專利名稱：：一種用于結(jié)核/hiv共感染基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核肽特異性T細(xì)胞受體(TCR)和一種HIV-I肽特異性TCR，以及利用這兩種TCR制備得到的一種用于結(jié)核/HIV共感染基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染得到的CD8+T細(xì)胞及其在制備抗結(jié)核/HIV共感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核菌/艾滋病病毒雙重感染(TB/HIV雙重感染)是結(jié)核病和艾滋病防治工作面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。據(jù)WHO報(bào)道2010年全球880萬新增結(jié)核病患者中，有110萬(1/8)合并HIV感染，其中約1/3患者病情迅速惡化，短期內(nèi)發(fā)生死亡。目前針對(duì)TB/HIV雙重感染者的治療主要是抗結(jié)核和抗病毒藥物治療，面臨服用多種藥物、毒副作用大、療程長(zhǎng)、易產(chǎn)生耐藥性等問題，難以獲得明顯療效，因此亟須開發(fā)對(duì)雙重感染者行之有效的治療方法！在TB/HIV雙重感染者體內(nèi)，免疫系統(tǒng)功能被極大破壞，尤其是對(duì)結(jié)核患者具有重要保護(hù)作用的細(xì)胞免疫功能，在HIV感染時(shí)遭到嚴(yán)重破壞。由于⑶4+I型輔助性T細(xì)胞(Thl)的快速損耗和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞因子分泌功能和殺傷活性降低，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫無法控制TB病菌和HIV病毒的復(fù)制和播散。通過過繼輸注效應(yīng)T細(xì)胞給免疫低下或免疫缺陷的患者，可將保護(hù)性免疫傳遞給受者，增強(qiáng)受者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)靶抗原的特異性識(shí)別及殺傷能力并改善患者的免疫狀態(tài)。有研究表明，過繼輸注效應(yīng)T細(xì)胞給耐藥結(jié)核患者可有效清除患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌；將自體體外擴(kuò)增的CD8+CTL過繼輸注治療HIV患者也已取得了明顯的療效。但TB/HIV雙重感染者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量很少，體外分離及擴(kuò)增難度極大，限制了其臨床應(yīng)用。T細(xì)胞受體(Tcellrec印tor，TCR)是T細(xì)胞表面特異性識(shí)別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子。近年來，有學(xué)者分離抗原特異TCR基因并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至初始T細(xì)胞中，使其獲得特異性識(shí)別抗原的能力，可短期內(nèi)產(chǎn)生大量抗原特異的效應(yīng)T細(xì)胞，為過繼細(xì)胞免疫治療(adoptivecellularimmunotherapy,ACT)提供了新途徑?？乖禺怲CR基因修飾T細(xì)胞過繼輸注治療白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的效果，被證明是一種有前景的治療策略。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于結(jié)核/HIV共感染基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染得到的⑶8+T細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核/HIV共感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種用于結(jié)核/HIV共感染基因治療的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有可同時(shí)表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199—207特異性TCR和HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的融合基因；所述結(jié)核肽Ag85B199_207特異性TCR包括αI鏈和βI鏈，其中，αI鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:5所述的序列；βI鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:6所示的序列；所述HIV-I肽Env120^128特異性TCR包括α2鏈和β2鏈，其中，α2鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:7所述的序列；β2鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:8所示的序列。所述結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的αI鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:14所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性βI鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；βI鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性αI鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的αI鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示，βI鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。所述HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的α2鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:23所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β2鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β2鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:19所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α2鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的α2鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:25所示，β2鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示。優(yōu)選的，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:27所示。所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的出發(fā)載體為ρΜΧ-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞。上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核/HIV共感染藥物中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案的具體操作如下I、篩選結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異的TCR與HIV肽Eiw12ch128特異的TCR①采用淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC);②計(jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，每孔細(xì)胞分別加入含結(jié)核肽Ag85B199_2(l7、HIV肽Env謝2850ng/ml的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；③貼壁培養(yǎng)2h后，加入25U/mlIL-2,第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天；④磁珠分選出⑶8+T細(xì)胞，提取其mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑤互補(bǔ)決定區(qū)3(complementaritydeterminingregion3,CDR3)譜型分析檢測(cè)刺激前后⑶R3譜型，找出刺激后呈單克隆增生的結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異的TCRα、β基因家族與HIV肽Env12Q_128特異的TCRα、β基因家族。2、構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①根據(jù)GeneBank報(bào)道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variableregion,V)和下游恒定區(qū)(constantregion,C)基因序列，設(shè)計(jì)TCRα、β鏈全長(zhǎng)基因上、下游引物,擴(kuò)增出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異的α13、β16和HIV肽Env12Q_128特異的α11、β18全長(zhǎng)基因；②設(shè)計(jì)C區(qū)突變位點(diǎn)上、下游引物，采用重組PCR方法將結(jié)核肽Ag85B199_207特異的TCRα13、β16鏈C區(qū)的9個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變(參照文獻(xiàn)Luoff.etal.DevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011,89(9):903-13)；③設(shè)計(jì)TCRα、β鏈C區(qū)下游與⑶3ζ分子融合位點(diǎn)的重組引物，將HIV肽Env12Q_128特異的TCRα11、β18基因片段與⑶3ζ分子進(jìn)行融合；第②和第③步操作的目的在于在于減少內(nèi)外源性TCRα、β鏈的錯(cuò)配，因?yàn)镃D8+T細(xì)胞存在內(nèi)源性TCRα、β基因的表達(dá)，通過突變或者是通過以⑶3ζ鏈替換α、β全長(zhǎng)基因部分C區(qū)可以促使外源性α與β基因表達(dá)的蛋白正確裝配成TCR蛋白分子并穩(wěn)定表達(dá)在CD8+T細(xì)胞表面，同時(shí)利于其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD8+T細(xì)胞表面的CD3分子，增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)功能，提高修飾后CD8+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性。當(dāng)然，此處還可以采取其他策略來減少內(nèi)外源性TCRα、β鏈的錯(cuò)配，如在外源性α、β基因C區(qū)引入二硫鍵(Boulter,J.M.etal.(2003)Stable,solubleT-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突變外源性α、β基因C區(qū)關(guān)鍵氨基酸以改變?chǔ)?、β鏈之間的靜電荷(Voss,R.H.etal.(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Tmmunol·180,391-401);將外源性α、β基因V區(qū)合并為一條單鏈TCR并與CD3ζ鏈融合(Willemsen，R.A.etal.(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneTher.7,1369-1377);利用2A連接外源性ct、β基因?qū)崿F(xiàn)平衡表達(dá)(LeisegangM,EngelsB,MeyerhuberP,KiebackE,SommermeyerD,XueSA,ReussS，StaussH,Uckertff.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008,86:573-583.)等。④利用重組PCR技術(shù)，將結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異的TCRα13、β16基因片段通過自剪切多肽Ρ2Α進(jìn)行連接獲得最小突變TCR；⑤通過F2A上的AgeI酶切位點(diǎn)將HIV肽Env120^128特異的a11-CD3ζ、β18-CD3ζ融合基因進(jìn)行拼接。⑥通過Τ2Α上的AatII酶切位點(diǎn)將上述兩條α鏈、兩條β鏈基因片段進(jìn)行連接。上述三種基因片段經(jīng)測(cè)序鑒定后插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP并酶切鑒定；⑦采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將三種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒ρΜΧ-hVβ16mCβ_P2A_hVαI3mCα-IRES-GFP、ρΜΧ-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP,ρΜΧ-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα_T2A_hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP分別與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293；⑧收集48h-72h病毒上清，低溫超速離心濃縮純化病毒；⑨重組病毒感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒滴度，計(jì)算公式病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞數(shù)XGFP陽(yáng)性率/病毒濃縮液量(ml)。3、鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗結(jié)核和抗HIV活性①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型供者外周血PBMC；②磁珠分選CD8+T細(xì)胞；③IL-2和抗CD3單抗活化分選出的T細(xì)胞；④按感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)=13將上述三種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD8.T細(xì)胞；⑤使用IL-2和抗⑶3單抗刺激感染后的⑶8+T細(xì)胞；⑥流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染后陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；⑦測(cè)定病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗TB和抗HIV活性實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下十組TB/HIVTd+DC組TB/TCR和HIV/TCR共轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞+DC；UnTd+Ag85B組未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2(l7的DC；UnTd+Env組未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Eiw12ch128的DC；EmTd+Ag85B組空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_207的DC;EmTd+Env組:空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Eiw12ch128的DC；TB/HIVTd+CMVpp65組TB/TCR和HIV/TCR共轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載無關(guān)肽CMVpp65的DC；TBTd+Ag85B組結(jié)核特異TCR轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2(l7的DC；TB/HIVTd+Ag85B組TB/TCR和HIV/TCR共轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2(l7的DC；HIVTd+Env組HIV特異TCR轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Env120^128的DC；TB/HIVTd+Env組TB/TCR和HIV/TCR共轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Eiw12ch128的DC.用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y、TNF_a的分泌水平；用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)DC的殺傷活性。其中，CD8+T細(xì)胞是人體內(nèi)的一種細(xì)胞亞群，可由人外周血中分離獲得，并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，分離和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，技術(shù)成熟。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒序列構(gòu)建的基因運(yùn)載工具，能夠攜帶外源基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并整合到染色體基因組上，目前已成為商業(yè)化產(chǎn)品，容易購(gòu)買和獲得。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常用的分子克隆技術(shù)，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方法是目前常用的生物技術(shù)手段，除本發(fā)明中使用的人工脂質(zhì)體法外，還可以使用其它化學(xué)轉(zhuǎn)染法，包括=DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法；以及物理方法，包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明分離出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCR基因和HIV-I肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)特異的TCR基因，構(gòu)建攜帶兩種病原體表位特異TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，鑒定其轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞的抗結(jié)核和抗HIV活性。結(jié)果表明雙TCR基因轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞具有雙特異性，可針對(duì)Mtb和HIV-I兩種病原體表位發(fā)生反應(yīng)，并具有細(xì)胞因子分泌功能與殺傷活性。這種雙特異性使得即使其中一種病原體發(fā)生突變產(chǎn)生免疫逃逸時(shí)，仍可對(duì)另一種病原體產(chǎn)生反應(yīng)。該方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可應(yīng)用于Mtb/HIV雙重感染者的TCR基因治療，為Mtb/HIV雙重感染的過繼細(xì)胞免疫治療研究提供新的途徑。圖I結(jié)核肽Ag85B199_207與HIV肽Env120^128刺激前后CD8.T細(xì)胞TCRα和β鏈⑶R3譜型分析；圖2三種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建示意圖3重組病毒載體質(zhì)粒的酶切鑒定(a.pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP重組質(zhì)粒的酶切鑒定；b.ρΜΧ-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP重組質(zhì)粒的酶切鑒定；c.pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVaIIhCa-CD3ζ-IRES-GFP重組質(zhì)粒的酶切鑒定；1-5泳道分別為pMX-IRES_GFP空載體、pMX-IRES-GFP空載體的XhoI酶切產(chǎn)物、重組病毒載體質(zhì)粒、重組病毒載體質(zhì)粒的XhoI酶切產(chǎn)物、重組病毒載體質(zhì)粒的Xhol+Notl雙酶切產(chǎn)物)；圖4熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)(X10)(a_c.pMX-hVbI6mCb-P2A-hVal3mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP轉(zhuǎn)染(TB/HIVTd)ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞GFP的表達(dá)；d-f.ρΜΧ-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP轉(zhuǎn)染(TBTd)NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)；g-i.ρΜΧ-hVβ18hCP-CD3ζ_F2A_hVaIlhCa-CD3ζ-IRES-GFP轉(zhuǎn)染(HIVTd)NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)；從左到右依次為明場(chǎng)、熒光、疊加圖)；圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染后ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞的GFP表達(dá)陽(yáng)性率(a.未轉(zhuǎn)染組；b.pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP轉(zhuǎn)染組；c.ρΜΧ-hVβ16mCβ-Ρ2Α-hVα13mCα-IRES-GFP轉(zhuǎn)染組；d.ρΜΧ-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP轉(zhuǎn)染組)；圖6熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(X10；EmTd:空載體轉(zhuǎn)染組；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(UnTd:未轉(zhuǎn)染組；EmTd空載體轉(zhuǎn)染組；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖8ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞IFN-Y的分泌水平；圖9ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞TNF-α的分泌水平；圖10TRFIA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞的殺傷活性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中，所有計(jì)量資料結(jié)果用±s表示，采用單因素方差分析(One-Way八勵(lì)￥4)比較各組間細(xì)胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差異，方差不齊時(shí)用Welch校正，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett’sT3法校正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS17.Oforwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例I.篩選結(jié)核肽Ag85B199_207(KLVANNTRL)特異的TCR與HIV肽Env120^128(KLTPLCVTL)特異的TCRI.I密度梯度離心法分離純化PBMC(1)在15ml刻度無菌離心管加入適量Ficoll淋巴細(xì)胞分離液；(2)取肝素抗凝的外周靜脈血與等量RPMI1640液充分混勻稀釋，用巴斯德滴管吸取2倍體積的抗凝血沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平離心2030min；(3)離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和稀釋液，管底主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的灰白色云霧層；(4)用吸管插到灰白色層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)，加入5倍以上體積的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min離心lOmin，洗滌細(xì)胞兩次去除大部分混雜的血小板后為PBMC；(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力檢測(cè)PBMC細(xì)胞懸液與1/10體積的O.4%臺(tái)酚藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)板上角上四個(gè)大方格總細(xì)胞數(shù)，總細(xì)胞數(shù)的四分之一數(shù)乘以IO4即為每毫升濃度；死細(xì)胞可著色臺(tái)盼藍(lán)，活的不著色，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率[活細(xì)胞率％=(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X100%]。I.2制備結(jié)核肽Ag85B199_2OT、HIV肽Eiw12ch128特異T細(xì)胞克隆(1)計(jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，分別加入含結(jié)核肽Ag85B199_2(l7、HIV肽Env120^12850ng/ml的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；(2)37。C、5%CO2條件下培養(yǎng)2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天。I.3免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物公司)分選⑶8+T細(xì)胞。I.4總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述收集到的細(xì)胞沉淀的總RNA。I.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(Fermentas)合成cDNA。(I)取總RNA22μ1，加oligo(dT)primeKO.5μg/μ1)2μ1，輕柔混勻，70。C，5min；(2)加5Xbuffer8μI,RiboLockRibonucleaseInhibitor(20u/μI)2μI,IOmMdNTP4μ1，輕輕混勻，37°C，5min;(3)加RevertAidHMinusM-MuLV(200u/yI)2μ1，總體積40μ1,42°C，60min，70°C,IOmin0I.6PCR擴(kuò)增34個(gè)TCRVa基因家族CDR3片段利用34條TCRVa家族特異性上游引物和共用下游Cα外、內(nèi)側(cè)引物(參照文獻(xiàn)XIN-SHENG等，2006,Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)做半巢式PCR第一輪PCR:每樣本做34個(gè)PCR反應(yīng)管，第I34管分別加入TCRVαI至Vα34家族上游引物，每管加共用下游Cd外側(cè)引物Ιμ，各引物濃度均為10μΜ。每PCR反應(yīng)管體積為25μ1，含cDNA模板1·0μl，10mmol/LdNTPO.5μ1，IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2L5μ1，TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min;95°C30s,60。C30s，72。Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸lOmin。第二輪PCR:反應(yīng)總體積為25μ1，含第一輪PCR產(chǎn)物2μl，10mmol/LdNTPO.5μI,10XBuffer2·5μI，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U,TCRVα34條家族上游引物1μ1，下游FAM標(biāo)記內(nèi)側(cè)Ca引物Iμ1，各引物濃度均為10μM。PCR反應(yīng)條件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4個(gè)循環(huán)。I.7PCR擴(kuò)增24個(gè)TCRνβ基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)每樣本做24個(gè)PCR反應(yīng)管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物Iμ1，第I至第24管分別加入TCRνβ至TCRVβ24上游引物Iμ1，各引物濃度均為10μM15PCR反應(yīng)體積為25μ1，含cDNA模板Iμ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件94。C變性3min;94。Clmin,55°Clmin,72°Clmin,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。1.8瓊脂糖凝膠電泳取34個(gè)TCRVa和24個(gè)TCRνβ基因家族PCR產(chǎn)物各5μ1，2%瓊脂糖凝膠電泳，110V，20min,采用凝膠成像系統(tǒng)照相。剩余PCR產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆谩.9CDR3譜型分析取34個(gè)Va、24個(gè)νβ基因家族FAM熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物2μ1，在373DNA序列分析儀(ABI,PerkinElmer)上進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,收集電泳過程中不同時(shí)間出現(xiàn)的不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)，GeneScan672軟件自動(dòng)分析收集的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為不同位置、高度和形態(tài)的峰，代表各TCR家族CDR3成員出現(xiàn)的頻率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有單峰分布的TCR家族即是抗原特異性單克隆增生的TCR家族。⑶R3譜型分析結(jié)果顯示，抗原肽刺激⑶8+T細(xì)胞后，部分TCR基因家族譜型發(fā)生改變，由原來的8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布變?yōu)樯儆?個(gè)峰的單寡峰分布，表明這些家族是由于抗原肽持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出刺激前為多克隆，結(jié)核肽Ag85B199_2OT和HIV肽Eiw12ch128刺激后分別呈單克隆擴(kuò)增的Va13、Vβ16和Va11、Vβ18基因家族(圖I)。測(cè)序顯示，Va13,νβ16和Va11、νβ18CDR3區(qū)的核苷酸序列分別如SEQIDNO:I4所示，所編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:58所示。2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2.I引物合成依據(jù)GeneBank報(bào)道的Va13、Vβ16和Va11、Vβ18基因家族V區(qū)序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因上、下游引物，依據(jù)9個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變后的C區(qū)序列分別設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)處的上、下游引物，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)與CD3ζ分子融合處的重組引物，依據(jù)2Α肽連接序列設(shè)計(jì)重組引物，全部引物Invitrogen由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱和序列(5’to3’)如下權(quán)利要求1.一種用于結(jié)核/Hiv共感染基因治療的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有可同時(shí)表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR和HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的融合基因；所述結(jié)核肽Ag85B199_207特異性TCR包括αI鏈和βI鏈，其中，αI鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:5所述的序列；βI鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:6所示的序列；所述HIV-I肽Env120^128特異性TCR包括α2鏈和β2鏈，其中，α2鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:7所述的序列；β2鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:8所示的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，所述結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的αI鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:14所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性βI鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；βI鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性αI鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，所述結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的αI鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示，βI鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，所述HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的α2鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:23所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β2鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β2鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:19所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α2鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，，所述HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的α2鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:25所示，β2鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示。6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:27所示。7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，出發(fā)載體包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。9.權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞。10.權(quán)利要求I所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒、權(quán)利要求9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核/HIV共感染藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于結(jié)核/HIV共感染基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其應(yīng)用。本發(fā)明分離出結(jié)核肽Ag85B199–207(KLVANNTRL)特異的TCR基因和HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)特異的TCR基因，進(jìn)一步構(gòu)建攜帶兩種病原體表位特異TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞，獲得雙TCR基因轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞。該T細(xì)胞具有雙特異性，可針對(duì)Mtb和HIV-1兩種病原體表位發(fā)生反應(yīng)，并具有細(xì)胞因子分泌功能與殺傷活性。這種雙特異性使得即使其中一種病原體發(fā)生突變產(chǎn)生免疫逃逸時(shí)，仍可對(duì)另一種病原體產(chǎn)生反應(yīng)。該方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可應(yīng)用于Mtb/HIV雙重感染者的TCR基因治療，為Mtb/HIV雙重感染的過繼細(xì)胞免疫治療研究提供新的途徑。文檔編號(hào)A61K48/00GK102876715SQ20121032649公開日2013年1月16日申請(qǐng)日期2012年9月5日優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日發(fā)明者馬驪,郝佩佩,羅微,溫茜申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)