I型組蛋白去乙?；敢种苿┰谝种颇I臟纖維化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了I型HDAC抑制劑在制備抑制促纖維化受體的組合物或藥物中的用途。本發(fā)明還提供I型HDAC抑制劑在抑制TβRI、EGFR和PDGFR中的用途，以及體外非治療性的抑制腎臟細(xì)胞纖維化的方法。本發(fā)明的抑制劑在抑制促纖維化受體的同時(shí)不影響拮抗纖維化的受體的表達(dá)和磷酸化，因此是一種選擇性抑制劑，從而能夠作為副作用低的纖維化治療藥物。
【專利說明】I型組蛋白去乙?；敢种苿┰谝种颇I臟纖維化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及利用I型組蛋白去乙酰化酶抑制劑抑制腎臟纖維化。
【背景技術(shù)】
[0002]組蛋白去乙?；?HDAC)是一類酶家族，其除去組蛋白的乙?；猿聊蜣D(zhuǎn)錄[1，2]并催化許多非組蛋白蛋白質(zhì)去乙?；痆3-7]以調(diào)節(jié)它們的功能。HDAC有四類:1型(HDAC1、2、3 和 8) ；11 型(HDAC4、5、6、7、9 和 10)、III 型(SIRT1-7)和 IV 型(HDACll) [8]。前兩類型的HDAC認(rèn)為是“經(jīng)典” HDAC，是目前用于治療癌癥和其它疾病的泛-HDAC抑制劑(SP，曲古抑菌素A(TSA)、伏立諾他)的主要靶點(diǎn)[8，9]。
[0003]除了腫瘤外，HDAC抑制劑還對一些非惡性疾病顯示治療作用。例如，HDAC抑制劑能有效緩解一些神經(jīng)退化性疾病[10，11]并減輕心臟[12，13]、肝臟[14，15]和皮膚[16]的組織纖維化。因此，HDAC可以成為治療慢性腎病(CKD)的新型靶點(diǎn)。然而，HDAC抑制作用介導(dǎo)腎臟纖維化的減弱的分子機(jī)理未知。
[0004]大多數(shù)CKD的發(fā)病機(jī)理涉及導(dǎo)致腎臟纖維化的血液動(dòng)力學(xué)和炎性過程復(fù)雜機(jī)制，其特征在于腎臟成纖維細(xì)胞的活化和過量胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的累積[27，18]。以前的研究證明許多細(xì)胞因子和生長因子是刺激成肌纖維細(xì)胞增殖/活化以及誘導(dǎo)ECM產(chǎn)生的強(qiáng)效有絲分裂原[19，20]。這些生長因子和細(xì)胞因子通過與其受體結(jié)合施加其生物學(xué)效應(yīng)。各種慢性腎病顯示幾種細(xì)胞因子/生長因子受體的表達(dá)增加，包括轉(zhuǎn)化生長因子受體(T^R) [21]、表皮生長因子受體(EGFR) [22-24]和血小板衍生生長因子受體(I3DGFR) [25]。通過藥學(xué)或遺 傳學(xué)方法抑制T β R、EGFR和TOGFR能在動(dòng)物模型中減弱腎臟纖維化[26-30]。這提示這些受體在腎臟纖維發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。
[0005]最近的研究表明，HDAC抑制劑能抑制包括EGFR在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，伏立諾他或TSA通過EGFR mRNA的轉(zhuǎn)錄阻遏降低EGFR在肺和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)[31，32];抑制HDAC6增強(qiáng)EGFR的內(nèi)吞作用以及隨后通過微管蛋白乙酰化增加的降解
[33]。在培養(yǎng)的近曲小管細(xì)胞和糖尿病大鼠腎臟中，伏立諾他也顯示降低EGFR蛋白和mRNA水平，并減弱細(xì)胞增殖[34]。因此，細(xì)胞因子/生長因子受體可以是HDAC抑制劑的靶點(diǎn)。
[0006]與上述受體相反，外源性肝細(xì)胞生長因子激活C-Met緩解了腎臟間質(zhì)纖維化
[35]，從而提示c-Met作為抗纖維化介質(zhì)的重要作用。
[0007]因此，本領(lǐng)域急需能導(dǎo)致T β R,PDGFR和EGFR下調(diào)，但同時(shí)能維持c_Met水平的治療方法和藥物來治療腎臟纖維化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供能下調(diào)促纖維化受體，但不影響拮抗纖維化的受體的藥物組合物和治療方法，從而能治療腎臟纖維化。
[0009]在第一方面，本發(fā)明提供I型HDAC抑制劑的用途，所述I型HDAC抑制劑用于制備抑制促纖維化受體的組合物。
[0010]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物。
[0011]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述促纖維化受體選自下組
[0012]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或所述組合物不影響c-Met的表達(dá)或磷酸化。
[0013]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。 [0014]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物組合物用于抑制腎臟纖維化。
[0015]在第二方面，本發(fā)明提供I型HDAC抑制劑的用途，所述I型HDAC抑制劑用于制備治療或預(yù)防腎臟纖維化的藥物。
[0016]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述I型HDAC抑制劑包括MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0017]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物還抑制選自下組的一種或多種促腎臟纖維化受體:Τ β R1、EGFR 和 PDGFR。
[0018]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或所述藥物不影響c-Met的表達(dá)或磷酸化。
[0019]在第三方面，本發(fā)明提供I型HDAC抑制劑在抑制TPR1、EGFR和TOGFR中的用途。
[0020]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抑制是非治療性的和體外的。
[0021]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述I型HDAC抑制劑還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或
[0022]所述I型HDAC抑制劑不影響c_Met的表達(dá)或磷酸化；和/或
[0023]所述I型HDAC抑制劑還抑制腎臟纖維化。
[0024]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0025]在第四方面，本發(fā)明提供體外非治療性的抑制腎臟細(xì)胞纖維化的方法，其特征在于，包括步驟:在I型HDAC抑制劑存在下，培養(yǎng)腎細(xì)胞，從而抑制腎臟細(xì)胞的纖維化；
[0026]較佳地，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0027]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1顯示了 MS-275降低梗阻腎臟中的ECM沉積。(A)顯示各種處理后腎臟組織的Masson染色的顯微照片。(B)相對于10個(gè)隨機(jī)腎皮質(zhì)的整個(gè)面積，分析Masson-陽性腎小管間質(zhì)面積(藍(lán)色)(200X)(平均值土SEM)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值彼此顯著不同(P〈0.05)。
[0029]圖2顯示了 MS-275抑制梗阻腎臟中膠原1、纖連蛋白、a -SMA的表達(dá)并增強(qiáng)乙?；?組蛋白Η3的表達(dá)。腎臟組織裂解物用纖連蛋白、膠原1、α -SM,乙酰基-組蛋白Η3或GAPDH的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法定量纖連蛋白(B)、膠原I (C), a -SMA (D)、乙?；?組蛋白Η3 (E)的表達(dá)水平，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0030]圖3顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導(dǎo)T β RI表達(dá)和smad3磷酸化的作用。在所示時(shí)間點(diǎn)(A)或在輸尿管梗阻后第7天(B)收集腎臟組織，細(xì)胞裂解物分別用T β RI (A, B)、p-Smad和Smad(B)的特異性抗體作免疫印跡分析。通過光密度分析法分別定量T β RI和p-Smad的表達(dá)水平，并用GAPDH和Smad3標(biāo)準(zhǔn)化(C，D)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0031]圖4顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導(dǎo)TOGFR表達(dá)和磷酸化的作用。在所示時(shí)間點(diǎn)㈧或在輸尿管梗阻后第7天(B)收集腎臟組織，細(xì)胞裂解物用P-PDGFRP和TOGFRi^的特異性抗體作免疫印跡分析(A，D)。通過光密度分析法分別定量p-PDGFRi3和TOGFRi^的表達(dá)水平，并用I3DGFRP (B, E)和GAPDH(C，F(xiàn))標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0032]圖5顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導(dǎo)EGFR表達(dá)和磷酸化以及Lcn2表達(dá)的作用。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織，細(xì)胞裂解物用p-EGFR、EGFR或Lcn_2的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法分別定量p-EGFR(B)、EGFR (C)或Lcn_2 (D)的表達(dá)水平，并用EGFR或GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0033]圖6顯示了 MS-275對梗阻腎臟中G2/M期的上皮細(xì)胞細(xì)胞周期停滯和TGF-β I表達(dá)的作用。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織。顯微照片顯示絲氨酸10的P-組蛋白Η3有免疫熒光染色(紅色)(A)。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)腎皮質(zhì)視野中的P-組蛋白Η3-陽性細(xì)胞(200 X)(平均值土 SEM)⑶。組織裂解物用絲氨酸10的P-組蛋白Η3的特異性抗體作免疫印跡分析(C)。采用ELISA測定腎臟組織提取物的TGF-β 1(D)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0034]圖7顯示了 MS-275對梗阻腎臟中c_Met的磷酸化和MET表達(dá)的作用。在所示時(shí)間點(diǎn)(A)或在輸尿管梗阻后第7`天(D)收集所示各種處理后的腎臟組織，細(xì)胞裂解物用p-c-Met和MET的特異性抗體作免疫印跡分析(A，D)。通過光密度分析法定量不同組中p-c-MET (B, E)和c-MET (C，F(xiàn))的表達(dá)水平，并用MET或GAPDH(B)標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0035]圖8顯示了 MS-275對梗阻腎臟中STAT3和ERK1/2磷酸化的作用。腎臟組織裂解物用磷酸-STAT3 (p-STAT3)、STAT3、磷酸-ERK1/2 (p-ERKl/2)和ERK1/2的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法定量p-STAT3、STAT3、p-ERKl/2和ERK1/2的表達(dá)水平。激活的 STAT3 ⑶和 ERK1/2 (D)分別用 p_STAT3/STAT3、p-ERK/ERK 之比表述。用 GADPH 標(biāo)準(zhǔn)化STAT3(C)和ERK1/2(E)的蛋白質(zhì)水平。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0036]圖9顯示了 MS275對培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGF-β I誘導(dǎo)膠原1、a -SMA和纖連蛋白及乙?；?組蛋白Η3表達(dá)的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饑餓的NRK-49F細(xì)胞與2ng/ml TGF- β I溫育24小時(shí)。細(xì)胞裂解物用膠原1、a -SMA、纖連蛋白、乙?；?組蛋白Η3或GAPDH(A)和T β R1、p_Smad3或Smad3 (E)的抗體作免疫印跡分析(A)。此為三個(gè)或更多個(gè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化(B、C、D)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0037]圖10顯示了 MS275對培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞中H)GFR、EGFR、cMET、STAT3和ERK1/2的磷酸化和表達(dá)的作用。將不同劑量的Μ3-275(0-2.0μΜ)直接加入血清培養(yǎng)的NRK-49F，并溫育24小時(shí)。細(xì)胞裂解物用所示蛋白質(zhì)的抗體作免疫印跡分析(Α，Ε)。此為三個(gè)或更多個(gè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。分別用它們本身的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化P-DGFRP、p-EGFR和p-c-MET。用α -微管蛋白標(biāo)準(zhǔn)化TOGFR、EGFR和c-MET。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0038]圖11顯示了 MS275對培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞中膠原1、a -SMA、纖連蛋白和乙?；?組蛋白Η3表達(dá)的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饑餓的NRK-49F細(xì)胞與5%FBS溫育24小時(shí)。制備細(xì)胞裂解物，用膠原1、a -SMA、纖連蛋白、或乙?；?組蛋白Η3或GAPDH(A)的抗體作免疫印跡分析(A)。此為三個(gè)或更多個(gè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化(B、C、D)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0039]圖12顯示了 MS275對培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖的作用。NRK-49F細(xì)胞血清饑餓24小時(shí)(對照)，然后在MS-275不存在或2.0 μ M(A)或0-2.0 μ M MS-275 (B-E)存在下，在含5%FBS(A-C)或2ng/ml TGF-β I的DMEM中溫育48小時(shí)。相差照片(200X)顯示MS-275對細(xì)胞增殖的作用(A)。通過計(jì)數(shù)細(xì)胞(B，D)或通過MTT試驗(yàn)(C，E)評估細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0040]圖13顯示MS-275改善了 UUO損傷后的腎臟破壞作用。顯微照片顯示了各種處理后腎臟組織的PAS染色(A)?；诜椒ㄖ忻枋龅脑u分表，對形態(tài)改變評分(B)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(n=6)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0041]圖14顯示MS-275降低梗阻腎臟中的Lcn2表達(dá)。輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織。顯微照片顯示所示各種處理后Lcn2的免疫熒光染色(A)。計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)腎皮質(zhì)視野中的Lcn-2陽性細(xì)胞(200X)(平均值土SEM) (B)。上標(biāo)字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0042]圖15顯示MS-275不誘導(dǎo)腎臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在有或無2 μ M MS-275存在下，NRK-49F細(xì)胞與5%FBS培養(yǎng)36小時(shí)，或在有或無Η202250 μ M存在下培養(yǎng)2小時(shí)，收集細(xì)胞，進(jìn)行免疫印跡分析活化的PARP和caspase-3。
[0043]圖16顯示TSA抑制I/II型HDAC阻止梗阻腎臟中UUO-誘導(dǎo)的T β RI表達(dá)和EGFR及TOGFR的磷酸化/表達(dá)。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織(A-C)，細(xì)胞裂解物用T β RI或 GADPH ⑷、p-EGFR、EGFR 或 α -微管蛋白⑶、p-PDGFR β、PDGFR β 或 GADPH(C)的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。顯示了 3個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性免疫印跡。
【具體實(shí)施方式】
[0044]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)特異性I型HDAC抑制劑不僅下調(diào)介導(dǎo)腎臟纖維化的生長因子受體，還能維持具有抗纖維化作用的受體的完整性，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)特異性I型HDAC抑制劑能夠作為腎臟纖維化的治療藥物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0045]促纖維化受體[0046] 本文所用的術(shù)語“促纖維化受體”表示在纖維發(fā)生中表達(dá)或活性增加并在其中起至關(guān)重要作用的細(xì)胞因子受體和生長因子受體。在具體的實(shí)施方式中，所述促纖維化受體包括轉(zhuǎn)化生長因子-β受體(Τβ R)、表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)。
[0047]HDAC 抑制劑
[0048]本文所用的術(shù)語“HDAC抑制劑”具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，即，能夠抑制、阻遏、降低、減弱或破壞HDAC表達(dá)或活性的物質(zhì)。類似地，本文所用的術(shù)語“I型HDAC抑制劑”表示能夠特異性抑制、阻遏、降低、減弱或破壞I型HDAC的表達(dá)或活性，而對其它類型的HDAC沒有影響的物質(zhì)。
[0049]在具體的實(shí)施方式中，可選擇的I型HDAC抑制劑有MS-275和SK7041。據(jù)報(bào)道用 MS-275(Anticancer Drugs,2011, 22(6), 494-9)和 SK7041(Kim, IA, Ii CancerRes.2006, 12:940-9)處理能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0050]在治療腎臟纖維的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275。
[0051]此外，據(jù)報(bào)道，I型和II型HDAC有相反作用，II型HDAC可抑制心臟肥大而I型HDAC促進(jìn)心臟肥大。因此，如果同時(shí)抑制I型和II型HDAC，會抵消抑制I型HDAC帶來的治療益處。所以，特異性的I型HDAC抑制劑會產(chǎn)生遠(yuǎn)高于泛HDAC抑制劑所產(chǎn)生的治療益處。
[0052]MS-275
[0053]MS-275，也稱為Entinostat，是一種合成的苯酰胺組蛋白抑制劑。MS-275是特異性針對I型HDAC的新一代HDAC抑制劑，其抑制I型HDAC中的HDACl和HDAC3。MS-275的結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)氨苯基，與其它HDAC抑制劑(如trichostatin A)的分子結(jié)構(gòu)不同。分子式為C21H2tlN4O3,分子量為376.4085。MS-275對于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和其它惡性腫瘤也顯示有作為抗腫瘤藥物的治療潛能[36，37]。
[0054]藥學(xué)上可接受的鹽
[0055]本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”表示MS-275與酸(包括有機(jī)酸和無機(jī)酸)或堿(包括有機(jī)堿或無機(jī)堿)形成的鹽，其中所述鹽具備與MS-275相同或基本上相似的藥理學(xué)活性，并且對施用對象無毒副作用。
[0056]本發(fā)明所用的材料與方法
[0057]化學(xué)試劑與抗體
[0058]p-STAT3、STAT3、p_Smad3、Smad3、p-ERKl/2、ERK1/2、ρ-EGF 受體、p-PDGF β 受體、PDGF^受體、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、p-Met、乙?；?組蛋白H3、切割的胱冬酶-3、切割的 PARP 抗體購自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)。Met、纖連蛋白、膠原 I (A2)、GAPDH, EGF 受體、HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8 抗體購自 Santa Cruz。MS-275、a-SMA和α -微管蛋白抗體和其他化學(xué)試劑購自Sigma (St.Louis, MO)。lipocalin_2、TGF-β 1、TGF-β I 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自 R&D systems (Minneapolis, MN)。HDAC 試驗(yàn)試劑盒購自 Upstate (Lake Placid, NY)。
[0059]細(xì)胞培養(yǎng)與處理
[0060]370C，5%C02和95%空氣的氣氛下，將NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng)于Dulbecco改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基(DMEM) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)，其含有 5% 胎牛血清(FBS)、0.5% 青霉素和鏈霉素。為檢測MS-275對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響，將MS-275直接加入亞融合的NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng)基中，后按圖中指定的時(shí)間孵育。NRK-49F以0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓24小時(shí)，然后加入TGF-β I (2ng/ml), 24小時(shí)。
[0061]測定細(xì)胞增殖
[0062]細(xì)胞增殖效率以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_聯(lián)苯基四唑鎗溴化物(MTT)方法檢測，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。對MTT檢測，將MTT加入(終濃度，0.5mg/ml)培養(yǎng)基中，2小時(shí)。二甲基亞砜釋放四唑，分光光度計(jì)在570nm波長處讀數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)，不同干預(yù)后以胰蛋白酶處理細(xì)胞，0.4%臺盼藍(lán)染色。不同細(xì)胞計(jì)數(shù)使用顯微鏡下血球計(jì)數(shù)法完成。
[0063]UUO模型和MS-275處理
[0064]UUO 模型由雄性 C57 小黑鼠建立，重約 20_25g (Jackson Laboratory, BarHarbor，ME)，如以前實(shí)驗(yàn)所述[38]。簡要地說，在腹部正中切口，左側(cè)輸尿管分離、結(jié)扎。為檢測MS-275對UUO損傷誘導(dǎo)的腎臟纖維化的影響，將MS-275 (20mg/kg)溶于50 μ I DMSO中，UUO損傷后立即腹腔注射，每日相同劑量。對照組，只分離不結(jié)扎輸尿管，每日注入等劑量的DMS0。7天后殺死小鼠，切取腎臟，進(jìn)行mRNA、蛋白和組織學(xué)檢測。
[0065]免疫熒光和免疫組化染色
[0066]免疫熒光和免疫組化染色如以往的常規(guī)方法進(jìn)行[38]。腎組織固定于4.5%緩沖福爾馬林中，脫水，石蠟切片包埋。腎臟普通組織學(xué)分析，使用PAS染色。免疫熒光染色，一抗乙?；?組蛋白H3 (1:200)、a-SMA (1:200)和熒光二抗(1:200)用于檢測熒光表達(dá)。每塊腎組織的檢查和評分(每種情況評估I次)，由腎臟病理科(L.Wang)雙盲法檢測得到。形態(tài)學(xué)損傷(上皮細(xì)胞壞死，管腔壞死和小管擴(kuò)張)每塊腎臟切3-4片，每片10-12視野，按下述比例定量分析:(none=0 ；<10%=1 ;11_25%=2 ;26_75%=3 ;和>75%=4)。為評估腎臟纖維化的程度，三色法馬松染色按說明書完成(Sigma，St.Louis，MO)。膠原組織面積(藍(lán)色區(qū)域)使用 Image Pro-Plus 軟件(Media-Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)定量分析，畫線法，圍繞陽性染色區(qū)域邊界，每個(gè)顯微鏡視野的(400X)平均比率計(jì)算和繪制完成。
[0067]免疫印跡分析
[0068]NRK-49F細(xì)胞核組織切片的免疫印跡分析按通常的方法完成。灰度值分析以NIH軟件計(jì)算完成(National Institutes of Health, Bethesda, MD)。
[0069]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0070]全部實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。圖中的數(shù)值以均值土標(biāo)準(zhǔn)差代表。組間比較采用單因素方差分析(One-way analysis of variance, AN0VA)。多均數(shù)比較采用Tukey實(shí)驗(yàn)。兩組間差異比較采用Student t-檢驗(yàn)。圖中統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異性，以P〈0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0071]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0072]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)特異性I型HDAC抑制劑能夠降低致纖維化生長因子受體的表達(dá)，但不影響具有抗纖維化作用的受體的表達(dá)，因此特異性I型HDAC抑制劑的抑制作用具有選擇性，其副作用較低，是一種理想的腎臟纖維化治療藥物。
[0073]下面 結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0074]本發(fā)明進(jìn)行的所有動(dòng)物研究均得到羅德島醫(yī)院科研動(dòng)物照料和使用委員會的批準(zhǔn)。
[0075]實(shí)施例1.MS-275抑制I型HDAC減弱UUO損傷后腎臟纖維化的發(fā)展
[0076]發(fā)明人研究了特異性的I型HDAC抑制劑一 MS-275在UUO小鼠誘導(dǎo)的腎臟纖維化進(jìn)展中的作用。如圖1所示，UUO損傷誘導(dǎo)膠原沉積，三色法馬松染色顯示注射MS-275導(dǎo)致膠原沉積明顯減少。馬松染色顯示區(qū)域半定量分析顯示與假手術(shù)組比較，梗阻組ECM蛋白沉積升高6倍。UUO后MS-275治療導(dǎo)致腎臟纖維化下降90%，與UUO組比較。除此之外，MS-275也改善了損傷腎臟的形態(tài)學(xué)，如腎小管擴(kuò)張改變(圖13)。上述數(shù)據(jù)顯示，I型HDAC在腎臟纖維化發(fā)展中起到重要作用；MS-275是有效的抗纖維化藥物。
[0077]實(shí)施例2.MS-275抑制梗阻腎臟中纖連蛋白、膠原I和a -SMA的表達(dá)
[0078]腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和ECM蛋白過度堆積是啟動(dòng)慢性腎臟纖維化關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，發(fā)明人檢測了 MS-275對a -SMA(腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物)、纖連蛋白、I型膠原(兩種主要的梗阻性腎病ECM蛋白)表達(dá)的影響。圖2A-D，a -SMA和I型膠原的水平，UUO組較假手術(shù)(Sham)組明顯升高。MS-275干預(yù)大部分阻斷了梗阻性腎病中a-SMA的表達(dá)，使I型膠原下降到基礎(chǔ)水平。MS-275并不影響a-SMA和I型膠原在對照組中的表達(dá)。盡管纖連蛋白在Sham組中檢測不到，UUO損傷后其表達(dá)上調(diào)。MS-275治療后阻斷了纖連蛋白表達(dá)。MS-275抑制HDAC的效率，由免疫印跡技術(shù)檢測乙酰化組蛋白Η3表達(dá)來評估。圖2Α, E顯示乙?；M蛋白Η3在Sham組腎臟中幾乎檢測不到，UUO損傷后其表達(dá)輕度下降，MS-275干預(yù)后上調(diào)了乙?；M蛋白表達(dá)，5倍增長，梗阻性腎病與Sham組相比?？傊陨蠑?shù)據(jù)提示I型HDAC在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化和UUO損傷后的ECM蛋白沉積作用中至關(guān)重要。
[0079]實(shí)施例3.MS-275抑制梗阻腎臟中T β RI表達(dá)和Smad3活化
[0080]TGF- β受體表達(dá)上調(diào)和Smad信號通路激活是腎臟纖維化的主要發(fā)生機(jī)制。
[0081]在三種TGF-β受體(TGF-β I型、II型、III型受體)中，TGF-β I型受體可以直接作用并使Smad3磷酸化，激活其下游信號。因此，發(fā)明人以免疫印跡技術(shù)檢測了 TGF-β I型受體和Smad3磷酸化情況。圖3A顯示，單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)TGF- β I型受體呈時(shí)間依賴性增長，在手術(shù)后7天開始上調(diào)、14天達(dá)到高峰，持續(xù)至少21天。與其一致，輸尿管結(jié)扎也誘導(dǎo)了 Smad3磷酸化。MS-275注射后阻斷了上述反應(yīng)(圖3B、C、D)。Smad3在Sham組腎臟中仍大量表達(dá)，在UUO損傷組中，MS-275干預(yù)組與單純UUO組其表達(dá)不受影響(圖3B)。這些數(shù)據(jù)顯示UUO損傷誘導(dǎo)了 TGF- β I型受體和Smad3磷酸化表達(dá)上調(diào)，阻斷I型HDAC活性抑制了 TGF-β信號通路活化。
[0082]實(shí)施例4.MS-275抑制梗阻腎臟中PDGFR的磷酸化和表達(dá)
[0083]TOGFR在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎臟旁細(xì)胞中大量表達(dá)，在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎臟旁細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。TOGFR總蛋白的基礎(chǔ)水平而不是磷酸化TOGFR，在Sham組腎臟中可以檢測到。UUO損傷誘導(dǎo)了 I3DGFR蛋白水平表達(dá)增加和其磷酸化，呈時(shí)間依賴性增加，UUO術(shù)后21天達(dá)到高峰(圖4A、B、C)。注射MS-275完全阻斷了PDGFR磷酸化并抑制了梗阻性 腎病I3DGFR表達(dá)下降到基礎(chǔ)水平(圖4D、E、F)。這些數(shù)據(jù)顯示，PDGFR亦受I型HDAC調(diào)控。[0084]實(shí)施例5.MS-275抑制梗阻腎臟中EGFR和Lcn2的磷酸化和表達(dá)[0085]以前的研究顯示，EGFR活化有助于延遲性腎臟缺血、腎切除、血管緊張素II注射損傷導(dǎo)致的腎臟纖維化發(fā)展。發(fā)明人的研究也顯示，UUO損傷誘導(dǎo)了持續(xù)性總EGFR和磷酸化EGFR表達(dá)，其在腎臟纖維化中至關(guān)重要。在本文中，發(fā)明人檢測了 MS-275是否影響UUO模型中EGFR的表達(dá)和活化。如圖5A、B、C所示，MS-275注射阻斷了 EGFR磷酸化，也明顯降低梗阻性腎病中EGFR的表達(dá)。與此一致的是，MS-275降低了載脂蛋白2(也稱為中性粒細(xì)胞明膠相關(guān)蛋白，Lcn2)的表達(dá)。Lcn2可調(diào)控腎臟纖維化，是EGFR下游調(diào)控基因(圖5D)。免疫熒光顯示Lcn2主要表達(dá)部位為UUO損傷后的小管上皮細(xì)胞，在Sham組中未檢測到Lcn2表達(dá)(圖14)。因此MS-275在抑制EGFR信號通路也是有效的。
[0086]實(shí)施例6.MS-275抑制上皮細(xì)胞細(xì)胞周期G2/M停滯和TGF- β I產(chǎn)生
[0087]有證據(jù)顯示腎臟上皮細(xì)胞周期G2/M逃逸導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為顯著的前纖維化細(xì)胞型，該類細(xì)胞可釋放TGF-β I。發(fā)明人最近的研究顯示腎臟上皮細(xì)胞G2/M逃逸由EGFR介導(dǎo)，MS-275 能夠抑制 EGFR 表達(dá)和磷酸化(J Am Soc Nephrol, 23 (5):854-67, 2012) ? 因此，MS-275抑制上皮細(xì)胞周期逃逸是可能的。為了驗(yàn)證這種假設(shè)，發(fā)明人檢測了腎小管絲氨酸10位點(diǎn)的磷酸化組蛋白H3，G2/M階段細(xì)胞逃逸的標(biāo)志物，使用免疫熒光染色和免疫組化分析。p-H3染色陽性的細(xì)胞僅僅偶爾被觀察到少量表達(dá)在Sham組和MS-275單獨(dú)治療組，但在UUO損傷組明顯表達(dá)上調(diào)。MS-275干預(yù)的UUO小鼠p_H3染色陽性細(xì)胞明顯減少(圖6A，B)。免疫印跡提示，P-H3在Sham組小鼠中幾乎檢測不到，在UUO損傷后其表達(dá)上調(diào)，MS-275干預(yù)后阻斷了 p-H3表達(dá)(圖6C)。因?yàn)樾」芗?xì)胞G2/M逃逸，增加了 TGF-β I產(chǎn)生，發(fā)明人通過ELISA方法，進(jìn)一步檢查了 MS-275對TGF-β I表達(dá)水平的影響。圖6D顯示，UUO損傷使TGF- β I產(chǎn)生增加，大部分被MS-275干預(yù)所抑制。這些數(shù)據(jù)顯示，抑制HDAC能夠降低TGF- β I產(chǎn)生，通過減輕損傷腎臟小管上皮細(xì)胞G2/M逃逸所致。
[0088]實(shí)施例7.MS-275不影響梗阻后腎臟中c_MET的磷酸化和表達(dá)
[0089]與前面所述3個(gè)受體相比，c-MET被配體(肝細(xì)胞生長因子)激活，可保護(hù)腎臟組織、抑制腎臟纖維化進(jìn)展，已在很多腎臟病模型中被報(bào)道。因此，發(fā)明人進(jìn)一步檢查了 UUO損傷及抑制HDAC活性對C-MET表達(dá)和磷酸化的影響。
[0090]結(jié)果表明，總c-MET及磷酸化c-MET在UUO損傷后上調(diào)，并呈時(shí)間依賴性(圖7A-C)。然而，MS-275干預(yù)并不影響c-MET磷酸化和表達(dá)(圖7D、E、F)。因此，HDAC看來不參與UUO損傷腎臟c-MET的活化和表達(dá)。
[0091]實(shí)施例8.MS-275抑制梗阻后腎臟中STAT3和ERK1/2的磷酸化
[0092]STAT3和ERK1/2信號通路在梗阻性腎病被活化，并與腎臟纖維化進(jìn)展和前纖維化細(xì)胞因子如TGF-β I釋放有關(guān)。因?yàn)檫@些信號通路是很多生長因子和細(xì)胞因子受體活化的結(jié)果，并且MS-275治療降低了 EGFR和TOGFR信號通路，因此推測抑制HDAC活性可能抑制STAT3和ERK1/2信號通路激活。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，發(fā)明人檢測了 MS-275對梗阻性腎病STAT3和ERK1/2磷酸化的影響。UUO損傷誘導(dǎo)了 STAT3磷酸化，并上調(diào)了總STAT3的表達(dá)。MS-275注射后完全阻斷了 STAT3磷酸化并大部分阻斷了其蛋白總體水平表達(dá)(圖8A-C)。ERKI/2磷酸化和表達(dá)在UUO損傷后亦上調(diào)。MS-275干預(yù)使ERK1/2磷酸化降低到基礎(chǔ)水平，但僅部分降低了總ERK1/2表達(dá)水平(圖8Α，D, Ε)。這些數(shù)據(jù)提示HDAC也調(diào)控了 STAT3和ERKI/2磷酸化和表達(dá)。[0093]實(shí)施例9.MS-275阻斷培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGF-β I誘導(dǎo)的膠原I和a-SMA及纖連蛋白的表達(dá)
[0094]TGF-β I能夠誘導(dǎo)靜止的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞變型為肌成纖維細(xì)胞。為直接闡明I型HDAC在TGF-β I誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化中的作用，我們在有或無MS-275存在情況下，以TGF-β I刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F)。TGF-β I (2ng/ml)刺激NRK-49F 24小時(shí)，導(dǎo)致I型膠原和α平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)和纖連蛋白的表達(dá)增加。MS-275以劑量依賴性方式抑制了上述三種蛋白表達(dá)(圖9A-C)，提示MS-275可抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化。MS-275以劑量依賴性方式上調(diào)乙?；M蛋白H3(圖9A，D)。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致的，MS-275抑制了梗阻性腎病中TGF-β RI和Smad3磷酸化，而Smad3表達(dá)不受藥物影響(圖9E)。這些數(shù)據(jù)，連同MS-275對TGF-β RI和a -SMA和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在損傷性腎臟中的抑制效果，提示I型HDAC在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化和腎間質(zhì)纖維化中起關(guān)鍵作用。
[0095]實(shí)施例10.MS-275阻斷血清誘導(dǎo)的H)GFR、EGFR，而非c-MET的磷酸化和表達(dá)并激活培養(yǎng)的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞
[0096]除了 TGF-β外，在腎間質(zhì)纖維化中，其他細(xì)胞因子也被釋放到腎間質(zhì)，刺激受體活化和誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。因?yàn)檠逯邪艘幌盗袕?fù)雜的細(xì)胞因子，能夠刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，發(fā)明人進(jìn)一步檢測了 MS-275在5%血清培養(yǎng)基時(shí)對生長因子受體(EGFR、H)GFR、c-Met)磷酸化和表達(dá)的影響。如圖10所示，MS-275治療以劑量依賴性抑制了 EGFR和TOGFR的磷酸化和表達(dá)。而c-Met磷酸化和表達(dá)不受藥物影響(圖10A-D)。我們也觀察了 MS-275可抑制STAT3和ERKI/2磷酸化(圖10E)。
[0097]除此之外，發(fā)明人檢查了 HDAC對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察的一致，MS-275治療抑制了腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，在培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中抑制了I型膠原、a -SMA和纖連蛋白表達(dá)(圖11Α，B)。MS-275抑制了 HDAC，增加了乙?；M蛋白Η3的作用(圖11Α，D)。總之，這些數(shù)據(jù)提示I型HDAC是腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并且MS-275在抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化是有效的。
[0098]實(shí)施例11.MS275抑制血清和TGF- β 1-刺激的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖
[0099]腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖有助于間質(zhì)纖維化進(jìn)展。為確定I型HDAC在這個(gè)過程中的作用，MS-275直接加入5%FBS的培養(yǎng)基，或血清饑餓細(xì)胞以TGF-β I (2ng/ml)刺激。細(xì)胞增殖評估通過MTT技術(shù)或計(jì)算細(xì)胞數(shù)目完成。MS-275刺激細(xì)胞24小時(shí)明顯降低了血清或TGF-β I引起的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖(圖12A-E)。MS-275的抑制效應(yīng)以劑量依賴性增強(qiáng)，0.5 μ M起效，在2 μ M達(dá)到最高抑制效果。明顯的，MS-275并不抑制細(xì)胞增殖，而不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因?yàn)镸S-2752 μ M處理并不誘導(dǎo)切割PARP或切割胱冬酶3表達(dá)，2個(gè)凋亡指標(biāo)。作為陽性對照，切割PARP或切割胱冬酶3在H2O2暴露的同型細(xì)胞3小時(shí)可檢測到表達(dá)(圖 15)。
[0100]實(shí)施例12.給予TSA導(dǎo)致UUO損傷后腎臟中的T β RI, EGFR和TOGFR下調(diào)
[0101]發(fā)明人最近的研究提示，注射TSA，一種泛HDAC抑制劑，同時(shí)抑制I型和II型HDAC活性，也會抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化和增殖，減輕UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化的進(jìn)展(Am JPhysiol Renal Physiol.2009; 297:F996_F1005)。發(fā)明人還進(jìn)一步檢查了 TSA 對 3 種前纖維化生長因子受體表達(dá)和磷酸化的影響，如以上描述的。與MS-275對這些受體的影響一致，TSA干預(yù)也導(dǎo)致了這3種受體的下調(diào)，抑制了 EGFR、PDGFR的磷酸化(圖16)。TSA和MS-275相似的抑制效果，提示I型而不是II型HDAC在介導(dǎo)前纖維化生長因子下調(diào)方面起
基本作用。
[0102]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0103]參考文獻(xiàn)
[0104]1.Thiagalingamj S.，Chengj K.H.，Leej H.J.，Minevaj N.，Thiagalingamj A.，和Ponte, J.F.2003.Histone deacetylases:unique players in shaping the epigenetichistone code.Ann N Y Acad Sci 983:84-100.[0105]2.Ran, Q.C.，Headleej D.，Acharyaj M.，Sparreboomj A.，Trepe I, J.B.，Yej J.，F(xiàn)iggj W.D.，Hwang, K.，Chung, E.J.，Murgoj A 等.，2005.Phase I andpharmacokinetic study of MS-275, a histone deacetylase inhibitor, in patientswith advanced and refractory solid tumors or lymphoma.J Clin Oncol23:3912-3922.[0106]3.Walkinshawj D.R.，Tahmasebij S.，Bertosj N.R.和 Yang，X.J.2008.Histonedeacetylases as transducers and targets of nuclear signaling.J Cell Biochem104:1541-1552.[0107]4.Singh, B.N.，Zhang, G.，Hwaj Y.L，Li, J.，Dowdy, S.C.和 Jiang，S.W.Nonhistoneprotein acetylation as cancer therapy targets.Expert Rev Anticancer Ther10:935-954.[0108]5.Tang, X.，Gaoj J.S.，Guanj Y.J.，McLanej K.E.，Yuan, Z.L.，Ramratnamj B.和Chin,Y.E.2007.Acetyla·tion-dependent signal transduction for type I interferonreceptor.Cell 131:93-105.[0109]6.Ma，L.，Gao，J.S.，Guan，Y.，Shi，X.，Zhang, H.，Ayrapetov, M.K.，Zhang，Z.，Xu，L，Hyun，Y.M.，Kim，M等.，Acetylation modulates prolactin receptordimerization.Proc Natl Acad Sci USA 107:19314-19319.[0110]7.Yuan, Z.L，Guanj Y.J.，Chatter jee，D.和 Chin，Y.E.2005.Stat3 dimerizationregulated by reversible acetylation of a single lysine residue.Science307:269-273.[0111]8.Pang,M.和 Zhuang，S.Histone deacetylase: a potential therapeutictarget for fibrotic disorders.J Pharmacol Exp Ther 335:266-272.[0112]9.Kimj H.J.和 Bae，S.C.Hi stone deacetylase inhibitors: molecularmechanisms of action and clinicaltrials as ant1-cancer drugs.Am J Transl Res3:166-179.[0113]10.Soragnij E.，Xuj C.，Cooper, A.，Plasterer, H.L.，Ruschej J.R.和Gottesfeldj J.M.Evaluation of histone deacetylase inhibitors as therapeutics forneurodegenerative diseases.Methods Mol Biol 793:495-508.[0114]11.Kidd，S.K.和 Schneider，J.S.Protective effects of valproic acid on thenigrostriatal dopamine system in a l~methy1-4-phenyl-1, 2，3，6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson' sdisease.Neuroscience 194:189-194.[0115]12.Koo k，H.，Leporej J.J.，Gitlerj A.D.，Lu, M.M.，Wing-Man Yung, W.，Mackay,J., Zhou, R., Ferrari, V., Gruber, P.和 Epstein，J.A.2003.Cardiac hypertrophy andhistone deacetylase-dependent transcriptional repression mediated by theatypical homeodomain protein Hop.J Clin Invest 112:863-871.[0116]I 3.Kee，H.J.，Sohn，1.S.，Nam，K.1.，Park, J.E.，Qian, Y.R.，Yin, Z.，Ahnj Y.，Jeongj M.H.，Bang, Y.J.，Kimj N 等.，2006.1nhibition of histonedeacetylation blocks cardiac hypertrophy induced by angiotensin II infusion andaortic banding.Circulationl13:51-59.[0117]14.Joanna, F.，van Grunsvenj L.A.，Mathieuj V.，Sarah, S.，Sarah, D.，Karin, V.，Tamara, V.和 Vera，R.2009.Histone deacetylase inhibition and the regulationof cell growth with particular reference to liver pathobiology.J Cell Mol Med13:2990-3005.[0118]15.Mannaertsj 1.，Nuyttenj N.R.，Rogiers，V.，Vanderkerkenj K.，vanGrunsvenj L.A.和 Geerts，A.Chronic administration of valproic acid inhibitsactivation of mouse hepatic stellate cells in vitro and in viv0.Hepatology51:603-614.[0119]16.Hemmatazadj H.，Rodrigues, H.M.，Maurer, B.，Brentanoj F.，Pileckyte，M.，Distlerj J.H.，Gay, R.E.，Michel, B.A.，Gay, S.，Huber, L.C 等.，2009.Histonedeacetylase7, a potential target for the antifibrotic treatment of systemicsclerosis.Arthritis Rheum 60:1519-1529.[0120]17.Noronhaj 1.L，F(xiàn)ujiharaj C.K.和 Zatz，R.2002.The inflammatory componentin progressive renal disease—are interventions possible? Nephrol DialTransplant 17:363-368.[0121]18.Boor，P.，Ostendorf，T.和Floege，J.Renal fibrosis: novel insights intomechanisms and therapeutic targets.Nat Rev Nephrol 6:643-656.[0122]19.Chatziantoniouj C.和 Dussaule，J.C.2005.1nsights into the mechanismsof renal fibrosis:1s it possible to achieve regression? Am J Physiol RenalPhysiol 289:F227_234.[0123]20.Rodriguez-1turbej B.和Garcia Garcia, G.The role of tubulointerstitialinflammation in the progression of chronic renal failure.Nephron Clin Pract116:c81-88.[0124]21.Sutariaj P.M.，Ohebshalomj M.，McCaffrey, T.A.，Vaughan, E.D.，Jr.和Felsenj D.1998.T ransforming growth factor—beta receptor types I and II areexpressed in renal tubules and are increased after chronic unilateral ureteralobstruction.Life Sci 62:1965-1972.[0125]22.Roy-Chaudhuryj P.，Jones, M.C.，MacLeod, A.M.，Haitesj N.E.，Simpson, J.G.和 Power，D.A.1993.An immunohistological study of epidermal growth factorreceptor and neu receptor and neu receptor expression in proliferativeglomerulonephritis.Pathology 25:327-332.[0126]23.0rellana, S.A.，Sweeney, W.E.，Neff, C.D.和 Avner，E.D.1995.Epidermalgrowth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney.Kidney Int 47:490-499.[0127]24.Yingj W.Z.和 Sanders，P.W.2005.Enhanced expression of EGF receptor ina model of salt-sensitive hypertension.Am J Physiol Renal Physiol 289:F314_32L
[0128]25.Stein-Oakleyj A.N.，Maguire, J.A.，Dowling, J.，Perry, G.和 Thomsomj N.M.1997.Altered expression of fibro genic growth factors in IgA nephropathy andfocal and segmental glomerulosclerosis.Kidney Int 51:195-204.[0129]26.Qij W., Chen, X., Poronnikj P.和 Pollock，C.A.2008.Transforming growthfactor-beta/connective tissue growth factor axis in the kidney.1nt J BiochemCell Biol40:9-13.[0130]27.Bonner, J.C.2004.Regulation of PDGF and its receptors in fibroticdiseases.Cytokine Growth Factor Rev 15:255-273.[0131]28.0stendorfj T., Eitnerj F.和 Floege，J.The PDGF family in renalfibrosis.Pediatr Nephrol.[0132]29.Terzij F.，Burtinj M.，Hekmatij M.，F(xiàn)ede rici, P.，G rimber, G.，B riand, P.和 Friedlander，G.2000.Targeted expression of a dominant-negative EGF-R in thekidney reduces tubulo—interstitial lesions after renal injury.J Clin Invest106:225-234.[0133]3 0.Francois, H.，Placier，S.，F(xiàn)lamant，M.，Tharaux，P.L., Chanselj D., Dussaulej J.C.和 Chatziantoniou，C.2004.Prevention of renalvascular and glomer ular fibrosis by epidermal growth factor receptorinhibition.Faseb J 18:926-928.[0134]31.Zhou, Q., Shaw, P.G.和 Davidson，Ν.Ε.2009.1nhibit ion of histonedeacetylase suppresses EGF signaling pathways by destabilizing EGFR mRNA inERnegative human breast cancer cells.Breast Cancer Res Treat 117:443-451.[0135]32.Chouj C.W., Wuj M.S., Huang, W.C.和 Chen，C.C.HDAC inhibition decreasesthe expression of EGFR in colorectal cancer cells.PLoS One 6:el8087.[0136]33.Deribej Y.L.，Wild, P.，Chandrashakerj A.，Curakj J.，Schmidt, M.H.，Kalaidzidis, Y.，Milutinovicj N.，Kratchmarovaj 1.，Buerklej L.，F(xiàn)etchkoj M.J 等.，2009.Regulation of epidermal growth factor receptor trafficking by lysinedeacetylase HDAC6.Sci Signal 2:ra84.[0137]34.Gilbert，R.E.，Huang, Q.，Thai, K.，Advani, S.L.，Lee，K.，Yuen, D.A.，Connelly，K.A.和 Advani，A.Hi stone deacetylase inhibition attenuatesdiabetesassociated kidney growth:potential role for epigenetic modification ofthe epidermal growth factor receptor.Kidney Int 79:1312-1321.[0138]35.Mizunoj S., Matsumotoj K.和 Nakamura，T.2008.HGF as a renotrophic andant1-fibrotic regulator in chronic renal disease.Front Biosci 13:7072-7086.[0139]36.Tan, J.，Cangj S.，Maj Y.，Petrilloj R.L.和 Liu，D.Novel histonedeacetylase inhibitors in clinical trials as ant1-cancer agents.J Hematol0ncol3:5.[0140]37.Prince，H.M.，Bishton，M.J.和 Harrison，S.J.2009.Clinical studies ofhistone deacetylase inhibitors.Clin Cancer Res 15:3958-3969.[0141]38.Pang, M.，Kothapallyj J.，Maoj H.，Tolbert, E.，Ponnusamyj M.，Chin, Y.E.和Zhuangj S.2009.1nhibition of histone deacetylase activity attenuates renalfibroblast activation and interstitial fibrosis in obstructive nephropathy.AmJ Physiol Renal Physiol 297:F996_F1005.
【權(quán)利要求】
1.1型HDAC抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制促纖維化受體的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述促纖維化受體選自下組:Ti3R1、EGFR和PDGFR。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述組合物還抑制Smad-3、STAT3和ERK172途徑的活化；和/或 所述組合物不影響c-Met的表達(dá)或磷酸化。
4.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于抑制腎臟纖維化。
6.1型HDAC抑制劑的用途，其特征在于，用于制備治療或預(yù)防腎臟纖維化的藥物。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑包括MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
8.1型HDAC抑制劑在抑制T β R1、EGFR和TOGFR中的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑還抑制Smad-3、STAT3和erk1/2途徑的活化；和/或 所述I型HDAC抑制劑不影響C-Met的表達(dá)或磷酸化；和/或 所述I型HDAC抑制劑還抑制腎臟纖維化。
10.一種體外非治療性的抑制腎臟細(xì)胞纖維化的方法，其特征在于，包括步驟:在I型HDAC抑制劑存在下，培養(yǎng)腎細(xì)胞，從而抑制腎臟細(xì)胞的纖維化； 較佳地，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學(xué)上可接受的鹽。
【文檔編號】A61K45/00GK103585630SQ201210293429
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月16日
【發(fā)明者】莊守綱 申請人:上海市東方醫(yī)院