專利名稱：一種口蹄疫疫苗新型復(fù)合氫氧化鋁佐劑以及制備疫苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種口蹄疫疫苗新型佐劑的配方以及疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害偶蹄動物的烈性傳染病，尤其對主要畜種豬、牛、羊的危害特別嚴(yán)重，能造成畜種生產(chǎn)力下降和不良的社會影響，社會經(jīng)濟(jì)損失巨大。因該病傳染性極強(qiáng)，世界動物衛(wèi)生組織(FA0/0IE)將其列為頭號必報(bào)烈性傳染病，國際貿(mào)易予以嚴(yán)格限制。我國將該病列為一類動物傳染病之首。在世界上許多國家，尤其是非洲、亞洲和南美洲國家，該病發(fā)生次數(shù)頻繁，流行嚴(yán)重。此外，不時(shí)出現(xiàn)全球的流行性爆發(fā)。
疫苗是預(yù)防和控制口蹄疫采取的重要措施?？谔阋呙庖叱Ｓ靡呙缡怯妥魟缁钜呙?。該苗的生產(chǎn)采用的是病毒接種細(xì)胞、組織培養(yǎng)物，病毒增殖后，收獲培養(yǎng)物，加化學(xué)滅活劑(如二乙烯亞胺，BEI)使病毒失去感染性，與礦物油佐劑混合乳化制成疫苗。天然免疫應(yīng)答不僅是機(jī)體抵抗病毒和其他病原侵染的第一道防線，也是啟動獲得性免疫應(yīng)答的前提。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的在宿主抗病原微生物的免疫應(yīng)答中起重要作用的細(xì)胞表面受體分子(Medzhitov R，Preston-Hurlburt P. Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997 ;388 :394-397)。迄今為止，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)有10 15種TLR及其相應(yīng)的配體或激動劑。TLRs廣泛表達(dá)在各種免疫細(xì)胞，尤其是先天免疫細(xì)胞的表面，如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫。TLRs通過識別病原微生物及其特殊結(jié)構(gòu)(TLRs激動劑一般是這種結(jié)構(gòu)的類似物)，介導(dǎo)宿主相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和天然免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。TLR3識別具有雙鏈RNA的病毒感染，而單鏈RNA病毒在復(fù)制時(shí)能產(chǎn)生雙鏈RNA，也能通過TLRs識別。病毒單鏈RNA的相應(yīng)識別受體是TLR7和TLR8。TLR9是識別帶有CpG DNA病毒的受體。一些TLRs激動劑，聚肌胞(polyl C)是 TLR3 的激動劑(Kumar H, Kawai T, Akira S. Pathogen recognitionin the innate immune response, Biochem J. 2009,420 (I) :1_16)。Resquimod(R-848)是 TLR7 和 TLR8 的激動劑(Gibson SJ, Lindh JM, Riter TR, Gleason RM, Rogers LM,Fuller AE, et al.Plasmacytoid dendritic cells produce cytokines and maturein response to the TLR7agonists, imiquimod and resiquimod. Cell Tmmunol 2002 ；218(1-2) :74-86)。氫氧化鋁免疫佐劑的使用歷史已有80多年，比油類佐劑更具有安全性和低反應(yīng)性，已廣泛應(yīng)用于人獸疫苗，主要是形成抗原儲存和緩釋效應(yīng)，刺激的細(xì)胞免疫較弱(Iyer S, HogenEsch H, Hem SL. Relationship between the degree of antigenadsorption to aluminum hydroxide adjuvant in interstitial fluid and antibodyproduction. Vaccine 2003 ；21 :1219-1223)。歐洲在2005年已經(jīng)批準(zhǔn)氫氧化鋁吸附的LPS的類似物單磷酸酯A(MPL)作為乙肝疫苗的佐劑(Ennio De Gregorio, Elaine Trittoand Rino Rappuoli Alum adjuvanticity Unraveling a century old mystery, Eur.J. Immunol. 2008. 38 :2068-2071)。研究表明，氫氧化鋁與CpG或LPS的聯(lián)合使用免疫效果要優(yōu)于其單獨(dú)使用(Vajdy, M. , Selby, Μ.，Medina-Selby，A. , Coit, D. , Hall, J. , Tandeske,L. , Chien, D. et al. , Hepatitis C virus polyprotein vaccine formulations capableof inducing broad antibody and cellular immune responses. J. Gen. Virol. 2006. 87 2253-2262. Wack, A. , Baudner, B.C. , Hilbert, A. K. , Manini, I. , Nuti, S. , Tavarini,S. , Scheffczik, H. et al. , Combination adjuvants for the induction of potent,long-lasting antibody and T—cell re sponses to influenza vaccine in mice. Vaccine2008. 26 :552-561),這是由于氫氧化鋁引起Th2效應(yīng)，而TLRs引起Thl效應(yīng)(Nemazee,D.，Gavin, A. , Hoebe, K. and Beutler, B. , Immunology Toll-like receptors and antibodyresponses. Nature 2006. 441 E4 ；discussion E4)。由于目前的文獻(xiàn)所用的抗原模型均為乙肝、丙肝等人醫(yī)病毒，用動物病毒做抗原模型少見報(bào)道。并且，氫氧化鋁作為獸用病毒疫苗的佐劑使用較少，這是因?yàn)榈V物油佐劑的效果要好于氫氧化鋁，但是從動物福利以及肉食品質(zhì)量的角度看，礦物油引起的疼痛、副反應(yīng)、注射部位的結(jié)節(jié)等要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于氫氧化鋁。并且，氫氧化鋁佐劑更容易注射。因此，本研究準(zhǔn)備聯(lián)合使用2種不同的TLR激動劑，提高氫氧化鋁的佐劑性，提高其細(xì)胞免疫效果，降低油性佐劑所帶來的不良反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種口蹄疫復(fù)合型氫氧化鋁佐劑的配方及其疫苗制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種口蹄疫疫苗新型復(fù)合氫氧化鋁佐劑，含20mg/ml氫氧化鋁膠體佐劑、200 μ g/ml的免疫增強(qiáng)劑PolyI :C和200 μ g/ml的R848。所述的口蹄疫疫苗的制備方法，包括以下步驟1、常規(guī)方法制備氫氧化鋁膠體佐劑；2、常規(guī)方法制備并滅活口蹄疫抗原；3、在氫氧化鋁膠體佐劑中分別加入過濾滅菌的免疫增強(qiáng)劑PolyI:C和R848，濃度均為200 μ g/ml，制得口蹄疫復(fù)合型氫氧化鋁佐劑，氫氧化鋁膠體佐劑濃度為2011^/1111。4、將口蹄疫復(fù)合型氫氧化鋁佐劑與口蹄疫抗原以體積比I : I混合，置于4°C保存3天 5天，每天上午、下午各振搖2次，每次半小時(shí)。用本發(fā)明方法得到的疫苗免疫小鼠后，可檢測到抗體和細(xì)胞水平類似或者優(yōu)于油佐劑。


圖IPolyI :C和R848作為免疫調(diào)節(jié)劑與氫氧化鋁聯(lián)合免疫小鼠的最佳劑量確定。PolyI = C的注射劑量為O. 2yg 400yg只，R848的注射劑量為O. I μ g 200 μ g只，每個(gè)劑量組有三只小鼠。小鼠在注射免疫增強(qiáng)劑后的24小時(shí)，72小時(shí)，7天，14天進(jìn)行采血檢測細(xì)胞因子Y-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF)的含量。細(xì)胞因子的含量通過商品化ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。所得到的數(shù)據(jù)均為幾何平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。(a)不同時(shí)間、不同劑量的PolyI:C誘導(dǎo)的小鼠外周血中的IL-4的含量；(b)不同時(shí)間、不同劑量的PolyI C誘導(dǎo)的小鼠外周血中的TNF的含量；(c)不同時(shí)間、不同劑量的PolyI :C誘導(dǎo)的小鼠外周血中的IFN-Y的含量；(d)不同時(shí)間、不同劑量的R848誘導(dǎo)的小鼠外周血中的IL-4的含量；(e)不同時(shí)間、不同劑量的R848誘導(dǎo)的小鼠外周血中的TNF的含量；(f)不同時(shí)間、不同劑量的PolyI C誘導(dǎo)的小鼠外周血中的TNF的含量圖2按不同配方免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體效價(jià)在不同時(shí)間的動態(tài)變化。按照3天、7天、14天、21天、28天和35天的時(shí)間共采血6次，ELISA試劑盒檢測口蹄疫抗體效價(jià)。數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。圖3免疫21天后小鼠脾淋巴細(xì)胞中⑶8+T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果；(a)F+206免疫組中的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(10. 7% ) ;(b)F+A免疫組中的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(8.4%) ;(c)F+A+P免疫組中的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(11. 5% ) ;(d)F+A+R免疫組中的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(11. 5% ) ； (e)F+A+P+R免疫組中的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(12. 2% ) 0 圖4免疫21天后小鼠脾淋巴細(xì)胞中⑶4+T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果；(a)F+206免疫組中的⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(21.6% ) ;(b)F+A免疫組中的⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(17.9%) ;(c)F+A+P免疫組中的⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(19.9% ) ;(d)F+A+R免疫組中的⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(19.0% ) ； (e)F+A+P+R免疫組中的⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞的門內(nèi)細(xì)胞百分比(21. 2% )。圖5各免疫組的免疫35天的小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行口蹄疫抗原體外刺激產(chǎn)生的2種細(xì)胞因子(IFNy和IL-4)的含量。脾臟在無菌條件下分離研磨，利用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。然后在25 X 16計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，制成5 X 106/mL濃度的單細(xì)胞懸液。各設(shè)三孔重復(fù)，每孔加入200微升5106細(xì)胞，然后加入100微升口蹄疫抗原(3 μ g/ml)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)取三孔的幾何平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差；(a)體外刺激免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的IFN-Y含量；(b)體外刺激免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的IFN-Y含量。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。一、PolyI = C和R848作為免疫增強(qiáng)劑與氫氧化鋁聯(lián)合免疫小鼠的最佳劑量確定選18-22g的BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物。在BALB/c小鼠(η = 12/組)左后肢肌注 200 μ I Al(OH) 3+PolyI:C (O. 2，2，20，40，200 或 400 μ g)或 200 μ I Al (OH) 3+R848 (O. 1，1，10，20，100或200 μ g)。隨后在注射后的24小時(shí)，72小時(shí)，7天，14天，對試驗(yàn)小鼠進(jìn)行采血，分離血清，用商品化試劑盒檢測IL-4，TNF, INF- Y ,以確定最佳免疫增強(qiáng)劑劑量。為了選擇最佳免疫劑量，我們設(shè)計(jì)了一系列不同濃度的PolyI = C和R848，以確定在小鼠體內(nèi)最佳的注射劑量(圖I)。不同的細(xì)胞因子反應(yīng)不同的免疫反應(yīng)。我們選取了IL-4，TNFJP INF-γ三個(gè)指標(biāo)來衡量其免疫增強(qiáng)劑效應(yīng)。注入小鼠體內(nèi)的免疫增強(qiáng)劑的含量范圍為O. lyg_400yg不等。當(dāng)PolyI :C含量為20 μ g/只時(shí)，IL-4，TNF，INF-Y在不同時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生的含量達(dá)到了最大值。當(dāng)R848為Iyg/只或IOOyg/只時(shí)，TNF和INF-γ的含量相對較高；而當(dāng)R848為20 μ g/只時(shí)，細(xì)胞因子IL-4的含量是最高的，綜合考慮這些數(shù)據(jù)以及成本因素，確定R-848的免疫最佳劑量也是20g/只。二.比較幾種不同配方的免疫效果將BALB/c小鼠隨機(jī)分成六組，每組12只?？谔阋邷缁羁乖瓭舛葹? μ g/ml。每只口蹄疫滅活抗原免疫劑量均為200μ I。按照以下幾組配方在小鼠后肢外側(cè)肌肉進(jìn)行肌肉注射(1)PBS, (2)F+206、(3)F+A、(4)F+A+P、(5)，F(xiàn)+A+R、(6)F+A+P+R(F 代表口蹄疫滅活抗原，A代表強(qiáng)氧化鋁佐劑，206代表ISA206佐劑，P代表PolyIiC, R代表R848)。所有的小鼠在免疫前進(jìn)行采血，然后再進(jìn)行免疫。在免疫后的3、7、14、21、28、35天采血。外周血經(jīng)過4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集血清，并且儲存于_20°C，直到進(jìn)行ELISA檢測相應(yīng)指標(biāo)。I.抗口蹄疫抗體效價(jià)。通過ELISA方法進(jìn)行檢測。從圖3中可以看出，F(xiàn)+A組和F+206組在抗體效價(jià)數(shù)值上差異不大，F(xiàn)+206組的最高抗體效價(jià)是1:128，而F+A+P+R組在第14/21天的時(shí)候產(chǎn)生了 較高的(分別是1:256，1:512)抗體效價(jià)，說明這個(gè)組合相對其他組產(chǎn)生的抗體效價(jià)更高、更早，2種免疫增強(qiáng)劑PolyI :C和R848在促進(jìn)抗體產(chǎn)生中起到了很重要的作用。2.用流式細(xì)胞儀檢測⑶8+T細(xì)胞與⑶4+T淋巴細(xì)胞。脾臟從處死的小鼠體內(nèi)無菌分離后，制成單細(xì)胞懸液(IO6 107/mL)。在2ml離心管中加入100微升淋巴細(xì)胞懸液，加入雙標(biāo)記單克隆抗體⑶3 (ALEXA FLUOR 488) /CD4 (ALEXA FLUOR 647)或 CD3 (ALEXA FLUOR 488) /CD8 (ALEXA FLUOR 647)，室溫避光20分鐘，然后3000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄掉上清。每管加入2ml的PBS緩沖液洗細(xì)胞，3000轉(zhuǎn)/分，離心5min，棄掉上清，重復(fù)兩次。最后每管加入0. 5ml的PBS懸浮細(xì)胞，四小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀分析⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞在脾臟淋巴細(xì)胞中的組成比例結(jié)果(圖3和圖4)顯示，F(xiàn)+A+P+R組中其組成比例最高，達(dá)到12. 2%，礦物油206的⑶3⑶8+T淋巴細(xì)胞的組成比例是10. 7% ；F+A+P和F+A+R的比例分別是11. 5%0而F+A組中，比例最低，只有8. 4%。免疫后21天小鼠脾臟中⑶3⑶4+T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)+206組中⑶4+T淋巴細(xì)胞所占比例最高，達(dá)到21. 6%，而F+A+R+P為21. 2%，二者接近，說明該組合與礦物油佐劑的效果接近，并且較F+A+R組或F+A+P組中比例高。說明PolyI :C和R848聯(lián)合作用在促進(jìn)T細(xì)胞分化中比單獨(dú)作用效果好。3.體外刺激脾淋巴細(xì)胞測細(xì)胞因子產(chǎn)生情況分離所有免疫35天的小鼠脾淋巴細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。脾淋巴細(xì)胞(5X106/ml)在96孔板上培養(yǎng)，每孔0. lmL。然后用滅活的口蹄疫抗原100 μ L刺激免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，然后在37°C、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48h，最后通過離心96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞聚集在孔底部，收集上清液，用ELISA方法檢測細(xì)胞因子(IL-4、IFN- Y )產(chǎn)生情況。免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，針對特異性抗原分泌的IFN- Y，F(xiàn)+206組的數(shù)值最高，為489. 16，F(xiàn)+A+R+P組的數(shù)值是462. 62，二者數(shù)值接近。而F+A組的數(shù)值為98. 67，F(xiàn)+A+P的數(shù)值為144. 15，F(xiàn)+A+R的數(shù)值是232. 5。說明復(fù)合型氫氧化鋁佐劑比單純使用某一種免疫增強(qiáng)劑的效果要好。IL-4產(chǎn)生量各組差異不明顯(P > 0. 05)。其中F+206組的數(shù)值最高，為75. 61，F(xiàn)+A+R+P組的數(shù)值是65. 83，F(xiàn)+A組的數(shù)值為65. 02，F(xiàn)+A+P的數(shù)值為60. 95，F(xiàn)+A+R的數(shù)值是63. 93。綜合上述數(shù)據(jù)，說明使用新型氫氧化鋁組合佐劑(A+R+P)與礦物油206佐劑的效果接近。
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫疫苗新型復(fù)合氫氧化鋁佐劑，其特征在于，含20mg/ml氫氧化鋁膠體佐劑、200yg/ml 的免疫增強(qiáng)劑 PolyI :C 和 200 μ g/ml 的 R848。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述口蹄疫疫苗新型復(fù)合氫氧化鋁佐劑制備口蹄疫疫苗的方法，包括以下步驟在氫氧化鋁膠體佐劑中分別加入過濾滅菌的免疫增強(qiáng)劑PolyI:C和R848，濃度均為200 μ g/ml，制得口蹄疫復(fù)合型氫氧化鋁佐劑，氫氧化鋁膠體佐劑濃度為20mg/ml。將口蹄疫復(fù)合型氫氧化鋁佐劑與口蹄疫抗原以體積比I : I混合，置于4°C保存3天 5天，每天上午、下午各振搖2次，每次半小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口蹄疫疫苗新型佐劑的配方以及用該佐劑的口蹄疫疫苗制備方法。用氫氧化鋁佐劑加上2種免疫增強(qiáng)劑PolyI:C和R848，再和口蹄疫抗原混合后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)該疫苗的效力類似甚至優(yōu)于現(xiàn)行的礦物油進(jìn)口佐劑ISA206。
文檔編號A61K39/39GK102813921SQ20121030287
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者李冬, 劉在新, 周春雪, 盧曾軍, 陳應(yīng)理, 孫普, 謝寶霞, 曹軼梅, 付元芳, 包慧芳, 李平花, 白興文 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所