專利名稱：一種人巨細胞病毒免疫原融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種人巨細胞病毒免疫原融合蛋白及其制備方法。
背景技術：
人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)屬于β -皰疫病毒亞科雙鏈DNA病毒，是最常見的機會性感染病毒，其感染具有種屬特異性。HCMV感染率因地方不同、年齡不同表現(xiàn)出明顯差別。發(fā)達國家HCMV抗體陽性率在50 % 80 %;而發(fā)展中國家，80 %的小兒在3歲前感染HCMV，至成人期，HCMV感染率甚至可達100 %。我國人群感染率高達86%_96%。健康人多呈亞臨床型感染或者潛伏感染，無明顯臨床癥狀，部分患者可有與傳染性單核細胞增多癥相似的表現(xiàn)。但是HCMV感染確是引起器官移植受者術后并發(fā)癥、HIV感染者死亡以及新生兒先天缺陷的重要病因。 目前對HCMV感染和HCMV相關疾病的預防和治療方法是使用抗病毒藥物(如更昔洛韋(ganciclovir),纟顏更昔洛韋(Valganciclovir),膦甲酸(Foscarnet)等)以及人巨細胞病毒特異性免疫球蛋白(HCMV-IVIG)。長時間的藥物治療會對患者產生藥物毒性和以及造成病毒產生耐藥性，HCMV-IVIG盡管有一定效果，但是治療費用相對昂貴，接種疫苗是一種比較好的的預防/治療方式?，F(xiàn)有的人巨細胞病毒疫苗有減毒活疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗、基因工程亞單位疫苗和合成肽疫苗等種類。減毒活疫苗因存在回復突變的可能性以及潛在的致癌性，且保護效力也不強；病毒載體疫苗和DNA疫苗也存在安全性和保護力相對較弱的問題；現(xiàn)有報道的基因工程亞單位疫苗和合成肽疫苗的有效性較差，如，Pass，R.F.et al. “A subunitcytomegalovirus vaccine based on recombinant envelope glycoprotein B and a newadjuvant.，，，J. Infect. Dis. 1999，180，970975 報道了一種添加佐劑 MF59 (一種角鯊烯類乳劑)的重組包膜蛋白B亞單位疫苗，其I期臨床研究顯示，新佐劑MF59與30 μ g重組gB配伍免疫效果和安全性均優(yōu)于傳統(tǒng)鋁佐劑與10(^8重組88。三次免疫后，受試者體內的gB抗體和中和抗體水平高于血清陽性對照,但免疫后體內產生的抗體水平明顯下降,盡管第四次免疫可以加強機體應答并產生高水平抗體，但是12個月后抗體中水平又下降到基線水平。并且，文中作者明確闡明“該疫苗有可能降低CMV的胎兒感染率，但不能防止育齡婦女感染”。基于MF59的作用以及Pass的分析，MF59/gB隨后進行了 II期臨床試驗。如“Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection”，N Engl J Med. 2009,360:1191-1199報道，II期臨床試驗以檢測到CMV感染為主要判定終點，三次接種后，其預防CMV感染效果僅為50%，這一結果進一步說明該疫苗的局限性。為了滿足更廣泛的臨床需求，需要開發(fā)新的免疫原或者疫苗。鞭毛是沙門菌運動性的基礎結構，鞭毛蛋白是鞭毛絲狀部組成元件。研究發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白作為天然免疫應答的誘導劑，誘導產生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。

發(fā)明內容
為了解決現(xiàn)有人巨細胞病毒疫苗有效性差的問題，本發(fā)明提供了一種人巨細胞病毒免疫原融合蛋白。本發(fā)明人巨細胞病毒免疫原融合蛋白包括鞭毛蛋白，以及人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段。所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段代替鞭毛蛋白的高變區(qū)。所述鞭毛蛋白為腸炎沙門菌亞屬(Salmonella enterica)鞭毛蛋白2型。所述鞭毛蛋白的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO: I所示。所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白為包膜糖蛋白B或者包膜糖蛋白H。所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白多肽片段的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或者 SEQ ID NO 10 所示。優(yōu)選地，人巨細胞病毒免疫原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 12, SEQ IDNO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 20 所示。其核苷酸編碼序列如 SEQID NO 1USEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:17 或者 SEQ ID N0:19 所示。本發(fā)明還提供了SEQ ID NO 1USEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:17 或者SEQ ID NO 19所示核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種重組質粒，其包括SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13,SEQ ID NO:15、SEQ ID N0:17或者SEQ ID NO :19所示核苷酸序列，如，重組pET42b質粒。本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，其包括前述重組質粒，如，重組大腸桿菌Rossetta0本發(fā)明還提供了前述融合蛋白的制備方法，它包括如下步驟(I)取前述的重組表達載體，用IPTG誘導表達；(2)離心，得沉淀，分離純化，即得融合蛋白。本發(fā)明還提供了前述融合蛋白在制備人巨細胞病毒疫苗中的用途。本發(fā)明最后提供了一種人巨細胞病毒疫苗，它包含前述任意一項融合蛋白。本發(fā)明制備得到了鞭毛蛋白與人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段的融合蛋白，該融合蛋白的免疫原性強，用于制備疫苗的免疫效果好，臨床應用前景良好。人巨細胞病毒由內向外分為衣殼、被膜和包膜三個主要結構，含有的抗原眾多，如，即刻早期蛋白 I (immidiate early proteinl, IE1)、憐蛋白 65 (phosphoprotein65,pp65)憐蛋白 150 (phosphoproteinl50,ppl50)、憐蛋白 28 (phosphoprotein28,pp28)、包膜蛋白PUL128、包膜蛋白pUL130、包膜蛋白pUL131A、包膜糖蛋白B、(glycoprotein B,gB)、包膜糖蛋白H (glycoprotein H,gH)、包膜糖蛋白M (glycoprotein M，gM)等。研究發(fā)現(xiàn)，不是所有人巨細胞病毒抗原與鞭毛蛋白形成的融合蛋白均可得到免疫原性較強的免疫原，本發(fā)明在大量抗原中選擇人巨細胞包膜糖蛋白與鞭毛蛋白結合，制備得到了免疫原性較強的免疫原。顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I pET42b/FljB酶切鑒定結果，泳道I為pET42b/FljB NdeI/BamHI酶切產物，泳道2為IOObp DNA ladder ;箭頭所指FljB片段圖2 pET42b/FljB-ADl酶切鑒定結果圖，泳道I為IOObp DNA ladder ;泳道2為pET42b/FljB-ADlNdeI/BamHI 酶切產物；箭頭所指 Fl jB_ADl 片段圖3 FljB-ADl表達鑒定，泳道I為重組菌株誘導前菌體裂解液，泳道2為蛋白分子量標準，泳道3為重組菌株誘導后菌體裂解液圖4 FljB-ADl表達鑒定，泳道I為蛋白分子量標準，泳道2為誘導后菌體裂解液 沉淀，泳道3為誘導后菌體裂解液上清，箭頭所指處為FljB-ADl蛋白圖5 FljB-ADl純化產物鑒定，泳道I為Superdex-200凝膠過濾層析洗脫物，泳道2為蛋白分子量標準，箭頭所指FljB-ADl蛋白圖6 pET42b/FljB-AD2 酶切鑒定，泳道 I 為 pET42b/Fl jB_AD2NdeI/BamHI 酶切產物，泳道2為Ikb DNA ladder,箭頭所指F1JB-AD2片段圖7 F1JB-AD2表達鑒定，泳道I為重組菌株誘導前菌體裂解液，泳道2為蛋白分子量標準，泳道3為重組菌株誘導表達后菌體裂解液圖8 F1JB-AD2純化產物鑒定，泳道I為10倍稀釋8M尿素溶解Fl jB_AD2，泳道2為蛋白分子量標準，箭頭所指Fl jB-AD2圖 9 pET42b/FljB-4XAD2 酶切圖譜，泳道 I 為 pET42b/Fl jB_4XAD2NdeI/BamHI酶切產物，泳道2為IKb DNA ladder，箭頭所指FljB-4XAD2片段圖10 F1JB-4XAD2表達產物鑒定，泳道I為重組菌株誘導前菌體裂解液，泳道2為重組菌株誘導表達后菌體裂解液，泳道3為蛋白分子量標準圖11 F1JB-4XAD2表達產物鑒定，泳道I蛋白分子量標準，泳道2為誘導后菌體裂解液上清，泳道3為誘導后菌體裂解液沉淀，箭頭所指Fl jB-4XAD2蛋白圖12 FljB_4XAD2純化產物鑒定，泳道I、蛋白分子量標準，泳道2、Superdex_200凝膠過濾層析洗脫物，箭頭所指FljB-4XAD2蛋白圖13 pET42b/FljB-AD2-4XgH 酶切鑒定結果，泳道 I 為 pET42b/Fl jB_AD2_4X gHSpel/Kpnl酶切產物，泳道2為IOObp DNA ladder，箭頭所指AD2-4X gH片段圖14 Fl jB-AD2_4X gH表達產物鑒定，泳道I為重組菌株誘導前菌體裂解液，泳道2為蛋白分子量標準，泳道3為重組菌株誘導后前菌體裂解液，箭頭所指Fl jB-AD2-4X gH蛋白圖15 FljB-AD2_4XgH純化產物鑒定，泳道I為蛋白分子量標準，泳道2為QSepharose層析洗脫物,箭頭所指Fl jB_AD2_4X gH蛋白圖 16 pET42b/Fl jB-4X gH-4XAD2PCR 鑒定，泳道 l、pET42b/FljB-4XgH-4XAD2PCR 鑒定，泳道 2 為 IOObp DNA ladder;箭頭所指 4XgH_4XAD2PCR 片段圖17 pET42b/FljB-4XgH-4XAD2-DII 酶切鑒定，泳道 I 為 pET42b/FljB-4XgH-4XAD2-DIISpeI/KpnI 酶切產物，泳道 2 為 IOObp DNA ladder;箭頭所指從上到下依次為DII片段、4XAD2片段和4XgH片段圖18 FljB-4gH-4AD2_DII誘導表達鑒定，泳道1、2為重組菌株誘導前菌體裂解液，泳道3為蛋白分子量標準，泳道4、5為重組菌株誘導后前菌體裂解液圖19 FljB-4gH-4AD2-DII 純化產物鑒定，泳道 I 為 Fl jB-4gH-4AD2_DII 經 QSepharose層析洗脫物；泳道2為蛋白分子量標準圖20 FljB-ADl免疫血清抗體檢測結果圖21 F1JB-AD2免疫血清抗體檢測結果圖22 F1JB-4XAD2免疫血清抗體檢測結果圖23 FljB-AD2_4gH免疫血清抗體檢測結果 圖24 FljB-4gH-4AD2-DII免疫血清抗體檢測結果圖25 pET42b/FljB 載體圖26 gB/ADl (也稱為ADI) (SEQ ID N0:4)取代鞭毛蛋白高變區(qū)的融合蛋白表達載體圖27 gB/AD2 (也稱為AD2) (SEQ ID NO:3)取代鞭毛蛋白高變區(qū)的融合蛋白表達載體圖28 gB/4XAD2 (也稱為4XAD2) (SEQ ID N0:6)取代鞭毛蛋白高變區(qū)的融合蛋白表達載體圖29 4XgH-gB/4XAD2 (也稱為 4XgH_4XAD2) (SEQ ID NO:9)代鞭毛蛋白高變區(qū)的融合蛋白表達載體圖30 4XgH-gB/4XAD2-DII (也稱為 4XgH-4XAD2_DII) (SEQ ID NO: 10)代鞭
毛蛋白高變區(qū)的融合蛋白表達載體。
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。實驗材料pET42b購自Novagen(圣地亞哥，加州，美國)；鞭毛蛋白FljB，編碼FljB的核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示，合成；gB，巨細胞病毒包膜糖蛋白B，其第121氨基酸-第619氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；ADl是gB中能夠與中和抗體結合的保守性抗原表位之一，編碼ADl的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，合成；AD2是gB中能夠與中和抗體結合的保守性抗原表位之一，編碼AD2的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，合成；4XAD2，取上述AD2部分核苷酸序列，重復4段，核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示；gH是糖蛋白H中的線性中和表位之一，編碼4XgH的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，合成；
DII是gB中的一個構象表位之一，編碼DII的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，合成；TP600 熱循環(huán)器(TaKaRA，日本)；用Qiagen凝膠回收試劑盒(德國，貨號28606)；大腸桿菌Rosetta 2 (DE3) (Novagen,圣地亞哥，加州，目錄編號69053)；Q Sepharose(GE)。實施例lpET42b/FljB表達載體的構建取pET42b質粒和編碼鞭毛蛋白FljB的核苷酸，通過NdeI和BamHI內切酶，將編碼鞭毛蛋白FljB的核苷酸酶切克隆至pET42b質粒上，即得pET42b/Fl jB載體。
連接轉化取回收目的片段與pMD19-T simple載體以3:1摩爾比16°C連接I小時，轉化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞(CaCl2法制備)。連接物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的具體方法將T0P10感受態(tài)細胞在冰上解凍；加入連接反應物(4 μ I)，溫和地旋轉，然后在冰上孵育5分鐘；將試管在水浴中，以42°C熱激30秒；將試管在冰上冷卻至少2分鐘；將SOC培養(yǎng)液(400 μ I)加到細胞中，并且在37°C震蕩I小。篩選使用兩個LB瓊脂卡那霉素(50 μ g/ml)培養(yǎng)皿，以涂布100 μ I及10 μ I的轉化細胞，并使其生長過夜；氨芐霉素抗性克隆株的篩選提取單菌落在含有卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中小量培養(yǎng)；使用QIApr印微量制備質粒試劑盒提取質粒。構建載體用限制酶酶切鑒定，結果見圖1，說明成功構建得到PET42b/FljB載體，其結構如圖25所示。實施例2FljB_ADl融合蛋白表達載體構建及其表達和純化—、融合蛋白表達載體構建取實施例I制備得到的pET42b/FljB及合成的ADl核苷酸序列分別進行SpeI/KpnI雙酶切。酶切產物進行瓊脂糖電泳，切取260bp ADl以及7. 2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化,與pMD19-T simple載體以3:1摩爾比16°C連接I小時。連接產物經轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同實施例1)，通過質粒提取，酶切質粒鑒定得到pET42b/FljB-ADl，結果如圖2，說明成功構建得到pET426b/FljB-ADl載體，其結構如圖26所示，F(xiàn)ljB-ADl核苷酸序列如SEQ IDNO 13o二、融合蛋白制備及純化pET42b/FljB_ADl 轉化大腸桿菌 Rossetta 2 (DE3)得到表達 Fl jB_ADl 陽性轉化
子，并用甘油保存。將表達FljB-ADl陽性轉化子在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4，在37°C以ImM IPTG誘導3小時，將轉化子誘導前后菌體裂解液進行SDS-PAGE，如圖3所示，比較誘導前后的電泳圖譜，區(qū)別在于誘導后裂解液在52kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，結合計算的Fl jB-ADl的分子量大小，可以得知該52KDa大小的蛋白即為FljB-ADl。放大至I升的規(guī)模；使細胞生長于含有50μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液至OD6qq=O. 4，并且在37t^lmM IPTG誘導3小時；將細胞通過離心而回收(7000轉/分鐘X7分鐘，于TOMY高速離心機)，并且再懸浮于2XPBS l%TritonX-100U毫克/毫升的溶菌酶；利用細胞超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解產物離心(20，OOOg離心I小時，Beckman冷凍高速離心機)，以將可溶性部分從包涵體中分開；可溶性部分和不可溶性部分均通過SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖4，可知絕大部分目的蛋白分布于沉淀。將不可溶性部分用8M尿素pH8. O溶解，IOOOOXg離心15min，取上清，再用緩沖液20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, ρΗ8· O 以 10 倍稀釋。最后利用 Superdex-200 凝膠過濾層析，柱子用50mM TrisU50mM NaCI及1%甘油加上1%脫氧膽酸鈉沖洗；緩沖液交換是用含有50mM Tris. IOOmM NaCl及1%甘油的緩沖液過夜透析而進行。蛋白質濃度是通過MicroBCA蛋白質分析試劑盒(Pierce Biotechnology)而測定；純化的FljB-AD I制備物在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠鑒定，如圖5所示，有約52kDa的明顯條帶，經考馬斯亮藍(C00_aSSieBlue)染色觀察到的較單一條帶且與小量誘導目的蛋白大小一致。實施例3 Fl jB_AD2融合蛋白表達載體構建及其表達和純化一、融合蛋白表達載體構建 將實施例I構建好的pET42b/Fl jB及pUC57 (含有合成的AD2序列SEQ ID NO: 3)分別進行Spel/Kpnl雙酶切。酶切產物進行瓊脂糖電泳，切取318bp AD2以及7. 2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化，連接反應同實施例I。連接產物經轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同實施例1)，通過質粒提取，酶切質粒鑒定得到pET42b/FljB-AD2，結果如圖6，說明成功構建得到pET42b/FljB-AD2載體，其結構如圖27所示，F(xiàn)ljB-AD2融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。二、融合蛋白制備及純化pET42b/FljB-AD2 轉化大腸桿菌 Rossetta 2 (DE3)得到表達 Fl jB_AD2 陽性轉化
子，并用甘油保存。將表達Fl jB-AD2陽性轉化子在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4，在37°C以ImM IPTG誘導3小時，轉化子誘導前后菌體裂解液進行SDS-PAGE，如圖7所示，比較誘導前后的電泳圖譜，區(qū)別在于誘導后裂解液在54kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，結合計算的Fl jB-AD2的分子量大小，可以得知該54KDa大小的蛋白即為FljB-AD2。隨后放大至I升的規(guī)模；使細胞生長于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液至0D. 600=0. 4，并且在37°C以ImM IPTG誘導3小時；將細胞通過離心而回收(7000轉/分鐘X7分鐘，于TOMY高速離心機)，并且再懸浮于2XPBSl%TritonX-100、l毫克/毫升的溶菌酶；利用細胞超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解產物離心(20，OOOg離心I小時，Beckman冷凍高速離心機)，以將可溶性部分從包涵體中分開；棄去上清。將沉淀部分用8M尿素pH8. O溶解，IOOOOXg離心15min，取上清，再用緩沖液20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, ρΗ8. O 以 10 倍稀釋。蛋白質濃度是通過MicroBCA蛋白質分析試劑試劑盒(Pierce Biotechnology)而測定；純化的Fl jB-AD2制備物用在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠鑒定，如圖8所示，有約54kDa的明顯條帶，經考馬斯亮藍(C00_aSSie Blue)染色觀察到的較單一條帶且與小量誘導目的蛋白大小一致。實施例4 FljB_4AD2融合蛋白表達載體構建及其表達和純化一、融合蛋白表達載體構建將構建好的pET42b/FljB及pUC57 (含有合成的4XAD2核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示)分別進行Spel/Kpnl雙酶切。酶切產物進行瓊脂糖電泳，切取180bp4XAD2以及7. 2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化，連接反應如前述。連接產物經轉化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同步驟(一))，通過質粒提取，酶切質粒鑒定得到pET42b/FljB-4XAD2，結果如圖9所示，說明成功構建得到pET42b/FljB-4XAD2載體，其結構如圖28所示，F(xiàn)ljB_4XAD2融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。2、融合蛋白表達及純化pET42b/FljB-4XAD2 轉 化大腸桿菌 Rosetta 2 (DE3)得到表達 Fl jB_4XAD2 陽性
轉化子，并用甘油保存。將表達FljB_4XAD2陽性轉化子在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4，在37 °C以ImM IPTG誘導3小時，，轉化子誘導前后菌體裂解液進行SDS-PAGE，如圖10所示，比較誘導前后的電泳圖譜，區(qū)別在于誘導后裂解液在50kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，結合計算的F1JB-4XAD2的分子量大小，可以得知該50KDa大小的蛋白即為FljB_4XAD2。放大至I升的規(guī)模；使細胞生長于含有50μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液至0D. 600=0 . 4，并且在37°C以ImM IPTG誘導3小時；將細胞通過離心而回收(7000轉/分鐘X 7分鐘，于TOMY高速離心機)，并且再懸浮于2XPBS l%TritonX-100U毫克/毫升的溶菌酶；利用細胞超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解產物離心(20，OOOg離心I小時，Beckman冷凍高速離心機)，以將可溶性部分從包涵體中分開；將可溶性部分和不可溶性部分均通過SDS-PAGE檢測(見圖11)?？扇苡诓豢扇懿糠侄加心康牡鞍?。將可溶性部分分批加到含有高鹽的S^harose Q樹脂中，以減少DNA、內毒素及其它污染物；將含有目的蛋白的流穿液裝載到10毫升的Q Sepharose ;將結合的蛋白質利用從緩沖液A至IJ B的線性梯度洗脫(緩沖液A :100mM Tris-Cl, ρΗ8· O。緩沖液B :100mMTris-Cl,IM NaCI, ρΗ8. O)。將不可溶性部分用8Μ尿素ρΗ8. O溶解，IOOOOXg離心15min，取上清，再用緩沖液20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, ρΗ8· O 以 10 倍稀釋。最后利用 Superdex-200 凝膠過濾層析，柱子用50mM TrisU50mM NaCI及1%甘油加上1%脫氧膽酸鈉沖洗；緩沖液交換是用含有50mM Tris. IOOmM NaCl及1%甘油的緩沖液過夜透析而進行。蛋白質濃度是通過MicroBCA蛋白質分析試劑試劑盒(Pierce Biotechnology)而測定；純化的FljB-4XAD2制備物在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，如圖12所示，有約50kDa的明顯條帶，經考馬斯亮藍(C00_aSSie Blue)染色觀察到的較單一條帶且與小量誘導目的蛋白大小一致。實施例5 FljB-AD2-4XgH融合蛋白表達載體構建及其表達和純化一、融合蛋白FljB-AD2_4XgH表達載體是以下述方式構建將實施例I構建好的pET42b/FljB及pUC57(含有合成的AD2-4X gH序列，SEQ IDN0:8)分別進行Spel/Kpnl雙酶切。酶切產物進行瓊脂糖電泳，切取270bpAD2_4XgH以及7. 2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化，連接反應同實施例I。連接產物經轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同實施例1)，通過提取質粒pET42b/FljB-AD2-4XgH，再在經過酶切進行鑒定，結果如圖13所示，說明成功構建得到pET42b/Fl jB 載體，其結構如圖29所示，F(xiàn)lJB-AD2-4XgH融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
二、融合蛋白FljB-AD2_4XgH的制備及純化pET42b/FljB-AD2_4XgH 轉化大腸桿菌 Rossetta 2 (DE3)得到表達F1JB-AD2-4 X gH陽性轉化子，并用甘油保存。將表達Fl jB-AD2-4 X gH陽性轉化子在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4，在37 °C以ImM IPTG誘導3小時，，轉化子誘導前后菌體裂解液進行SDS-PAGE，如圖14所示，比較誘導前后的電泳圖譜，區(qū)別在于誘導后裂解液在50kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，結合計算的FljB-AD2-4XgH的分子量大小，可以得知該50KDa大小的蛋白即為Fl jB_AD2_4XgH。隨后放大至I升的規(guī)模；使細胞生長于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液至0D. 600=0 . 4，并且在37°C以ImM IPTG誘導3小時；將細胞通過離心而回收(7000轉/分鐘X 7分鐘，于TOMY高速離心機)，并且再懸浮于2XPBSl%TritonX-100、l毫克/毫升的溶菌酶；利用細胞超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解產物離心(20，OOOg離心I小時，Beckman冷凍高速離心機)，以將可溶性部分從包涵體中分開；棄去可溶部分。
將不可溶性部分用8M尿素pH8. O溶解，IOOOOXg離心15min，取上清，再用緩沖液20mM Tris-Cl, 150mM NaCl，pH 8. 0以10倍稀釋。將含有目的蛋白的稀釋液裝載到10毫升的Q Sepharose (GE);將結合的蛋白質利用從緩沖液A到B的線性梯度洗脫(緩沖液A 100mM Tris-Cl, pH8. O。緩沖液 B: IOOmM Tris-Cl, IM NaCI, pH8. O)。蛋白質濃度是通過MicroBCA蛋白質分析試劑試劑盒(Pierce Biotechnology)而測定；純化的FljB-AD2-4XgH制備物在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上鑒定，如圖15所示。實施例6 FljB-4XgH-4XAD2-DII融合蛋白表達載體構建及其表達和純化—、融合蛋白表達載體構建將實施例I構建好的pET42b/FljB_4XAD2經SpeI酶切，4XgH基因經反應(弓丨物 5 ACTAGTAGCGAGGCATTAGACCC ;引物 6 ACTAGTCAGTAACAGGTGAAAGGC, DNA 模板合成的AD2-4XgH序列。反應體系同實施例1，延伸時間15s)克隆到T載體中，測序正確的質粒經SpeI酶切，酶切產物進行瓊脂糖電泳，切取150bp4XgH以及7. 5kb左右pET42b/FljB-4XAD2片段，用Qiagen凝膠回收試劑盒純化，連接反應同實施例1，連接產物經轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同前述)，通過質粒提取，PCR鑒定得到的pET42b/FljB-4XgH-4XAD2(圖16)，其結構如圖30所示，F(xiàn)ljB-4XgH-4XAD2 核苷酸序列如 SEQ ID NO. 21 所示。再以合成的DII序列為模板，以引物7 :GGTACCactagtaccagcatgaagcc ;引物8 GGTACCgctcttctgcttgatgcc進行DII擴增，克隆轉化方法如前述。最后將pET42b/FljB-4XgH-4XAD2以及含有正確DII序列的T載體分別進行KpnI酶切電泳并分別回收7. 7kb左右pET42b/FljB-4Xgh-4XAD2片段和約410bp的DII片段。連接反應同實施例I連接產物經轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆(同前述)，通過質粒提取，酶切質粒鑒定得到pET42b/FljB-4XgH-4XAD2-DII (圖17)，F(xiàn)ljB-4XgH-4XAD2-DII 核苷酸序列如 SEQ ID NO. 19 所示。二、融合蛋白制備及純化pET42b/FljB-4XgH-4XAD2_DII 轉化大腸桿菌 Rossetta 2 (DE3)得到表達FljB-4 X gh-4 X AD2-DII的陽性轉化子，并用甘油保存。將表達Fl jB-4 X gH-4 X AD2-DII陽性轉化子在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 4，在37°C以ImM IPTG誘導3小時，，轉化子誘導前后菌體裂解液進行SDS-PAGE，如圖18所示，比較誘導前后的電泳圖譜，區(qū)別在于誘導后裂解液在72kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，結合計算的Fl jB-4 X gH-4 X AD2-DII的分子量大小，可以得知該72KDa大小的蛋白即為FljB-4XgH-4XAD2-DII。放大至I升的規(guī)模；使細胞生長于含有50μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液至0D. 600=0 . 4，并且在37°C以ImM IPTG誘導3小時；將細胞通過離心而回收(7000轉/分鐘X 7分鐘，于TOMY高速離心機)，并且再懸浮于2 XPBS l%TritonX-100、l毫克/毫升的溶菌酶；利用細胞超聲破碎儀破碎細胞；將細胞裂解產物離心(20，OOOg離心I小時，Beckman冷凍高速離心機)，以將可溶性部分從包涵體中分開；棄去可溶部分。將不可溶性部分用8M尿素pH8. O溶解，IOOOOXg離心15min，取上清，再用緩沖液20mM Tris-Cl, 150mM NaCl，pH 8. 0以10倍稀釋。將含有目的蛋白的稀釋液裝載到10毫升的Q Sepharose (GE);將結合的蛋白質利用從緩沖液A到B的線性梯度洗脫(緩沖液A 100mM Tris-Cl, pH8. O。緩沖液 B : IOOmMTris-Cl，IM NaCI, pH8. O)。
蛋白質濃度是通過MicroBCA蛋白質分析試劑試劑盒(Pierce Biotechnology)而測定；純化的FljB-4XgH-4XAD2-DII制備物在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠上鑒定，條帶位置與小量培養(yǎng)物誘導產生蛋白位置一致(見圖19)。實驗例I小鼠免疫原性I、實驗方法使用大約18_22g的雌性BALB/c小鼠。將小鼠分成3到5只小鼠的組，并于O天與21天，于頸部皮下分別使用指示濃度(抗原50 μ g/只，Al (OH)3IOOyg/只，佐劑Abisco25y I/只)的Fl jB-ADl，F(xiàn)1JB-AD2以及FljB_4XAD2融合蛋白致免疫。于第28天時，以眼窩后穿刺對個體進行采血。通過凝血并離心以不含肝素的樣本而收集血清。FljB-AD2-4gH 和 Fl jB_4X gH-4XAD2_DII 融合蛋白免疫試驗使用 18_22g 的雌性BALB/c小鼠，免疫小鼠分組為2-4只，于頸部皮下分別使用指示濃度(抗原I μ g/只，佐劑Abisco (也可拼寫為Iscom)25 μ I/只)，其中FljB_AD2_4gH進行2次免疫和3次免疫效果比較。2、小鼠血清抗體測定HCMV特異性的IgG是通過ELISA而測定。將96孔的酶連接免疫吸附分析板，以100微升/孔的10微克/ml的AD1，AD2合成肽或者DII蛋白(ADl對應FljB-ADl，AD2 對應 FljB-AD2、FljB_4XAD2、FljB_AD2_4gH 和 Fl jB_4XgH-4XAD2_DII，DII 對應FljB-4XgH-4XAD2-DII)于包被稀釋液，4°C包被過夜。將培養(yǎng)板以包含O. 05%Tween_20的PBS (PBS-T)清洗二次。將培養(yǎng)板以250微升/孔的封閉液于37°封閉I小時后用PBS-T清洗二次。加入血清于稀釋液中(100微升/孔)，并將培養(yǎng)板于37°孵箱中培養(yǎng)I小時。將培養(yǎng)板以PBS-T清洗五次。加入稀釋于稀釋液中的辣根過氧化酶標記的山羊抗-小鼠IgG抗體(sigma，100微升/孔)，并將培養(yǎng)板于37°C孵箱培養(yǎng)I小時。將培養(yǎng)板以PBS-T洗板五次。再加入顯色液后放入37°C孵箱培養(yǎng)15分鐘。加入2M硫酸溶液作為終止液后將培養(yǎng)板放到微量分光光度計上測量0D450。3、實驗結果檢測結果如表1飛(表I飛中，Yn指某一注射劑量組中第幾只小鼠)，結果如圖20-24所示表IFljB-ADl免疫血清抗體檢測結果

權利要求
1.一種人巨細胞病毒免疫原融合蛋白，其特征在于它包括鞭毛蛋白，以及人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段代替鞭毛蛋白的高變區(qū)。
3.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述鞭毛蛋白為腸炎沙門菌亞屬(Salmonella enterica)鞭毛蛋白 2 型。
4.根據權利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述鞭毛蛋白的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO: I 所示。
5.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白為包膜糖蛋白B或者包膜糖蛋白H。
6.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白多肽片段的核苷酸編碼序列如 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8 或者 SEQID NO 10 所示。
7.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO :12、SEQID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO :18 或者 SEQ ID NO :20 所示。
8.根據權利要求7所述的融合蛋白，其特征在于其核苷酸編碼序列如SEQID NO 1US EQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :17 或者 SEQ ID N0:19 所示。
9.SEQ ID NO 1USEQ ID NO 13,SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17 或者 SEQ ID N0:19 所示核苷酸序列。
10.一種重組質粒，其特征在于它包括SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13,SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 17或者SEQ ID NO 19所示核苷酸序列。
11.一種重組表達載體，其特征在于它包括權利要求10所述的重組質粒。
12.—種制備權利要求廣8任意一項融合蛋白的方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)取權利要求11所述的重組表達載體，用IPTG誘導表達； (2)離心，得沉淀，分離純化，即得融合蛋白。
13.權利要求f8任意一項所述融合蛋白在制備人巨細胞病毒疫苗中的用途。
14.一種人巨細胞病毒疫苗，其特征在于它包含權利要求Γ8任意一項所述人巨細胞病毒免疫原融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人巨細胞病毒免疫原融合蛋白，它包括鞭毛蛋白，以及人巨細胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段；本發(fā)明公開了編碼前述融合蛋白的DNA分子，以及包含該DNA分子的重組質粒和重組表達載體；本發(fā)明公開了該融合蛋白的制備方法和用途；本發(fā)明還公開了一種人巨細胞病毒疫苗。本發(fā)明融合蛋白的免疫原性強，可刺激機體產生大量抗巨細胞病毒抗體，用于制備疫苗以預防巨細胞病毒感染引起的疾病，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號A61P31/22GK102816246SQ201210323329
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權日2012年9月4日
發(fā)明者劉蘭軍, 武志強, 李小嬌, 葛永紅 申請人:成都蓉生藥業(yè)有限責任公司