2°C和 5% CO2 氣。內(nèi)置搖擺式混勻8-12次/min前兩日不用加配制的自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液，第三日開始視細胞生長速度，計算濃度在l_5X106/ml 之間，按照加2出I的比例每日加入相應(yīng)量的自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液，按1/2的比例抽出灌流液，直到本次配制的自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)液用完為止，保持1-2天讓細胞濃度達到IXlOVml為止。
連續(xù)培養(yǎng)4-6周，當(dāng)細胞密度達到或接近I X 107/ml，計算細胞總數(shù)達到IXIOki時，或培養(yǎng)時間達到6周，即完成培養(yǎng)。精心收取所有細胞，用細胞保養(yǎng)液清洗兩次。[檢測]檢測步驟應(yīng)該放在前面。自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)過程中的流程檢測合格，成品檢測合格后制備成I X106/ml的細胞懸液。分袋灌裝為規(guī)格2X 107/20ml或5X 107/50ml加5% CO2氣體密封，制成自然殺傷
性細胞注射液(細胞藥品)。供臨床醫(yī)生直接用于治療，運輸必須按低溫(最適宜溫度4°C)保存和運輸。1、細胞培養(yǎng)過程檢測(流程質(zhì)量控制)自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)過程中從第3天開始每日檢測抽出灌流液的細菌內(nèi)毒素，(檢測細菌內(nèi)毒素彡5EU/ml)。自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)完成前三天，每天取樣進行無菌檢測，檢測方法參照《中華人民共和國藥典》2010版附則。自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)過程中每周必須做細胞形態(tài)學(xué)檢測，觀察核型、細胞大小，以及細胞形態(tài)是否正常。2、自然殺傷性細胞(NK)注射液成品檢測自然殺傷性細胞(NK)培養(yǎng)完成后，細胞濃縮清洗時將培養(yǎng)液取樣，檢測細菌內(nèi)毒素 < 5EU/ml。培養(yǎng)液取樣檢測支原體，結(jié)果應(yīng)為陰性，檢測方法(參照衛(wèi)生部醫(yī)政司)主編的《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第三版)第六篇第五章。自然殺傷性細胞(NK)注射液的細胞表型抗原檢測選用流式細胞儀方法，檢測項目和正常值為 CD3' CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中 CD16+/CD56+ ^ 15 %, CD37CD56. ^ 50%, CD8+/CD57. ^ 8% 0細胞存活率檢測選用苔盼藍染色法檢測，檢測結(jié)果存活率檢測> 96%為合格產(chǎn)品，反之不合格。取50 μ L用微陣列測序檢測DNA與原代細胞的DNA比較有無變異，無DNA變異為正常，產(chǎn)品合格。本例檢測結(jié)果如表I所示。表INK細胞檢測結(jié)果
序號檢測項目設(shè)計合格標準實測值結(jié)果
1細菌內(nèi)毒素彡5EU/mlSS 5EU/ml 合格
2Γ支原體T陰性_Γ陰性廠合格
權(quán)利要求
1.一種人異基因有核細胞工業(yè)化制備的自然殺傷性細胞(NK)注射液，以合法來源的臍帶血或者外周血為原料，采用有核細胞分離提取方法獲得干細胞或者使用Ficoll或 percoll密度梯度離心法分選出有核細胞；將上述有核細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋，再加上干擾素、白介素、CD3抗體、人血白蛋白，一起灌裝至生物反應(yīng)器中進行灌流培養(yǎng)，然后進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的傳代次數(shù)不小于8代，時間不少于4周；擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/ ⑶56+彡15%，⑶37⑶56+彡50%，⑶8+/⑶57+彡8%，將以上方法獲得的細胞懸液配制成一定濃度的注射液，即為成品。
2.一種從臍帶血或外周血制備自然殺傷細胞(NK)的方法，包括以合法來源的臍帶血或者外周血為原料，采用有核細胞分離提取方法獲得干細胞或者使用Ficoll或percoll 密度梯度離心法分選出有核細胞；將上述有核細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋，再加上干擾素、白介素、CD3抗體、人血白蛋白，一起灌裝至生物反應(yīng)器中進行灌流培養(yǎng)，然后進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的傳代次數(shù)不小于8代，時間不少于4周；擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為⑶3'⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/⑶56+彡15%，⑶37 CD56. ^ 50%, CD8+/CD57. ^ 8% 0
3.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其特征在于上述培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)液 GT-T551 或 RMP1-1640。
4.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其特征在于上述干擾素為Y-干擾素(IFN- Y )。
5.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其特征在于上述白介素是以下三種之一或其組合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7(IL-7)。
6.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其特征在于上述灌流培養(yǎng)的溫度是 37。。。
7.如權(quán)利要求1所述的自然殺傷性細胞(NK)注射液，其特征在于上述擴增培養(yǎng)在生物反應(yīng)器里或者在工業(yè)化使用的灌流培養(yǎng)箱中進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人異基因有核細胞工業(yè)化制備自然殺傷性細胞(NK)及注射液，以合法來源的臍帶血或者外周血為原料，采用有核細胞分離提取方法獲得干細胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度離心法分選出有核細胞；將上述有核細胞用細胞培養(yǎng)液稀釋，再加上干擾素、白介素、CD3抗體、人血白蛋白，一起灌裝至生物反應(yīng)器中進行灌流培養(yǎng)，然后進行擴增培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)自然殺傷細胞(NK)的傳代次數(shù)不小于8代，時間不少于4周；擴增培養(yǎng)后獲得的自然殺傷細胞(NK)的標志物為CD3-、CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中CD16+/CD56+≥15％，CD3-/CD56+≥50％，CD8+/CD57+≥8％，將以上方法獲得的細胞懸液配制成一定濃度的注射液，即為成品。
文檔編號A61P37/04GK102988415SQ201210288669
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者王沁怡, 王懷林 申請人:王沁怡, 王懷林