增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度的藥物組合物及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明包含以人參皂甙(Rg1+Rb1+Re)、甘草酸及大棗cAMP為主要成份，制成迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸(cAMP)含量及利用度之口服藥物或保健食品。
【專利說明】增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度的藥物組合物及其制造方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于一種藥物組合物，尤指一種口服藥物及保健食品。
【背景技術(shù)】 [0002]榮獲1971年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎的科學(xué)家Earl Wilbur Sutherland Jr.,發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)cAMP的作用機制；而榮獲1992年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎的科學(xué)家Edmond H.Fischer及Edwin G.Krebs,更進一步發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi) cAMP — PKA (即 cAMPdependent protein kinase)的作用機制；榮獲2000年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎的科學(xué)家Eric Kandel，再更進一步發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)cAMP — PKA — CREB的作用機制。足見細(xì)胞內(nèi)cAMP的相關(guān)作用，與人類的生理及醫(yī)學(xué)，有絕對而且非常重大的關(guān)聯(lián)；例如，當(dāng)Eric Kandel探究出短期記憶和長期記憶形成的作用機制，是依賴細(xì)胞內(nèi)cAMP — PKA — CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)并榮獲諾貝爾獎之后，科學(xué)家們認(rèn)為，這些成果是發(fā)明記憶加強藥的關(guān)鍵。雖然，科學(xué)家們不斷努力，企圖研發(fā)可以迅速活化腦細(xì)胞內(nèi)cAMP — PKA — CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物，使人類得以加強記憶力，以提高學(xué)習(xí)能力，以及預(yù)防和治療健忘、老人癡呆、阿茲海默、帕金森等腦神經(jīng)退行性疾病，更可以預(yù)防和治療其它體內(nèi)cAMP含量及利用度低下相關(guān)疾病，例如憂郁癥；但是，1971年Earl Wilbur Sutherland Jr.獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎至今，已經(jīng)超過了 30年，仍未見任何適于人類長期服用、毒副作用低、有效率高的相關(guān)藥物問市。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，已問市的SSR1、SNR1、NDRI等類的抗憂郁藥物，藉由抑制憂郁癥病患機體中濃度已較正常人低下的5-HT、NE、DA等第一信使神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取，待第一信使神經(jīng)遞質(zhì)的濃度及與受體之結(jié)合趨向較正常之后，才能從而使病患細(xì)胞內(nèi)cAMP第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)遞質(zhì)的生成趨向較正常；但是，副作用高，有效率低，卻使抗憂郁藥物令人望而生畏。故而，從未聽聞有健康的人為了增加記憶力而長期服用抗憂郁藥物。
[0004]美國國家健康研究院(NIH)的心理健康研究院(NMH)耗資3千5百萬美元，以6年的時間，對于超過2800名憂郁癥病患，進行5種具代表性之SSRI類抗憂郁藥物(Celexa、Zoloft、Wellbutrin、Effexor、Buspar)的臨床有效率(remission rat)研究(STAR*Dstudy)，結(jié)果研究報告指出，每一種藥物的有效率僅約30%，而且平均約須6至7周才能緩解憂郁癥狀。更何況，已問市的抗憂郁藥物都有不同程度的副作用，例如:增加自殺率、頭痛、頭暈、暈眩、失眠、嗜睡、耳鳴、口干、厭食、食欲增加、體重上升、血壓上升、腸胃不適、反胃、惡心、嘔吐、消化不良、腹瀉、便秘、下肢痛、皮膚出疹、顫抖、痙攣、多汗、水腫、性欲降低、性無能等。近年來百憂解等抗憂郁藥物已成為社會嚴(yán)重關(guān)注的問題，美國食品暨藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)更于2004年要求藥廠將市場上主要的32種抗憂郁藥物重新標(biāo)示其副作用和警告的部分，并對醫(yī)護人員強調(diào)這些藥物可能增加孩童及青少年自殺的機率。
[0005]多年以來，國際醫(yī)藥界的科學(xué)家們不斷努力研發(fā)副作用低、更安全、更有效，可以直接作用在第一信使神經(jīng)遞質(zhì)的受體之后，更迅速的提高細(xì)胞內(nèi)cAMP第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)遞質(zhì)的生成及利用度的藥物，以預(yù)防和治療細(xì)胞內(nèi)cAMP低下的相關(guān)病癥。雖然，四型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 4, PDE4)的抑制劑羅列普拉(Rolipram),即屬于受體后作用機制調(diào)節(jié)類藥物，且試驗表明它具有明顯的抗憂郁作用，原因是細(xì)胞內(nèi)生成的cAMP會被四型磷酸二酯酶降解，而抑制了四型磷酸二酯酶就提高了 cAMP的利用度；但是，由于服用羅列普拉會出現(xiàn)強烈嘔吐等副作用，故而并未能被廣泛應(yīng)用。
[0006]本人為了解決前述技術(shù)之不足，與張作光先生合作潛研成功一種采用人參、甘草及大棗3種天然植物為原料制成的藥物組合物，不僅可以使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高，還可抑制磷酸二酯酶以減少cAMP的降解而增加cAMP的利用度，并可提高腦內(nèi)DA和NE等神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，而且長期服用安全性高，適于治療必須長期服藥的憂郁癥，當(dāng)然也適于預(yù)防及治療細(xì)胞內(nèi)cAMP低下，以及腦內(nèi)DA和NE等神經(jīng)遞質(zhì)不足的相關(guān)病癥。然而，天然植物因為生長期的不同、產(chǎn)地的不同、采收季節(jié)的不同，保存方式的不同，以及氣候變遷溫度、雨水、陽光等等因素，所以每一批天然植物原料中，可以提高cAMP的生成及利用度之有效成份的含量，均不可能相同；故而，有效成份愈明確，則愈能藉由控制及配比有效成份的含量，使每一次生產(chǎn)之藥物組合物的有效性及安全性更趨一致化，以提升藥物組合物的質(zhì)量可控性(CMC);再者，倘能更明確化有效成份中人參皂甙的種類，即可以擴大原料取得的范圍，使原料不致匱乏，因為除了人參的根、莖、葉之外，例如三七、西洋參等植物的根、莖、葉亦含有多種人參皂甙可以利用。于是，本人與張作光先生為了進一步提升該藥物組合物的質(zhì)量可控性(CMC)，以及擴大原料取得的基源，遂在原研發(fā)成果的基礎(chǔ)之上，繼續(xù)努力研究更明確化之主要功效成份及作用機制，而研發(fā)成功主要功效成份更明確之人參皂甙Rgl、Rbl、甘草酸(甘草次酸)及大棗cAMP的藥物組合物，且系多靶標(biāo)受體后作用機制調(diào)節(jié)類藥物，而選擇采用人參皂甙Rgl、Rbl為主要功效成份，更可以強化BDNF的表達。
[0007]但是，除了人參皂甙Rgl、Rbl之外，倘若能夠再進一步利用人參、三七、西洋參等植物的根、莖、葉含有之其 它種類的人參皂甙，協(xié)助人參皂甙Rgl、Rbl，達成前述藥物組合物的有效性，則可以更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本。此外，前述藥物組合物中含有甘草酸類成份，而自古以來中醫(yī)早已確定，有嘔吐問題的人倘服用甘草，恐會誘發(fā)其嘔吐之問題。
[0008]因此，本人繼續(xù)努力在原研發(fā)成果基礎(chǔ)上，悉心研究與探索，以更進一步改良現(xiàn)有技術(shù)及其中之缺失，并一本鍥而不舍之精神，終構(gòu)思出本案之“可迅速增加體內(nèi)cAMP含量及利用度之藥物組合物”，以下為本案之簡要說明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一組包含以人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸及大棗cAMP為主要成份，制成迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，特別是能更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，并以穩(wěn)定的質(zhì)量提供可迅速強化細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及強化BDNF表現(xiàn)量的口服藥物或保健食品的新技術(shù)方案。
[0010]本發(fā)明藥物組合物的解決方案是經(jīng)本人潛心研究探索并采用實施例進行充分實驗后證明之結(jié)果，由于先前技術(shù)實驗證明人參皂甙Rgl與Rbl可以增加體內(nèi)BDNF的表達，故而可用以作為研制相關(guān)藥物的主要功效成份；但是目前技術(shù)尚未能人工合成人參皂甙Rgl與Rbl，故而必須從人參、三七、西洋參等天然植物的根、莖、葉中取得。由于人參皂甙的種類多達30種以上，為了能更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，故而發(fā)明人潛心研究探索后，可以采用人參皂甙Re協(xié)同人參皂甙Rgl、Rbl，并與甘草酸(甘草次酸)及大棗cAMP配伍作為主要功效成份制成藥物組合物，在進行充分實驗后證明，本發(fā)明可以在正常大鼠服用8小時后，既提高海馬組織中cAMP濃度，且增強PKA活性，并提高CREB磷酸化水平；尚可以抑制大鼠腦海馬組織中PDE的活性；且慢性重復(fù)應(yīng)激實驗，服用的小鼠腦海馬組織中cAMP濃度、PKA活性、CREB磷酸化的表達，以及BDNF的表達，均明顯高于未服用之模型組的小鼠；而慢性重復(fù)應(yīng)激實驗，服用的大鼠海馬組織中cAMP、PKA,以及血清BDNF和下丘腦5-HT、NE、DA等單胺遞質(zhì)的表達，亦明顯高于未服用之模型組的大鼠；由此可以證實，本發(fā)明之藥物組合物可以迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度。足見本發(fā)明具有良好的有效性，而且比先前技術(shù)更進一步增加天然植物原料中有效成份的利用度及降低成本，并且可以有效地執(zhí)行質(zhì)量可控制性(CMC)。此外，由于本發(fā)明長期服用安全性高，且適于治療必須長期服藥的憂郁癥，以及預(yù)防及治療體內(nèi)及細(xì)胞中cAMP低下、BDNF表現(xiàn)量低下、腦內(nèi)DA和NE等神經(jīng)遞質(zhì)不足等的相關(guān)病癥(例如:記憶力不足、老人癡呆、阿茲海默、帕金森等腦神經(jīng)退行性疾病，以及牛皮癬、癌癥等體內(nèi)及細(xì)胞中cAMP低下之疾病等等)，適用人群廣泛；但是，因為藥物組合物中含有甘草酸類成份，而自古以來中醫(yī)早已確定，有嘔吐問題的人倘服用甘草，恐會誘發(fā)其嘔吐；然而，自古以來中醫(yī)也早已確定，長期服用安全性高的生姜是止吐圣品；故而，本發(fā)明之藥物組合物，還可以加入生姜粉或其萃取物，以改善先前技術(shù)之不足。
[0011]本發(fā)明是揭露一種迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，它是由包括含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸及大棗cAMP等主要功效成份的原料所制成。
[0012]本發(fā)明說明書和申請專利范圍中所述之迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，是實現(xiàn)本發(fā)明目的的核心內(nèi)容，在本發(fā)明公開后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對上述藥物進行常規(guī)的加減化裁，均`屬于本領(lǐng)域技術(shù)和研究人員的一般性技術(shù)活動，故其都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0013]本發(fā)明得藉參閱如附圖示及詳細(xì)說明而獲較佳了解。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0014]圖1為制備本發(fā)明實施例一藥物的方法流程示意圖。
[0015]圖2為制備本發(fā)明方案二藥物的方法流程示意圖。
[0016]圖3為制備本發(fā)明方案三藥物的方法流程示意圖。
[0017]圖4為制備本發(fā)明方案四藥物的方法流程示意圖。
[0018]圖5為給藥8h后，大鼠海馬組織中Cyclic AMP的含量變化圖。
[0019]圖6為測定cAMP-D印endent PKA活性試驗中典型的凝膠電泳照片(泳道自左至右1-4生理鹽水組；5-8帕羅西汀組；9-11實施例一組；12正對照樣本；13負(fù)對照樣本)。
[0020]圖7為給藥8h后，大鼠海馬組織中cAMP-D印endent PKA活性差異圖。
[0021]圖8為給藥8h后，大鼠海馬組織中P-CREB的含量變化圖。
[0022]圖9顯示實施例一對于重復(fù)應(yīng)激小鼠海馬cAMP濃度的影響。
[0023]圖10顯示實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬PKA活性的影響。[0024]圖11顯示實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬CREB磷酸化的影響。
[0025]圖12顯示實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬BDNF的影響。
【具體實施方式】
[0026]以下將結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明主要是采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法結(jié)合本發(fā)明的特征制備本發(fā)明所述的藥物。以下實施例僅僅是為了說明，并非限定本發(fā)明。
[0027]為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明特別提出下列技術(shù)方案。
[0028]本發(fā)明是揭露迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物，它是由包括含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸及大棗cAMP等主要功效成份的原料所制成。
[0029]方案一:
[0030]以含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸或甘草次酸及大棗cAMP的原料，加工制成本發(fā)明迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物。
[0031]方案二:
[0032]以含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)合計2~26重量份、甘草酸或甘草次酸3~48重量份及大棗cAMP 0.002~0.5重量份的原料，加工制成本發(fā)明的藥物組合物。
[0033]方案三:
[0034]以含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)合計4~13重量份、甘草酸或甘草次酸5~16重量份及大棗cAMP 0.01~0.1重量份的原料，加工制成本發(fā)明的藥物組合物。
[0035]方案四:
[0036]本發(fā)明之藥物組合物包括可以加入生姜水萃取物。
[0037]方案五:
[0038]本發(fā)明之藥物組合物包括可以含有藥學(xué)上可接受的載體或添加劑，可以制成錠劑、膠囊劑、散劑等任何藥劑學(xué)上所公知的口服藥物劑型。
[0039]方案六:
[0040]本發(fā)明所述的藥物組合物可用來制成迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物、保健食品和營養(yǎng)劑。
[0041]為了完成本發(fā)明的目的，特提出以下藥物的制作方法。
[0042]方法一:
[0043]分別自人參、甘草及大棗中，萃取含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸及大棗cAMP的萃取物為原料，或直接采用已制備成的含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)、甘草酸或甘草次酸及大棗cAMP的原料，加工制成本發(fā)明迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度之藥物組合物。
[0044]方法二:
[0045]將含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)合計2~26重量份、甘草酸或甘草次酸3~48重量份及大棗cAMP 0.002~0.5重量份的原料，加工制成本發(fā)明的藥物組合物。
[0046]方法三:
[0047]將含有人參皂甙(Rgl+Rbl+Re)合計4~13重量份、甘草酸或甘草次酸5~16重量份及大棗cAMP 0.01~0.1重量份的原料，加工制成本發(fā)明的藥物組合物。[0048]方法四:
[0049]本發(fā)明之藥物組合物包括可以加入生姜水萃取物。
[0050]方法五:
[0051]本發(fā)明所述的藥物組合物包括可以含有藥學(xué)上可接受的載體或添加劑，可以制成錠劑、膠囊劑、散劑等任何藥劑學(xué)上所公知的口服藥物劑型。
[0052]方法六:
[0053]將本發(fā)明所述的原料依食品管理標(biāo)準(zhǔn)或依保健食品生產(chǎn)制造標(biāo)準(zhǔn)的方法，加工制成本發(fā)明迅速增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度的保健食品或營養(yǎng)劑。
具體實施例
[0054]以下將結(jié)合附圖和具體實施案例進一步說明本發(fā)明。
[0055]實施例一
[0056]請參閱圖1，為制備本發(fā)明實施例一藥物的方法流程示意圖。在第一圖中，將40kg的人參破碎后用70%乙醇溶液加溫萃取，經(jīng)上柱層析分離純化、干燥，得含270g人參皂甙Rgl+Rbl+Re (Rgl 約 48.4g、Rbl 約 176.9g、Re 約 44.7g)之人參萃取物 1.42kg ;并將 15kg 的甘草破碎后常溫浸泡12小時，以水提醇沈法萃取、濃縮干燥，得含甘草酸307g的甘草萃取物3.1kg ;且將IOkg的大棗破碎后加水常溫浸泡，再以水提醇沈法萃取獲得大棗萃取液，再用大孔樹脂0U-2、ME-2兩柱先后連續(xù)上柱吸附分離、干燥，得含大棗cAMP0.752g的大棗萃取物40g作為原料供制備本發(fā)明藥物；之后，將上述方法得到的人參萃取物144g、甘草萃取物300g及大棗萃取物3.6g粉碎混合均勻后`，得447.6g (含27.4g人參皂甙Rgl+Rbl+Re，以及29，7g甘草酸，以及0.067g大棗cAMP)本發(fā)明方案一的藥物組合物。
[0057]實施例二
[0058]請參閱圖2，為制備本發(fā)明實施例二藥物的方法流程示意圖。在第二圖中，將實施例一得到的人參萃取物120g及甘草萃取物200g及大棗萃取物0.5g粉碎混合均勻后，得320.5g(含22.8g人參皂甙Rgl+Rbl+Re、19.8g甘草酸及0.009g大棗cAMP)本發(fā)明方案二的藥物組合物。
[0059]實施例三
[0060]請參閱圖3，為制備本發(fā)明實施例三藥物的方法流程示意圖。在第三圖中，將已制備成的3.6g純度為90%的人參皂甙Rgl、3.2g純度為90 %的人參皂甙Re、15.6g純度為90 %的人參皂甙Rbl及26g純度為96 %的甘草次酸及實施例一得到的大棗萃取物IOg粉碎混合均勻后，得58.4g(含22.4g人參皂甙Rgl+Rbl、26g甘草次酸及0.188g大棗cAMP)本發(fā)明方案三的藥物組合物。
[0061]實施例四
[0062]請參閱圖4，為制備本發(fā)明實施例四藥物的方法流程示意圖。在第四圖中，將實施例一得到的本發(fā)明方案一的藥物組合物100g，與市售的生姜萃取物35g混合均勻后，得135g本發(fā)明方案四的藥物組合物。
[0063]實驗例一:正常大鼠給藥實施例一8小時，對cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響之動物實驗。
[0064]正常大鼠灌胃給藥實施例一 8h后分取海馬組織，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定海馬組織中的環(huán)磷酸腺苷(Cyclic AMP)、磷酸化Cyclic AMP反應(yīng)組件結(jié)合蛋白(p-CREB)的含量變化，生物發(fā)光法(Bioluminescent)測定磷酸蛋白激酶A(cAMP_Dependent PKA)的活性變化，熒光法測定磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)的活性變化，揭示實施例一給藥8h后短時間內(nèi)提高Cyclic AMP濃度,從而增強cAMP-Dependent PKA活性,提高CREB磷酸化水平，且可抑制腦海馬組織中PDE活性之分子藥理學(xué)機制。試驗數(shù)據(jù)采用Oringin Pro
7.5軟件統(tǒng)計分析作圖。
[0065]1.試驗材料
[0066]1.1試驗動物
[0067]健康雄性SD大鼠，體重180-200g，70只，購于北京維通利華動物試驗中心。
[0068]1.2 試劑
[0069]陽性對照藥物，抗憂郁劑鹽酸帕羅西汀(批號:08030078，中美天津史克制藥有限公司)！Parameter Cyclic AMP Assay Kit, KGE002 (美國 R&DSystems, Inc.) ；DuoSetIC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133)ELISA Kit，DYC2510-2 (美國 R&D Systems,Inc.) ；PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent ProteinKinase Kit, V5340 (美國 Promega Corporation.) ；PDE-G1 Phosphodiesterase AssayKit, V1361 (美國 Promega Corporation.) ；Pierce BCA Protein Assay Kit, 23227,(美國Thermo);環(huán)磷酸腺苷、腺苷等對照品購自中國藥品生物制品檢定所；NaH2P04、Na2HP04、KH2P04、KCl、NaCl、MgCl2, Tris Base、Tris-HCl等試劑均為細(xì)胞培養(yǎng)級生化試劑，購自美國 Sigma 公司；E-64、APROTININ、LEUPEPTIN、Pepstatin A、PMSF、NaF、EDTA, EGTA, DTT、NaV04、Sodium pyrophosphate、瓊脂糖、甘油等試劑均為高純級,購自加拿大BioBasic公司；乙腈、甲醇(色譜純，德國MERCK公司)；超純水(MilliQ純水)；實施例一。
[0070]1.3試驗儀器
[0071]FlexStation 3 多功能微孔板分析儀(美國 Molecular Devices Corporation.)；Waters600E高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器，美國Waters公司);冷凍離心機(美國BECKMAN公司);電子超聲勻漿器(美國UNTRASOUNDTECHNOLOGY公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(SYN GENE公司)；ULTRA LOW超低溫冰箱(日本SANYO公司);mLine單道移液器、8道移液器(芬蘭Biohit公司)。
[0072]2.給藥
[0073]大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，隨機分為3個組，分別標(biāo)記為:A生理鹽水組、B帕羅西汀組、C實施例一組。鹽酸帕羅西汀片碾碎，用超純水配成一定濃度的混懸液，大鼠灌胃給藥劑量為5mg/kg ;實施例一取其內(nèi)容物用水配成一定濃度的溶液，大鼠灌胃給藥劑量為50mg/kg ;生理鹽水組給予等體積的0.9%生理鹽水；給藥之前所有大鼠稱重并用苦味酸標(biāo)記，所有藥物均在37°C下預(yù)熱30min后給藥。
[0074]3.取材
[0075]A、B、C三組試驗動物給藥8h后，乙醚麻醉，股動脈放血處死，冰上斷頭取腦，分取海馬組織，精細(xì)切割成三份，分別置于預(yù)先編號標(biāo)記的1.5mL彩蓋螺口凍存管中，準(zhǔn)確稱重后迅速投入液氮中速凍15min，再置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0076]4.樣本檢測
[0077]4.1大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量測定:[0078]將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1: 20(g: mL)的比例加入試劑盒提供的細(xì)胞裂解液(將5倍濃縮液稀釋后使用)，電子超聲勻漿器勻漿30s，4°C下1000Orpm冷凍離心5min,取上清液置于預(yù)先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置于冰盒內(nèi)，待測。應(yīng)用美國R&D Systems公司Parameter Cyclic AMP Assay ELISA試劑盒進行樣本檢測。將樣品恢復(fù)至室溫，按試劑盒說明書采用競爭性ELISA法測定樣品中CyclicAMP含量。用多孔板分析儀在450nm下測定OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中CyclicAMP含量。
[0079]4.2大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性測定:
[0080]將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按1: 10 (g: mL)的比例加入PKAextraction buffer (按照試劑盒中配方配制)，電子超聲勻衆(zhòng)器勻衆(zhòng)30s, 4°C下1000Orpm離心5min,取上清液置于預(yù)先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置于冰盒內(nèi)，待測。應(yīng)用美國 Promega公司 PepTag Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-DependentProtein Kinase試劑盒進行檢測分析。在預(yù)先編號的200 μ L PCR八聯(lián)管中按照試劑盒說明書加入預(yù)混的試劑，分別取9μ L各樣本對號加入各管中，渦旋混勻，離心，室溫反應(yīng)30min，然后置于PCR儀中98°C 5min對酶進行滅活。試驗中按照說明書要求分別設(shè)置正對照與負(fù)對照管，隨行試驗。制備0.8%的瓊脂糖凝膠，將酶反應(yīng)后的樣本各取IOyL加入凝膠的梳孔中，100V，130mA電泳30min，電泳液為50mMTris_HCl (pH 8.0)緩沖液。電泳后將瓊脂糖凝膠取出，凝膠成像儀照相，然后置于紫外分析儀上，將已磷酸化反應(yīng)的P印Tag Al Peptide斑點切下，分別置于預(yù)先編號標(biāo)記的1.5mL彩蓋螺口凍存管中。加熱使瓊脂糖凝膠融化，用超純水定容到250 μ L，迅速取出125 μ L加入預(yù)先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，再加入75 μ L試劑盒提供的溶膠液和50 μ L冰醋酸，渦旋混勻，取200 μ L加入96孔酶標(biāo)板中，以負(fù)對照管正極方向瓊脂糖為空白對照，在多孔板分析儀上進行熒光分析。設(shè)定Excitation Wavelength 568nm, Emission Wavelength 592nm。以樣本突光強度表不 PKA活性。
[0081 ] 4.3大鼠海馬組織中p-CREB含量測定:
[0082]應(yīng)用美國R&D Systems 公司 DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB (S133)ELISA試劑盒進行樣本檢測。將海馬組織樣本解凍，用少量生理鹽水沖洗，再按I: 20(g: mL)的比例加入組織勻漿液(按照試劑盒中IC DELUENT 6#配方配制)，電子超聲勻衆(zhòng)器勻衆(zhòng)SOsJ1O下1000Orpm離心5min,取上清液置于預(yù)先編號的1.5mL彩色Eppendorf離心管中，置于冰盒內(nèi)，待測。測定時將樣品恢復(fù)至室溫，按試劑盒說明書采用sandwich ELISA法測定樣品中p-CREB含量。用多孔板分析儀在450nm下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中P-CREB含量。
[0083]4.4大鼠海馬組織中總蛋白測定:
[0084]為了更準(zhǔn)確標(biāo)定樣本中每毫克蛋白所含的p-CREB蛋白的量，需要對樣本的總蛋白含量進行測定。取P-CREB測定試驗中的組織勻漿離心后的上清液，用PBS稀釋25倍后，作為測試樣本，按照Pierce BCA Protein Assay Kit試劑說明書,用多孔板分析儀在562nm下測定OD值，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中總蛋白含量。
[0085]4.5磷酸二酯酶(I3DE)活性測定:
[0086]使用美國Promega公司生物發(fā)光法(Bioluminescent)PDE-GloPhosphodiesterase Assay試劑盒測定實施例一對大鼠腦海馬組織中PDE活性的影響。
[0087]4.5.1藥液配制:
[0088]實施例一取內(nèi)容物配制成0.02mg/mL、0.05mg/mL和1.0mg/mL三個濃度。
[0089]4.5.2樣品制備:
[0090]取一定量的海馬組織，少量生理鹽水沖洗后，按1: 10(g: mL)的比例加入PDE-Glo Reaction Buffer (Tris-HCl 40mM,MgC12 IOmM, BSA 0.lmg/ml，另加入 PMSF ImM,leupetin 2 μ Μ/mL, aprotinin 2 μ Μ/mL, Ε-642 μ M/mL),電子超聲器勻衆(zhòng)，4°C下 14000rpm離心30分鐘，取上清液作為酶液，備用。
[0091]4.5.3生物發(fā)光法測定:
[0092]按照試劑盒說明書提供的方法進行操作，酶反應(yīng)液部分，加入I μ L藥液，1.5 μ L酶液，共2.5 μ L ;加入含有2 μ mo I Cyclic AMP的底物溶液2.5 μ L，混勻，37°C反應(yīng)30min，然后加入含有PDE強抑制劑IBMX的反應(yīng)終止溶液2.5 μ L，混勻；加入測試溶液2.5 μ L，混勻，室溫反應(yīng)20min ;最后加入發(fā)光試劑10 μ L，室溫反應(yīng)10min后在多功能微孔板分析儀上進行測試。
[0093]5.試驗結(jié)果
[0094]5.1大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量:·[0095]用ELISA法測定了大鼠海馬組織勻漿液中Cyclic AMP濃度，除以稱量的組織樣本重量，得到海馬組織中含有的Cyclic AMP的含量，以pmol/g Tissue表示(圖5)。
[0096]請參閱圖5，實施例一組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中CyclicAMP的含量顯著升高，*P < 0.05，η = 10。
[0097]5.2大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性:
[0098]酶反應(yīng)后，樣本進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照相，進行粗略分析。
[0099]請參閱圖6，磷酸化的Al肽帶有負(fù)電荷，向正極方向移動；未磷酸化的Al肽帶有正電荷，向負(fù)極方向移動，將二者分開。其中向正極方向移動的已磷酸化的Al肽斑點亮度越高，表明磷酸化水平越高，樣本中cAMP-Dependent PKA活性越高。圖中可見實施例一組樣本正極方向斑點亮度較生理鹽水組和帕羅西汀組亮度更高。
[0100]切割瓊脂糖凝膠斑點，熔膠后定容，以熒光法測定大鼠海馬組織中cAMP-Dependent PKA活性，以熒光強度表示(圖7)。
[0101]請參閱圖7，給藥8h后，實施例一組與空白對照組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中 cAMP-Dependent PKA 活性顯著升高，*P < 0.05, η = 10。
[0102]5.3大鼠海馬組織中p-CREB含量:
[0103]采用BCA法測定了大鼠海馬組織樣本勻漿液中總蛋白的濃度，以標(biāo)定每Hg總蛋白中含有P-CREB的量。再采用sandwich ELISA法測定了大鼠海馬組織樣品勻漿液中P-CREB濃度，并以p-CREB(pg)/總蛋白(μ g)表示大鼠海馬組織中p-CREB含量，結(jié)果見圖8。
[0104]請參閱圖8，給藥8h后，實施例一組與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，大鼠海馬組織中p-CREB的含量升高，η = 10。
[0105]5.4藥物對大鼠海馬組織中磷酸二酯酶(F1DE)活性影響:[0106]用生物發(fā)光法測定了海馬組織中PDE的活性以及體外給予藥物后對PDE活性的抑制作用。以發(fā)光強度表示PDE活性，與對照組比較，發(fā)光強度較高，說明PDE活性較高；發(fā)光強度較低，說明PDE活性被抑制；測定的結(jié)果顯示，與空白對照組相比，實施例一(0.5mg/ml)明顯抑制了大鼠海馬組織中PDE的活性，*P < 0.05，η = 4。
[0107]6、結(jié)論
[0108](I)大鼠灌胃給藥8小時后，與生理鹽水組和帕羅西汀組比較，實施例一組大鼠腦海馬組織中的Cyclic AMP含量顯著升高；cAMP_D印endent PKA活性顯著增強；p_CREB含量也有提聞。
[0109](2)本實驗證實了實施例一可以通過第二信使Cyclic AMP細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮藥理作用，并在給藥8小時后即可快速啟動cAMP-PKA-CREB (p-CREB)通路(與生理鹽水組和帕羅西汀組相比有顯著差異，*P < 0.05)。
[0110](3)同樣8小時給藥，陽性對照藥帕羅西汀并不能啟動cAMP-PKA-CREB (p-CREB)通 路。
[0111](4)本實驗結(jié)果尚且表明，實施例一中劑量組可顯著抑制大鼠海馬組織中磷酸二酯酶的活性，由于磷酸二酯酶是Cyclic AMP的滅活酶，其受到抑制后可使大鼠海馬組織中Cyclic AMP含量升高。
[0112]實驗例二:慢性應(yīng)激小鼠給藥實施例一 10天，對cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及BDNF表達量影響之動物實驗。
[0113]1.實施例一對于重復(fù)應(yīng)激小鼠海馬cAMP濃度的影響(圖9):
[0114]圖9顯示結(jié)果:給藥實施例一的小鼠海馬cAMP濃度，明顯高于未給藥的模型組，*P
<0.05。
[0115]2.實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬PKA活性的影響(圖10):
[0116]圖10顯示結(jié)果:給藥實施例一的小鼠海馬PKA活性，明顯高于未給藥的模型組，*P
<0.05。
[0117]3.實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬CREB磷酸化的影響(圖11):
[0118]圖11顯示結(jié)果:給藥實施例一的小鼠海馬CREB磷酸化的表達，明顯高于未給藥的模型組。
[0119]4.實施例一對于慢性應(yīng)激小鼠海馬BDNF的影響(圖12):
[0120]圖12顯示結(jié)果:給藥實施例一的小鼠海馬內(nèi)BDNF的表達，明顯高于未給藥的模型組。
[0121 ] 實驗例三:慢性應(yīng)激大鼠給藥實施例一 21天，對海馬cAMP、PKA以及血清BDNF和下丘腦NE、DA、5HT等表達量影響之動物實驗。
[0122]1.實施例一對于慢性應(yīng)激大鼠海馬及皮質(zhì)cAMP濃度的影響(表1):
[0123]表1:各組大鼠海馬及皮質(zhì)cAMP表現(xiàn)量
【權(quán)利要求】
1.一種增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量及利用度的藥物組合物，包括: 一第一主要成份:包含人參皂甙Rgl、Rbl及Re ； 一第二主要成份:包含一甘草酸類，是選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及 一第三主要成份:包含一大棗環(huán)腺苷單磷酸制成。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物,其中該藥物組合物包括2~26重量份的該人參皂式Rgl及Rbl、3~48重量份的該甘草酸類及0.002~0.5重量份的該大率環(huán)腺苷單磷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物,其中該藥物組合物包括4~13重量份的該人參皂式Rgl及Rbl、5~16重量份的該甘草酸類及0.01~0.1重量份的該大率環(huán)腺苷單磷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中該藥物組合物含有選自藥學(xué)上可接受的一載體、一添加劑及其組合之一。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中該藥物組合物制成一劑型，該劑型系選自一錠劑、一膠囊劑、一散劑、一片劑、一粉劑、一溶液劑、一微囊劑、一混懸劑、一乳劑、一顆粒劑、一滴丸劑、一丸劑及藥劑學(xué)上的一口服藥物劑型其中之一。
6.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中該藥物組合物可以制成預(yù)防和治療體內(nèi)及細(xì)胞中cAMP含量及利用度低下、強化細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、強化BDNF表現(xiàn)量、增加腦內(nèi)DA、NE及5HT神經(jīng)遞質(zhì)含量和增強記憶力的藥物、保健食品和營養(yǎng)劑。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中該藥物組合物還包含一第四主要成分，其是選自一生姜粉及生姜萃取物及其組合之一。
8.一種增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸利用度的藥物組合物，包括: 一第一主要成份:包含人參皂甙Rgl、Rbl及Re ； 一第二主要成份:包含一甘草酸類，是選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及 一第三主要成份:包含一大棗環(huán)腺苷單磷酸制成。
9.一種制造增加體內(nèi)環(huán)腺苷單磷酸含量之一藥物組合物的方法，包括: 提供一第一主要成份，其中該第一主要成分包含人參皂甙RgURbl及Re ； 提供一第二主要成份，其中該第二主要成分包含一甘草酸類，是選自一甘草酸、一甘草次酸及其組合之一；以及 提供一第三主要成份，其中該第三主要成分包含一大棗環(huán)腺苷單磷酸，以制成該醫(yī)藥組合物。
【文檔編號】A61K31/7076GK103585169SQ201210290270
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月15日
【發(fā)明者】邢之光 申請人:戚郁芬