專利名稱：三兩銀總生物堿的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三兩銀總生物堿的新用途，具體涉及三兩銀總生物堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑以及在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)又稱老年性癡呆，是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，以隱匿起病，記憶力逐漸減退，認(rèn)知障礙、行為異常和社會(huì)障礙等為主要臨床表現(xiàn)。以細(xì)胞外出現(xiàn)β -淀粉樣肽(β-Amyloid protein, Αβ )聚集形成的老年斑(senile plaque, SP)、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)及神經(jīng)細(xì)胞和突觸數(shù)量減少等為主要病理特征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球老年癡呆患者已超過1700萬，我國有500多萬，占全世界的四分之一，65歲以上老年人癡呆患病率高達(dá)10. 1%，死亡率僅次于心腦血管疾病和癌癥，且發(fā)病率隨年齡的增長而增加。近年來，隨著老齡化人口的不斷增加，對(duì)老年性癡呆的研究也越來越受到更多的關(guān)注。因此，對(duì)AD治療藥物的深入研究具有十分重要的意義并成為國內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)，老年性癡呆的發(fā)生與患者大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)一乙酰膽堿的缺失密切相關(guān)，膽堿酯酶會(huì)催化乙酰膽堿的裂解反應(yīng)，導(dǎo)致乙酰膽堿的缺失，神經(jīng)信號(hào)傳遞失敗，目前對(duì)老年癡呆的藥物治療主要是通過抑制膽堿酯酶來提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿水平。1907年，德國學(xué)者Alois Alzheimer首次報(bào)道AD的臨床表現(xiàn)和病理改變后，經(jīng)過無數(shù)科研人員不斷深入的研究與探索，仍然沒有找到一種發(fā)病機(jī)制可以確切地解釋AD,也沒找到一種特效的藥物對(duì)AD進(jìn)行治療。苗藥三兩銀為黃楊科野扇花屬植物野扇花Sarcococca ruacifolia Stapf.的干燥根或全株，苗藥名bub jid ngongx,又名清香桂、山豆根等，分布于我國西南及廣西、湖南等地，是《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種。主要用于治療胃病、跌打勞傷、頭暈心悸、喉嚨腫痛、涼血化瘀、解毒斂瘡。由于該藥的分布廣，產(chǎn)量較大，因此對(duì)三兩銀中的有效成分進(jìn)行深入的藥理研究具有特別的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了三兩銀總生物堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用；本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是還提供了三兩銀總生物堿在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)三兩銀總生物堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用，其中所述的三兩銀總生物堿是從三兩銀中提取得到的。三兩銀總生物堿在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用，其中所述的三兩銀總生物堿是從三兩銀中提取得到的。所述的二兩銀總生物喊這樣制備取二兩銀，粉碎成粗粉，用70_95%的乙醇回流提取1-3次，每次1-5小時(shí)，合并提取液，濃縮得浸膏，浸膏加蒸餾水溶解后，用氯仿萃取2-6次，氯仿萃取液減壓濃縮得到浸膏，即得。具體地說，所述的三兩銀總生物堿這樣制備取三兩銀，粉碎成粗粉，用95%乙醇回流提取3次，每次3小時(shí)，合并提取液，濃縮得浸膏，浸膏加蒸餾水溶解，用氯仿萃取5次，氯仿萃取液減壓濃縮得到浸膏，即得。三兩銀作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用。三兩銀在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用。一種抗膽堿酯酶藥，所述藥物中包括三兩銀總生物堿或三兩銀。前述的抗膽堿酯酶藥，所述藥物主要由三兩銀總生物堿或三兩銀制備而成。
一種預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物，所述藥物中包括三兩銀總生物堿或三兩銀。前述預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物，所述藥物主要由三兩銀總生物堿或三兩銀制備而成。上述藥物的給藥途徑為口服，皮下、靜脈或肌肉注射。阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)(即老年性癡呆),是一種多發(fā)生在老年，以大腦β樣淀粉變性、神經(jīng)元纏結(jié)為主要病理改變的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病。1907年，德國學(xué)者Alois Alzheimer首次報(bào)道AD的臨床表現(xiàn)和病理改變，其病理學(xué)特征是出現(xiàn)大量的老年斑(SPs)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)，生化上主要表現(xiàn)為膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿(Ach)含量的減少和合成不足。老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其產(chǎn)生原因與膽喊能損傷、β樣淀粉蛋白(Αβ )異常沉積、tau蛋白異常憐酸化、炎癥機(jī)制等因素密切相關(guān)。其中，膽堿能損傷是由于膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦組織中的重要化學(xué)物質(zhì)，患AD時(shí)，基底前腦區(qū)的膽堿能神經(jīng)元減少，導(dǎo)致乙酰膽堿(ACh)合成、儲(chǔ)存和釋放減少，進(jìn)而引起以記憶和識(shí)別功能障礙等一系列臨床表現(xiàn)，還能選擇性地?fù)p壞乙酰膽堿能神經(jīng)，從而影響人的認(rèn)識(shí)學(xué)習(xí)記憶等功能，所以AD的發(fā)生與患者大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)一乙酰膽堿的缺失密切相關(guān)，目前對(duì)老年癡呆的藥物治療主要是通過抑制膽堿酯酶來提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿水平。Αβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)裂解而來，其異常沉積可引起神經(jīng)元凋亡、損傷線粒體功能、誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷、致細(xì)胞內(nèi)毒性作用，是老年癡呆癥的重要病因。AD患者腦內(nèi)標(biāo)志性病理變化之一是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)，NFFs的主要成分是過度磷酸化的Tau蛋白，當(dāng)tau蛋白被過度磷酸化，并在細(xì)胞內(nèi)形成了聚積后，則會(huì)失去其自身的功能，導(dǎo)致微管功能的損害。炎癥機(jī)制在AD的發(fā)病過程中具有一定的作用，其中，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化是炎癥反應(yīng)的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦內(nèi)胞質(zhì)磷脂酶A2(cytosolic phosphor lipase A2, cPLA2)免疫活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞比對(duì)照組明顯增加，其存在區(qū)域與Αβ沉積區(qū)域相一致，提示其腦內(nèi)存在著急性炎癥反應(yīng)，同時(shí)，還證實(shí)cPLA2對(duì)腦內(nèi)炎癥介質(zhì)和第二信使的產(chǎn)生過程起著重要作用。鑒于此，申請(qǐng)人對(duì)三兩銀總生物堿抗膽堿酯酶的活性、干預(yù)A β表達(dá)、降低Tau蛋白過磷酸化、改善局灶性炎癥反應(yīng)等抗AD的作用機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。并通過以下實(shí)施來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例I :對(duì)大鼠血清膽堿酯酶的抑制作用I.材料與方法I. I藥品與試劑
苗藥三兩銀總生物堿(以下簡稱總堿)，來源于貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系；膽堿酯酶測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)20030955) ;二甲基亞砜(DMSO) ;pH7. 4磷酸緩沖液。I. 2 儀器全自動(dòng)生化分析儀(魅力2000)，臺(tái)式離心機(jī)I. 3血清中膽堿酯酶的制備SD大鼠I只，雄性，300g (購于貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK (黔)2002—0001),短頭取血8ml，在常溫下靜置6h以后以3000r/min離心15min，取上清液3ml，用磷酸緩沖液按I:9稀釋備用。I. 4大鼠血清膽堿酯酶活性的測(cè)定

共分為4組，每組10份，分別為對(duì)照組，總堿大、小劑量組，DMSO組。待測(cè)藥品的大、小劑量組按生藥量lg/lml、0. 5g/lml換算用等量DMSO溶解，檢測(cè)操作按試劑盒說明進(jìn)行，以膽堿酯酶活力(U/L)為指標(biāo)評(píng)價(jià)受試藥的抗膽堿酯酶活性。I. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS11. O軟件進(jìn)行分析，以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(;士S)表示，組間差異采用方
差分析，以p〈0. 05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。2.結(jié)果表I對(duì)膽堿酯酶的影響(χ ±s n=10)
組別膽堿酯酶活力(U/L)
對(duì)照組253. 55 ±37. 65總堿大劑量135. 65土2. 04*
總堿小劑量137. 13 土 4. 11*
DMSO221. 32 ±29. 51注與對(duì)照組比較，*P < O. 053.結(jié)論從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，苗藥三兩銀總堿在體外對(duì)大鼠血清膽堿酯酶有明顯的抑制作用，說明其具有抗膽堿酯酶的活性，而溶媒DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯影響。實(shí)驗(yàn)例2中繼續(xù)考察苗藥三兩銀總堿對(duì)腦內(nèi)膽堿酯酶的影響，并針對(duì)藥物對(duì)β淀粉樣蛋白及前體蛋白(APP)的影響，對(duì)tau蛋白變性的影響等方面進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)例2 :三兩銀總生物堿抗AD大鼠作用機(jī)制研究I實(shí)驗(yàn)材料I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重(200±10)g，由中國軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)=SCXK-(軍)2007-004。飼料、墊料均由動(dòng)物中心提供，自由攝食和飲水，自然晝夜節(jié)律光照，室內(nèi)溫度控制在25°C左右，相對(duì)濕度為60-70%。I. 2實(shí)驗(yàn)藥物
三兩銀總生物堿，來源于貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系。鹽酸多奈哌齊片(商品名安理申)5mg/片，衛(wèi)材(北京)藥業(yè)有限公司，批號(hào)091223A。I. 3實(shí)驗(yàn)試劑D-半乳糖(D-gal，批號(hào)100508)，上海博奧森生物科技有限公司；亞硝酸鈉(NaNO2，批號(hào)100901)，西隴化工股份有限公司；苦味酸(批號(hào)20081201 )，臺(tái)山市化工有限公司。I. 4主要儀器普通光學(xué)顯微鏡((CK-2型)，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；攝影顯微鏡((CH型)，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；電子精密天平(Libror AEL-200型)，日本Shimadzu生產(chǎn)；TGL_16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；酶標(biāo)儀(biorad680),美國biorad伯樂生產(chǎn)。2方法與結(jié)果2. I實(shí)驗(yàn)方法2. I. I藥物配制2. I. I. I三兩銀總生物堿的配制將三兩銀生物堿溶入蒸餾水中(加一定量的吐溫-80)，分別配制高、中、低劑量，4°C保存，備用。2. I. 1.2陽性藥物配制取鹽酸多奈哌齊片，放入研缽內(nèi)研成粉末，溶入蒸餾水中，4°C保存，備用。2. I. I. 3 其他藥物取D-gal、NaNO2溶入生理鹽水中，D-gal (D-半乳糖)按85mg · kg—1腹腔注射，NaNO2 (亞硝酸鈉)按45mg · kg—1腹腔注射。2. I. 2動(dòng)物分組、造模及給藥2. I. 2. I 動(dòng)物分組在用木板構(gòu)成的自制曠場(chǎng)分析箱(ImX ImX 40cm,底部劃分為25個(gè)方格20cmX20cm)中，通過觀察每只大鼠在5min內(nèi)跨格次數(shù)、抬爪次數(shù)、排便粒數(shù),篩選出符合條件的大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行排序，然后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(10只)，陽性對(duì)照組(10只)，總堿(高、中、低劑量組，每組10只)。2. I. 2. 2 動(dòng)物造模除正常對(duì)照組給予同計(jì)量生理鹽水腹腔注射外，其余大鼠每日腹腔注射D-gal和NaNO2，持續(xù)60天。2. I. 2. 3給藥方式與劑量按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的方法根據(jù)人臨床用藥劑量換算大鼠的用藥量，換算公式如下每只大鼠的用藥量=(人用劑量X人與鼠的換算系數(shù))/大鼠重量。在具體實(shí)施過程中，實(shí)際體重在標(biāo)準(zhǔn)體重的±20%范圍內(nèi)均采用此方法進(jìn)行給藥。從造模第21天開始，同時(shí)進(jìn)行灌胃給藥干預(yù)。空白組、模型組均以同劑量生理鹽水灌胃，以排除灌胃刺激與損傷的差異性，連續(xù)40天。2. I. 3行為學(xué)檢測(cè)采用Morris水迷宮對(duì)大鼠的定位航行與空間探索學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，并從行為學(xué)方面探討三兩銀總生物堿對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。2. I. 3. I定位航行學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮主要由圓形水池、自動(dòng)攝像及分析系統(tǒng)組成，圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)主要由攝像機(jī)、計(jì)算機(jī)、圖像監(jiān)視器組成，動(dòng)物入水后啟動(dòng)監(jiān)測(cè)裝置，記錄動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡，試驗(yàn)完畢自動(dòng)分析報(bào)告相關(guān)參數(shù)。圓形水池由不銹鋼制成，直徑120cm，高50cm，水池中有一圓形站臺(tái)，直徑10cm，高28cm。沿水迷宮中心原點(diǎn)劃分為四個(gè)象限，將站臺(tái)設(shè)置在第一象限內(nèi)，即目標(biāo)象限，其中站臺(tái)的圓心距池壁20cm，在水池里注入自來水，水溫為23-25°C，水面高出站臺(tái)2cm。水池上空通過一攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)連接，當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間已到或大鼠已爬到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤并記錄大鼠游泳軌跡、時(shí)間等。訓(xùn)練期間環(huán)境保持相對(duì)安靜，把大鼠放入水池后即離開。定位航行學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)從同一池壁入水點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)大鼠面向池壁放入水池，自動(dòng)記錄大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間，作為大鼠逃避潛伏期。大鼠爬上站臺(tái)后，讓大鼠在站臺(tái)上站立IOs ;若大鼠在120s內(nèi)未找到水池中的站臺(tái)或未能爬上站臺(tái)，則將大鼠輕輕拖動(dòng)，引至站臺(tái)上站立10s。將大鼠從站臺(tái)上取下，連續(xù)測(cè)試4d，作為訓(xùn)練大鼠學(xué)習(xí)記憶能 力。第5d記錄大鼠逃避潛伏期，檢測(cè)大鼠定位航行記憶能力。2. I. 3. 2空間探索學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)后，將站臺(tái)移出水池，并按定位航行實(shí)驗(yàn)的方法，計(jì)算機(jī)跟蹤并記錄大鼠120s內(nèi)游泳探索站臺(tái)的軌跡，并記錄大鼠自入水后在120s內(nèi)游過原站臺(tái)所在位置區(qū)域的次數(shù)，作為穿臺(tái)次數(shù)。2. I. 4血清及腦組織的制備行為學(xué)檢測(cè)后，進(jìn)行血清及腦組織的制備，實(shí)驗(yàn)前12h大鼠禁食不禁水。2. I. 4. I 血清制備稱取實(shí)驗(yàn)大鼠體重，用左手固定鼠，盡量捏緊頭部皮膚，使頭固定，并輕輕向下壓迫頸部兩側(cè)，引起頭部靜脈血液回流困難，使眼球充分外突(示眼眶后靜脈叢充血)，右手持彎甜，沿內(nèi)目此眼眶后壁向喉頭方向插入旋轉(zhuǎn)取血，取出的血液2500r · min 1尚心IOmin，取血清，放入_20°C冰箱，備用。2. I. 4. 2腦組織勻漿制備取血后，快速斷頭，打開顱腔，在冰臺(tái)上迅速取出全腦，用冷生理鹽水沖洗血液，濾紙吸干沖洗液后，放入勻漿器中，加入約9倍量濃度為O. 9%的生理鹽水，研磨成腦組織勻漿，2500r · min—1離心IOmin,取上清夜，置EP管中，放入_20°C冰箱，備用。2. I. 4. 3腦組織灌注固定按體重量表抽取等量的3. 5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠解剖臺(tái)上，用剪刀剪開胸腔，并用彎鉗夾住胸腔骨外翻，充分暴露胸腔。把輸液器內(nèi)充滿生理鹽水，并使特異磨鈍的20ml注射器的針頭滴出生理鹽水，用中號(hào)無齒鑷子夾住心臟，使針頭從心尖處迅速穿進(jìn)，并進(jìn)入主動(dòng)脈脈管內(nèi)，用無齒鉗子固定，剪開大鼠的右心耳，快速打開輸液器的閥閘，速度先快后慢，直到紅色的肝臟變成蒼白時(shí)，快速換成4%多聚甲醛溶液灌注。把灌好的大鼠放在斷頭架上立即斷頭，用剪刀剪開頭皮，再用碎骨鉗斷開頭顱骨，暴露腦組織，用小號(hào)的鑷子夾出腦組織，投入4%的多聚甲醛溶液，備用。2. I. 5生化指標(biāo)的檢測(cè) 生化指標(biāo)的檢測(cè)均采用ELISA法對(duì)大鼠腦組織中所選指標(biāo)A β、Tau蛋白、AchE,ChAT、GSK-3i3及血清中iNOS、IL-l的含量進(jìn)行了生化檢測(cè)，用定量的方法得到各生化指標(biāo)的變化，從而為我們提供數(shù)據(jù)支持。2. I. 5. I Αβ !_422. I. 5. I. I 原理采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中大鼠Aβ卜42的水平。向預(yù)先包被了 A β卜42單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入A β卜42，溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗Αβ卜42抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中Αβ卜42的濃度呈正相關(guān)。2. I. 5. I. 2 操作步驟
稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為1200pg · mL-1、600pg · mL \300pg · mL \ 150pg · mL \75pg · mL 1 ;加樣空白孔空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗Αβ 1-42抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑Α&Β和終止液，其余各步操作相同；標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μ L，鏈霉素-HRP50 μ L ；待測(cè)樣品孔加入樣本40μ L，然后各加入抗Αβ 1-42抗體10μ L、鏈酶親和素-HRP50 μ L，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37°C溫育60分鐘；配液將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；顯色每孔先加入顯色劑A50yL，再加入顯色劑B50yL，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色I(xiàn)Omin ；終止每孔加終止液50 μ L，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)；測(cè)定以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度；計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。2.1.5.2Tau 蛋白2. I. 5. 2. I 原理同 2. I. 5. I. I 項(xiàng)。2. I. 5. 2. 2 操作步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為640pg · mL-1、320pg · mL \ 160pg · mL \80pg · mL \40pg · mL、按 2. I. 5. I. 2 項(xiàng)下方法操作即得。2. I. 5. 3AChE2. I. 5. 3. I 原理同 2. I. 5. I. I 項(xiàng)。2. I. 5. 3. 2 操作步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為80U · L'40U · L'20U · L'IOU · L'5U · L'按2. I. 5. I. 2項(xiàng)下方法操作即得。2. I. 5. 4IL-12. I. 5. 4. I 原理:同 2. I. 5. I. I 項(xiàng)。2. 1.5. 4. 2 操作步驟
稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為400ng· L'200ng · L \IOOng · L \50ng · L \25ng · L、按 2. I. 5. I. 2 項(xiàng)下方法操作即得。2. I. 5. 5GSK-3 32. I. 5. 5. I 原理:同 2. I. 5. I. I 項(xiàng)。2. I. 5. 5. 2 操作步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為150pmol ·Ι^，IOOpmol · L I, 50pmol · L \ 25pmol · L \ 12. 5pmol · L、按 2· I. 5· I. 2 項(xiàng)下方法操作即得。2. I. 5. 6iN0S2. I. 5. 6. I 原理:同 2. I. 5. I. I 項(xiàng)。

2. 1.5. 6. 2 操作步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入原倍標(biāo)準(zhǔn)品中倍比稀釋為50nmol25nmol · mL \ 12. 5nmol · mL \6. 25nmol · mL \3. 12nmoI ^mL10 按 2. I. 5. I. 2 項(xiàng)下方法操
作即得。2. I. 5形態(tài)學(xué)測(cè)定形態(tài)學(xué)檢測(cè)采用HE染色、免疫組化染色兩種方法，采用病理圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行采集，分別對(duì)腦組織中Aβ (老年斑)、Tau蛋白(神經(jīng)纖維纏結(jié))進(jìn)行定性分析，并利用病理真彩圖像采集系統(tǒng)對(duì)圖像中Αβ、Tau蛋白表達(dá)平均光密度值進(jìn)行相對(duì)定量分析。2. 1.5. I 標(biāo)本制備取常規(guī)固定左腦組織，酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋，切片，每個(gè)組織連續(xù)切片15張，連續(xù)取6張，進(jìn)行HE染色、免疫組化染色。2.1.5.2ΗΕ 染色選取海馬石蠟切片；二甲苯脫蠟10min，2次；用梯度乙醇溶液脫水100%乙醇2次，每次3min,95%、85%、75%乙醇各I次，每次Imin ;蒸懼水洗Imin ;蘇木精染液6min染細(xì)胞核；蒸餾水洗IOs ;入1%鹽酸乙醇溶液5s，脫去胞質(zhì)的著色；蒸餾水洗IOs ;入氨水溶液5s ;蒸餾水洗IOs ;入伊紅染液30s染細(xì)胞漿；用梯度乙醇溶液依次脫水75%、85%、95%、100%乙醇各一次，每次IOs ;二甲苯透明3min ;吹干切片，用中性樹膠封片。2. I. 5. 3免疫組化染色選取海馬石蠟切片；60°C烤片2h ;脫蠟二甲苯脫蠟15min，三次；水化依次經(jīng)過無水乙醇、95%、90%、80%、70%，各2min，蒸餾水(或自來水)5min ;PBS洗5min，三次；3%雙氧水封閉20min,PBS洗5min,三次；抗原修復(fù)枸櫞酸緩沖液煮沸修復(fù)15min,自然涼至室溫。PBS洗5min，三次；正常山羊血清封閉，37°C，15_20min ;—抗孵育，4°C過夜。復(fù)溫20min，PBS洗5min，三次；二抗孵育，37°C 20min ( 二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG)，PBS洗5min，三次；三抗孵育，37°C 20min (三抗為辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素)，PBS洗5min，三次；DAB顯色，鏡下觀察結(jié)果，適時(shí)終止；蘇木素復(fù)染5min，自來水沖洗片刻，75%的鹽酸酒精溶液分化30s，自來水沖洗5min藍(lán)化；脫水依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、無水乙醇，各2min ;二甲苯15min ;封片中性樹膠封片。2. I. 6. 4圖像處理方法免疫組化染色結(jié)果利用顯微鏡，每組每只大鼠隨機(jī)選取相同部位的6張切片，采用病理圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行采集，并利用病理真彩圖像采集系統(tǒng)對(duì)圖像中蛋白表達(dá)平均光密度值進(jìn)行分析，作為切片的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2. I. 7統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(;土S) +表
示，當(dāng)各樣本不滿足方差分析條件即不滿足正態(tài)性時(shí)采用Friedman秩和檢驗(yàn)，當(dāng)各樣本均服從正態(tài)分布時(shí)則采用One-Way ANOVA (單因素方差分析)檢驗(yàn),并用Dunnett T3分析。2. 2 結(jié)果2.2. I行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果由表2可以看出與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);與模型組比較，總堿三個(gè)組大鼠逃避潛伏期縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05);與陽性組比較，供試藥組大鼠逃避潛伏期均無明顯差異(p>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠穿臺(tái)次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);與模型組比較，總堿低組大鼠穿臺(tái)次數(shù)無明顯差異(p>0.05);其他給藥組與模型組比較穿臺(tái)次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);與陽性組比較，總堿低組大鼠穿臺(tái)次數(shù)較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，其他供試藥組大鼠穿臺(tái)次數(shù)均無明顯差異(p>0.05)。表2各組大鼠逃避潛伏期與穿臺(tái)次數(shù)比較土S，n=6)
權(quán)利要求
1.三兩銀總生物堿作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用，其中所述的三兩銀總生物堿是從三兩銀中提取得到的。
2.三兩銀總生物堿在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用，其中所述的三兩銀總生物堿是從三兩銀中提取得到的。
3.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的三兩銀總生物堿這樣制備取三兩銀，粉碎成粗粉，用70-95%的乙醇回流提取1-3次，每次1-5小時(shí)，合并提取液，濃縮得浸膏，浸膏加蒸餾水溶解后，用氯仿萃取2-6次，萃取液減壓濃縮得到浸膏，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的三兩銀總生物堿這樣制備取三兩銀，粉碎成粗粉，用95%乙醇回流提取3次，每次3小時(shí)，合并提取液，濃縮得浸膏，浸膏加蒸餾水溶解，用氯仿萃取5次，氯仿萃取液減壓濃縮得到浸膏，即得。
5.三兩銀作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的應(yīng)用。
6.三兩銀在制備預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
7.—種抗膽堿酯酶藥，其特征在于所述藥物中包括三兩銀總生物堿或三兩銀。
8.如權(quán)利要求7所述的抗膽堿酯酶藥，其特征在于所述藥物主要由三兩銀總生物堿或三兩銀制備而成。
9.一種預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物，其特征在于所述藥物中包括三兩銀總生物堿或二兩銀。
10.如權(quán)利要求9所述預(yù)防或治療老年性癡呆的藥物，其特征在于所述藥物主要由三兩銀總生物堿或三兩銀制備而成。
全文摘要
本發(fā)明提供了三兩銀總生物堿的新用途，具體地說，三兩銀總生物堿可作為乙酰膽堿酯酶抑制劑，亦可用于預(yù)防或治療老年性癡呆，且效果明顯，具有開發(fā)利用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102805758SQ20121029989
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者杜江, 許建陽, 劉冬, 何康, 鄒順 申請(qǐng)人:貴陽中醫(yī)學(xué)院