專利名稱：一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得感染最常見、最重要的致病菌，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，金葡菌的耐藥情況愈來愈嚴重。目前，90%以上的金葡菌對青霉素耐藥，自1961年英國首次報道耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantstaphylococcus aureus,MRSA)至今，由MRSA引起的感染已經(jīng)遍及全球,且其檢出率不斷增高。MRSA對所有β -內(nèi)酰胺類抗生素和其他多種抗菌藥物耐藥，因此由MRSA引起的感染，治療十分困難，死亡率很高。目前治療MRSA最有效的藥物是萬古霉素，然而隨著耐萬古霉素MRSA的出現(xiàn)，人們即將面臨無藥可用的境地，因此尋找新的特異性抗MRSA感染的新靶點 及新策略成為細菌感染治療領(lǐng)域的研究熱點和難點。傳統(tǒng)的抗菌藥物的研發(fā)主要是對已知抗生素進行結(jié)構(gòu)修飾，然而按照這種方法發(fā)現(xiàn)新先導(dǎo)物變得越來越困難，同時細菌產(chǎn)生耐藥性的速度遠遠超過新抗菌藥物的研發(fā)速度，所以必須尋找新的突破口。由于具有全新作用模式的抗菌藥物可以大大減慢細菌產(chǎn)生耐藥性的速度，因此目前抗菌藥物的研究主要集中在尋找新的作用靶標和新的作用模式的藥物。2005年美國AVI公司提出的反義抗菌劑是一種具有全新作用模式的抗菌藥物——通過RNase H介導(dǎo)的靶RNA的降解及抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等方式而抑制致病菌基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯進而抑制細菌的生長、繁殖，從而達到減毒、抑制或殺滅細菌的目的，該類藥物是最具研發(fā)潛能的新型抗菌藥物。與傳統(tǒng)藥物相比，以細菌治病基因為靶點的反義抗菌劑因具有高特異性、高效性、低毒、安全等特點，是極具開發(fā)潛能的新型抗菌藥物。在眾多種類的反義分子中鎖核酸(LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物引起了人們的廣泛關(guān)注，有希望成為分子水平治療各種疾病的突破口。LNA是一種特殊的雙環(huán)狀寡核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中核酸的Y -0,4' -C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，形成了剛性的縮合結(jié)構(gòu)，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，所以它對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力，與其他寡核苷酸類似物相比，LNA有很多優(yōu)點1)和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩(wěn)定性；2)具有抗
脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性；3) LNA-DNA雜交物能激活RNase H ；4)體內(nèi)無毒性作用；5)有高效的自動寡聚化作用，合成方法相對簡單，部分或完全修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動合成儀上合成，由此可見，LNA是一種理想的反義藥物。然而，LNA充分發(fā)揮其反義作用的前提是必須在細菌細胞內(nèi)的靶mRNA結(jié)合部位達到有效濃度，而LNA是荷負電荷的大分子化合物，不易透過細菌的細胞壁和細胞膜、胞內(nèi)濃度低，并能非特異性的被機體細胞所攝取，因此高效的、特異性靶向細菌的遞藥載體是限制反義抗菌劑研制的瓶頸問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過對MRSA細胞分裂的關(guān)鍵蛋白——絲狀溫度敏感蛋白Z(flamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)的結(jié)構(gòu)基因 ftsZ mRNA 為革巴點進行研究，提供一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，包含(KFF) 3K-Cys-SMCC-C6-LNA787,所述的(KFF) 3K-Cys-SMCC-C6-LNA787 為透膜肽(KFF)3K 與 LNA787 之間以半胱氨酸-〔4-(N-馬來酰亞胺甲基)-1_環(huán)己酰胺〕-己烷進行連接；所述LNA787 的序列為 5，-T+*GA+CT*C+GCOA+C+CA*GTAA*TA+T+*T_3，，其中 A 為腺嘌呤核苷酸單體，T為胸腺嘧啶核苷酸單體，C為胞嘧啶核苷酸單體，G為鳥嘌呤核苷酸單體；*X代表硫代修飾，X+代表LNA修飾，X為A、T、C或G ; 所述硫代修飾的核苷酸如式(I )所示，所述LNA修飾的核苷酸結(jié)構(gòu)中2' -O位和4/ -C位通過縮水作用形成氧亞甲基橋，并連接成環(huán)形，如式(II)所示
權(quán)利要求
1.一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，其特征在于包含(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787，所述的(KFF) 3K-Cys-SMCC-C6-LNA787 為透膜肽(KFF) 3K 與 LNA787 之間以半胱氨酸-〔4- (N-馬來酰亞胺甲基)-1_環(huán)己酰胺〕-己烷進行連接； 所述 LNA787 的序列為 5’ -T+*GA+CT*C+GCOA+C+CA*GTAA*TA+T+*T_3’，其中 A 為腺嘌呤核苷酸單體，T為胸腺嘧啶核苷酸單體，C為胞嘧啶核苷酸單體，G為鳥嘌呤核苷酸單體；*X代表硫代修飾，X+代表LNA修飾，X為A、T、C或G ; 所述硫代修飾的核苷酸如式(I )所示，所述LNA修飾的核苷酸結(jié)構(gòu)中2' -O位和4，-C位通過縮水作用形成氧亞甲基橋，并連接成環(huán)形，如式(II)所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，其特征在于所述透膜肽(KFF)31(的序列為5’ -KFFKFFKFFK-3’，其中K為賴氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，其特征在于所述(KFF) 3K-Cys-SMCC-C6-LNA787 的序列為5’ -KFFKFFKFFK-Cys-SMCC-C6-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，其特征在于核苷酸單體中的堿基為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑的制備方法，其特征在于所述的(KFF) 3K-Cys-SMCC-C6-LNA787是將透膜肽(KFF) 3K和LNA787通過作為空間間隔的Cys-SMCC-C6共價連接，以固相合成法制備而得。
6.權(quán)利要求I所述透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑在制備抗耐藥菌的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發(fā)明公開一種透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑，包含PLNA787，所述的PLNA787為透膜肽(KFF)3K與LNA787之間以半胱氨酸-〔4-(N-馬來酰亞胺甲基)-1-環(huán)己酰胺〕-己烷進行連接，以固相合成法制備而得。本發(fā)明的透膜肽介導(dǎo)的反義抗菌劑以細菌治病基因為靶點，具有高特異性、高效性、低毒、安全等優(yōu)點，對耐藥菌的生長具有顯著的抑制作用，尤其可以顯著拮抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生長。
文檔編號A61K47/48GK102827251SQ20121033501
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者羅曉星, 孟靜茹, 馬雪, 薛小燕, 賈敏, 侯征, 達飛, 桑國軍 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學