專利名稱：丙酮酸乙酯在制備藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制藥領(lǐng)域，涉及丙酮酸乙酯的新的藥物用途，尤其涉及丙酮酸乙酯在制備腦損傷后血腦屏障保護(hù)藥物，和促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)是丙酮酸的一種穩(wěn)定的簡(jiǎn)單酯化物形式，其結(jié)構(gòu)式為CH3C0C00CH2-CH3，相對(duì)分子量116.5，其原本作為一種工業(yè)原料廣泛使用，后常作為食品添加劑使用。該丙酮酸乙酯已被美國(guó)食品藥物管理局列為對(duì)人體安全的物質(zhì)，具有廣闊的藥物開發(fā)前景。研究顯示,創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是最常見的青年和兒童的死亡和致殘?jiān)颍⑶移渲械男掖嬲叽蠖喟橛胁煌潭鹊母杏X(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力的下降，這不僅影響患者生存質(zhì)量，還加重了社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為一個(gè)全球性的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。最新研究發(fā)現(xiàn)，血腦屏障是神經(jīng)功能損傷的中心環(huán)節(jié)，因此推測(cè)能夠顯著減少腦損傷后血腦屏障損傷的藥物可以促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。令人遺憾的是，臨床上至今尚無(wú)有效的治療方法能夠改善創(chuàng)傷性腦損傷患者的長(zhǎng)期神經(jīng)功能障礙，降低殘疾的發(fā)生率。研制具有促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療藥物和減輕腦損傷后血腦屏障滲漏的藥物一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的目的是提 供丙酮酸乙酯在制藥中的新用途。尤其涉及丙酮酸乙酯在制備治療血腦屏障損傷藥物和 促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的藥物中的用途。本發(fā)明采用外源性給予丙酮酸乙酯的方式用于血腦屏障損傷治療和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的治療，通過(guò)系列整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1，丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的影響實(shí)驗(yàn)，包括術(shù)前訓(xùn)練和術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物進(jìn)行錯(cuò)步試驗(yàn)，錄像后對(duì)受累(左側(cè))前肢和后肢的錯(cuò)步情況進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)，其中，分組為:只去除骨板為Sham組，不進(jìn)行打擊vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液Iml ;EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg ;結(jié)果顯示，與sham組相比，*P < 0.05，**P
<0.01 ;與 vehicle 組相比，flP < 0.05，mP < 0.01 (如圖1 所示)。2，丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響實(shí)驗(yàn)，其中包括:在腦外傷后21-24天，將動(dòng)物放入Morris水迷宮中，通過(guò)檢測(cè)其找到水下平臺(tái)的潛伏期，觀察各組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力；在術(shù)后第25天，將水下平臺(tái)撤去，觀察各組大鼠在目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在區(qū)域)的停留時(shí)間百分比，以了解各組大鼠的空間記憶能力，其中Sham組為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；腦外傷后0、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液(vehicle組)或丙酮酸乙酯30mg/kg (EP組)，結(jié)果顯示，與sham組相比，*P < 0.05,**P < 0.01 ;與 vehicle 組相比，#P < 0.05，mP < 0.01。3，丙酮酸乙酯減少腦外傷后大鼠組織損傷體積實(shí)驗(yàn)，其中包括:制成各組大鼠在術(shù)后28天的CV染色圖片；制成各組大鼠腦損傷體積的統(tǒng)計(jì)圖，包括Vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg。4，丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后大鼠血腦屏障滲透性的影響實(shí)驗(yàn)，其中包括:在腦外傷后48小時(shí)，通過(guò)股靜脈向各組大鼠緩慢注入預(yù)熱的evans blue溶液，循環(huán)3小時(shí)后處理動(dòng)物，制2_厚的腦片；用甲酰胺法分別檢測(cè)各組動(dòng)物每片腦片的evansblue含量(u g/g);測(cè)每組動(dòng)物腦組織中的藍(lán)染體積占未損傷側(cè)腦組織體積的百分?jǐn)?shù)，其中，Sham組為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg ;結(jié)果顯示，與 sham組相比，*P <0.05，**P<0.01 ;與 vehicle 組相比，flP < 0.05，##P < 0.01。5，丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響實(shí)驗(yàn)，其中包括:腦外傷后48小時(shí)透射電鏡檢測(cè)各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果顯示，sham組(如圖5A和所示):毛細(xì)血管形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞完整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，基底膜厚薄均一，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足緊貼血管外壁，緊密連接結(jié)構(gòu)清晰vehicle組(如圖5B和5E所示):毛細(xì)血管輕度變形，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，線粒體空泡變性，內(nèi)皮小凹增多，變深，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足極度水腫；丙酮酸乙酯處理組(EP)(如圖5C和5F所示):毛細(xì)血管無(wú)變形，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，部分線粒體空泡化，內(nèi)皮小凹少見，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足輕度水腫。6，丙酮酸乙酯抑制腦外傷后大鼠MMP-9和MMP-2的活性上調(diào)實(shí)驗(yàn)，其中包括:在腦外傷后48或72小時(shí)處理動(dòng)物，提取損傷周邊組織蛋白，進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)MMP-9和MMP-2的活性，和MMP-9和MMP-2明膠酶譜的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與sham組相比，*P < 0.05廣P
<0.01 ;與 vehicle 組相比，flP < 0.05，mP < 0.01。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述的丙酮酸乙酯具有如下作用:1、丙酮酸乙酯可以減輕腦損傷后的血腦屏障破壞，減少腦組織損傷；2、丙酮酸乙酯可以促進(jìn)腦損傷后的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙，促進(jìn)空間學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所述的丙酮酸乙酯可作為治療藥物治療腦損傷后血腦屏障損傷，或促進(jìn)腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。


圖1丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的影響。A、B，分別為術(shù)前訓(xùn)練和術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物進(jìn)行錯(cuò)步試驗(yàn)，錄像后對(duì)受累(左側(cè))前肢和后肢的錯(cuò)步情況進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)。假手術(shù)組(Sham組)為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；對(duì)照組(vehicle組)為腦外傷后即亥11、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液Iml ;丙酮酸乙酯處理組(EP組)為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg。與假手術(shù)組相比，乍< 0.05，**P <0.01 ；與對(duì)照組相比，flP < 0.05，##P < 0.01。n=10/ 組。圖2丙酮酸乙酯 對(duì)腦外傷后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。A，在腦外傷后21-24天，將動(dòng)物放入Morris水迷宮中，通過(guò)檢測(cè)其找到水下平臺(tái)的潛伏期，來(lái)了解各組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。B，在術(shù)后第25天，將水下平臺(tái)撤去，觀察各組大鼠在目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在區(qū)域)的停留時(shí)間百分比，以了解各組大鼠的空間記憶能力。假手術(shù)組(Sham組)為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；腦外傷后0、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液(對(duì)照組)或丙酮酸乙酯30mg/kg(EP組)。與假手術(shù)組相比，*P <0.05，呷< 0.01 ;與對(duì)照組相比，flP < 0.05，##P < 0.01。n=10/ 組。圖3丙酮酸乙酯減少腦外傷后大鼠組織損傷體積。A，各組大鼠在術(shù)后28天的焦油紫(CV)染色圖片，圖中腦片缺損部分為損傷核心區(qū)域。B，各組大鼠腦損傷體積(mm3)的統(tǒng)計(jì)圖。對(duì)照組(Vehicle組)為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；丙酮酸乙酯處理組(EP組)為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg。與對(duì)照組相比，##P < 0.01。n=10/組。圖4丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后大鼠血腦屏障滲透性的影響。A，在腦外傷后48小時(shí)，通過(guò)股靜脈向各組大鼠緩慢注入預(yù)熱的伊文氏藍(lán)溶液，循環(huán)3小時(shí)后處死動(dòng)物，將腦小心移出，切成2mm厚的腦片。B，用甲酰胺法分別檢測(cè)各組動(dòng)物每片腦片的伊文氏藍(lán)含量(y g/g)。C，每組動(dòng)物腦組織中的藍(lán)染體積占未損傷側(cè)腦組織體積的百分?jǐn)?shù)。假手術(shù)組(Sham組)為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；對(duì)照組(Vehicle組)為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；丙酮酸乙酯處理組(EP組)為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg。與假手術(shù)組相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;與對(duì)照組相比，flP < 0.05，mP
<0.01。n=5/ 組。圖5丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響。腦外傷后48小時(shí)透射電鏡檢測(cè)各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的改變。A和D，為假手術(shù)組(Sham組):毛細(xì)血管形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞完整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，基底膜厚薄均一，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足緊貼血管外壁，緊密連接結(jié)構(gòu)清晰。B和E，為對(duì)照組(Vehicle組):毛細(xì)血管輕度變形，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，線粒體空泡變性，內(nèi)皮小凹增多，變深，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足極度水腫。C和F，為丙酮酸乙酯處理組(EP組):毛細(xì)血管無(wú)變形，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，部分線粒體空泡化，內(nèi)皮小凹少見，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足輕度水腫。*為星形膠質(zhì)細(xì)胞終足，L為血管腔，R為紅細(xì)胞，Mt為線粒體。n=3/組。標(biāo)尺:A-C 為 2 u m ；D-F Slum。圖6丙酮酸乙酯抑制腦外傷后大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2的活性上調(diào)。A，在腦外傷后48或72小時(shí)處死動(dòng)物，提取損傷周邊組織蛋白，進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)MMP-9和MMP-2的活性。B和C，MMP-9和MMP-2明膠酶譜的統(tǒng)計(jì)圖。假手術(shù)組(Sham組)為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；對(duì)照組(Vehicle組)為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg。與假手術(shù)組相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;與對(duì)照組相比，flP < 0.05，##P < 0.01。n=4/ 組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1丙酮酸乙酯改善腦外傷后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)實(shí)驗(yàn)采用錯(cuò)步試驗(yàn)評(píng)價(jià)腦 外傷后大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)能力，動(dòng)物分組為=Sham組為只去除骨板，不進(jìn)行打擊vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液Iml ；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg:在腦外傷前三天，所有動(dòng)物先接受連續(xù)三天的錯(cuò)步訓(xùn)練，每天三次(每次間隔5min)，訓(xùn)練第三天進(jìn)行評(píng)分，剔除未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(平均得分低于5分)；在術(shù)后設(shè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行正式評(píng)估，每天相同時(shí)間、地點(diǎn)，評(píng)估三次，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0分:完全踩空，腳未接觸到橫檔即掉下，身體失去正常的姿勢(shì)和平衡；1分:腳放在了橫檔上，但當(dāng)該腳承重時(shí)滑下，導(dǎo)致掉落，影響正常行走；2分:腳放在了橫檔上，但當(dāng)該腳承重時(shí)滑下，但未導(dǎo)致該腳掉落，也不影響其行走，其平衡和正常步態(tài)得以維持；3分:腳放在了橫檔上，但在該腳承重前動(dòng)物將該腳迅速抬起并移到另一個(gè)橫檔上；4分:腳想放到一個(gè)橫檔上，但因?yàn)闆](méi)有接觸到這個(gè)橫檔而放在了另一個(gè)橫檔上；5分:部分放置，腳在橫檔上，但是由腳踝甚至腳趾、膝蓋承重；6分:正確，腳掌正中，完全承重，每只動(dòng)物僅評(píng)估受累前肢和后肢，每只腳的每步平均得分用于統(tǒng)計(jì)分析；結(jié)果顯示，與sham 組相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;與 vehicle 組相比，flP < 0.05，##P < 0.01，n=10/組。實(shí)施例2.丙酮酸乙酯改善腦外傷后空間學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮(Morriswater maze task)實(shí)驗(yàn)外傷后大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力用Morris水迷宮檢測(cè)，分組:Sham組為只去除骨板，不進(jìn)行打擊；腦外傷后0、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液(vehicle組)或丙酮酸乙酯30mg/kg (EP組)，大鼠在腦外傷后第21天開始接受連續(xù)四天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，在一個(gè)直徑1.6米的黑色水池中注入深35厘米的清水，水溫21 士 1°C，通過(guò)水池正中心將水池分成等分的四個(gè)象限，其中一個(gè)象限確定為目標(biāo)象限，并在其正中安放一個(gè)10厘米直徑的黑色平臺(tái)，使之位于水下2厘米處。房間四壁設(shè)置若干固定的圖案供大鼠作為目標(biāo)標(biāo)記，水池頂上安放紅外線攝像頭進(jìn)行全程拍攝，并連接電腦；為測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力，將大鼠從四個(gè)象限的池子邊緣中點(diǎn)，頭朝池壁放入水中，允許大鼠在水中停留60s尋找隱蔽的水下平臺(tái)，如果60s內(nèi)未爬上平臺(tái)，則引導(dǎo)其爬上平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上待IOs ;如果大鼠在60s內(nèi)爬上平臺(tái)，同樣讓其在平臺(tái)上待10s。每只大鼠每天訓(xùn)練四次(即四個(gè)象限各一次)，每次訓(xùn)練間隔lmin，每天找到平臺(tái)的平均時(shí)間為其學(xué)習(xí)時(shí)間，用于學(xué)習(xí)階段的統(tǒng)計(jì)分析，在四天學(xué)習(xí)結(jié)束后的一天進(jìn)行記憶能力的測(cè)試:撤除水下平臺(tái)，從平臺(tái)最遠(yuǎn)點(diǎn)放入大鼠，在60s內(nèi)記錄其在各個(gè)象限尋找平臺(tái)的時(shí)間，用于記憶能力的統(tǒng)計(jì)分析；結(jié)果顯示，與sham組相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;與 vehicle 組相比，flP < 0.05，mP < 0.01，n=10/ 組。實(shí)施例3.丙酮酸乙酯減少腦外傷后大鼠組織損傷體積的實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組=Vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、36、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg ;腦外傷后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用10%水合氯醛按360mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠。動(dòng)物仰臥位固定，經(jīng)左心室快速灌注高壓滅菌的生理鹽水200ml，而后快速灌注含有4%多聚甲醛的0.1MPB (pH7.4) 100ml,隨后緩慢灌注100ml。然后取腦并將腦組織依次浸于含4%多聚甲醛的20%蔗糖(pH7.4)，含30%蔗糖的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，待腦組織下沉，進(jìn)行冰凍切片。焦油紫染色后，用lecaiQ1050圖象分析儀分析CV染色后腦片，正常腦組織染為藍(lán)紫色，損傷腦組織淺染，根據(jù)光密度的不同進(jìn)行圖像處理分析，計(jì)算腦組織損傷體積，結(jié)果顯示，與 Vehicle 組相比，mP < 0.01, n=10/ 組。實(shí)施例4.丙酮酸乙酯減少腦外傷后血腦屏障的滲漏試驗(yàn)?zāi)X外傷后48小時(shí),經(jīng)大鼠左側(cè)股靜脈注入29ffivans blue溶液(5ml/kg)。3小時(shí)后麻醉大鼠，經(jīng)左心室灌注生理鹽水300ml,斷頭取腦,做2mm厚冠狀切片，拍照。采用ImageTool圖像分析軟件分析Evans blue藍(lán)染體積。為了消除腦水腫因素，我們采用以下公式:Evans blue藍(lán)染體積(mm3)= E (對(duì)側(cè)腦組織面積_同側(cè)正常腦組織面積)X 2將損傷側(cè)和對(duì)側(cè)腦片依次分別稱量并浸泡在150 U I甲酰胺溶液中，600C，避光48小時(shí)。離心取上清液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)(\ =632nm) OD值，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)三次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克大鼠腦組織中Evans blue的含量(U g/g)結(jié)果顯示了每組動(dòng)物腦組織中的藍(lán)染體積占未損傷側(cè)腦組織體積的百分?jǐn)?shù)，Sham組為只去除骨板，不進(jìn)行打擊vehicle組為腦外傷后即刻、12、24、3·6、48、60小時(shí)腹腔注射乳酸鈉林格注射液；EP組為腦外傷后各時(shí)間點(diǎn)腹腔注射丙酮酸乙酯30mg/kg ;與sham組相比，*P < 0.05, **P < 0.01 ;與vehicle組相比，flP < 0.05，##P < 0.01，n=5/ 組。實(shí)施例5.丙酮酸乙酯對(duì)腦外傷后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響腦外傷后2天或28天，將大鼠麻醉后斷頭取腦，取損傷周邊皮層(n=3)或胼胝體(n=3)，大小為lmm3。將組織塊置于2.5%戊二醛電鏡固定液12小時(shí)，經(jīng)0.1M磷酸緩沖液漂洗后，用I%0s04后固定I小時(shí)。經(jīng)0.1M磷酸緩沖液漂洗后，梯度乙醇脫水和丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂618原位包埋。LKB-1型超薄切片機(jī)(瑞典Leica)切片，厚度為50nm。枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色。CM120透射電鏡(Philips公司)下觀察并照相；腦外傷后48小時(shí)透射電鏡檢測(cè)各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的改變結(jié)果顯示，sham組:毛細(xì)血管形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞完整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，基底膜厚薄均一，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足緊貼血管外壁，緊密連接結(jié)構(gòu)清晰vehicle組:毛細(xì)血管輕度變形，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，線粒體空泡變性，內(nèi)皮小凹增多，變深，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足極度水腫；丙酮酸乙酯處理組(EP):毛細(xì)血管無(wú)變形，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，部分線粒體空泡化，內(nèi)皮小凹少見,星形膠質(zhì)細(xì)胞終足輕度水腫。實(shí)施例6.丙酮酸乙酯抑制腦外傷后大鼠MMP-9和MMP-2的蛋白活性上調(diào)按上述方法動(dòng)物分組，用明膠酶譜法測(cè)定MMP-2和MMP-9的蛋白活性。制備1.0mm厚度的含1%明膠的75g/L聚丙烯酰胺凝膠。凝膠聚合后，加入50g/L濃縮膠。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液。樣品與等量加樣緩沖液混合。取30ug總蛋白，于4°C下40mA至分離膠后轉(zhuǎn)為125v恒壓電泳直至溴酚藍(lán)跑至凝膠外，約120分鐘。在冰上將凝膠置于25ml/LTriton X-100溶液中振蕩洗脫30分鐘X 3次。在冰上將凝膠置于孵育緩沖液中振蕩洗滌20分鐘X 2次。然后更換新的孵育緩沖液37° C孵育40小時(shí)。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色3小時(shí)，及脫色液脫色顯示出MMP-2和MMP-9位于藍(lán)色背景上的透亮帶。凝膠掃描后，使用Image J圖像分析軟件測(cè)定酶分解條帶的灰度值，根據(jù)樣品中蛋白濃度計(jì)算出樣品中酶的比活性，結(jié)果顯示，與sham組相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;與vehicle組相比，flP < 0.05，mP < 0.01，n= 4/ 組。
權(quán)利要求
1.丙酮酸乙酯在制備治療腦損傷后血腦屏障滲漏的藥物中的用途。
2.丙酮酸乙酯在制 備促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物制藥領(lǐng)域，涉及丙酮酸乙酯的新的藥物用途，本發(fā)明采用外源性丙酮酸乙酯，通過(guò)系列整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所述的丙酮酸乙酯能減輕腦損傷后的血腦屏障破壞，減少腦組織損傷；能促進(jìn)腦損傷后的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙，促進(jìn)空間學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所述的丙酮酸乙酯可作為治療藥物用于治療腦損傷后血腦屏障損傷，或促進(jìn)腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。
文檔編號(hào)A61P25/00GK103070853SQ201210335640
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者施宏, 梁偉民 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院