專利名稱：一種惡性瘧原蟲pfs25蛋白二聚體衍生物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于傳染病防治領域，具體涉及惡性瘧疾的防治，尤其涉及用于阻斷瘧疾傳播的疫苗的候選靶抗原。
背景技術：
瘧疾是通過按蚊叮咬傳播的寄生蟲病，其病原體為瘧原蟲。世界衛(wèi)生組織2009年年度報告顯示，全球每年有2. 43億瘧疾臨床病例，死亡86. 3萬人(WHO. World MalariaReport 2009[EB/0L],)。鑒于此，針對死亡率甚高的惡性瘧疾開發(fā)預防用疫苗，已經(jīng)成為與愛滋病、結核疫苗并列的世界“三大”疫苗項目之一。世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國計劃開發(fā)署已將瘧疾疫苗列入優(yōu)先發(fā)展項目。比爾·蓋茨基金會也設置了 “瘧疾疫苗專題”。
Pfs25蛋白是惡性瘧原蟲的配子體表面蛋白，并持續(xù)存在于合子和動合子期，Pfs25是介導動合子穿越圍食膜(peritrophic membrane, PM)和對蚊中腸壁基底膜侵入的關鍵性蛋白，其抗體能夠抑制合子在蚊蟲腸道內(nèi)的發(fā)育，因此起到傳播阻斷的效果，所以pfs25蛋白被認為是惡性瘧疾疫苗的重要候選抗原。這種疫苗與其他瘧疾疫苗或抗瘧藥聯(lián)合應用時，可阻斷那些逃避疫苗保護或?qū)λ幬锂a(chǎn)生抗性而幸存下來原蟲的傳播。1988年Kaslow DC等首次報道了 Pfs25蛋白質(zhì)，結果表明該蛋白質(zhì)由217個氨基酸組成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四個“EGF樣的結構域”(Nature. 1988 May5;333(6168) :74-6. );1991年Barr PJ等報道了重組Pfs25蛋白作為傳播阻斷疫苗在試驗動物上的效果(The Journal of experimental medicine. 1991 Nov I ;174(5) : 1203-8.);以上研究為進一步研制傳播阻斷型惡性瘧疾疫苗奠定了基礎。此后，很多研究人員在多種系統(tǒng)中對pfs25進行了表達和評價,Takafumi Tsuboi等人在麥芽無細胞系統(tǒng)(Wheat GermCell-Free System)中表達了 Pfs25蛋白，該重組蛋白可抑制痕原蟲的發(fā)育(Infection andImmunity, 2008, 76 (4) : 1702-1708. ) ；Godfree Mlambo等在昆蟲桿狀病毒表達體系中表達了 Pfs25 蛋白(Vaccine 2010, 28:7025 - 7029) ；Christine E.等報道了 pfs25 在植物表達系統(tǒng)中表達，并且驗證了對惡性痕疾傳播的阻斷活性(Human Vaccines, 2011, Volume 7Supplement, DOI: 10. 4161/hv. 7. 0. 14588.)。在各種表達體系中，酵母表達體系被廣泛應用，獲得的表達產(chǎn)物也被應用于人體臨床研究。1993年，Kaslow DC等公開了采用酵母系統(tǒng)表達Pfs25蛋白突變體的方法，該突變體將pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換成丙氨酸(美國專利US5217898) ；Zou L等報道在畢赤酵母中表達的另一種pfs25蛋白突變體，該突變體將Pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換成谷氨酰胺(Vaccine. 2003Apr2; 21 (15) :1650-7.)。在以上工作的基礎上，Yimin Wu等人分別將酵母重組的Pfs25蛋白突變體(Zou L 等，Vaccine. 2003Apr 2; 21 (15) : 1650-7.)和與 Montanide ISA 51 佐劑混合制作疫苗進行了 I期臨床試驗，該項目試驗的結果表明，pfs25蛋白質(zhì)在人體內(nèi)能夠激發(fā)免疫應答，但是，血清抗體效價較低，維持時間短暫，參見PloS one. 2008; 3 (7) :e2636.的公開。
作為候選疫苗而言，pfs25蛋白質(zhì)的免疫原性較弱，有待于進一步增強。Feng Qian等通過把pfs25蛋白與綠膿桿菌外毒素A (ExoProtein A)偶聯(lián)，明顯提高了 pfs25蛋白的免疫原性，參見 Vaccine. 2007; 25 (20) :3923 - 3933 的公開。Joanna Kubler-Kielb 等以卵清蛋白(0VA)、環(huán)子孢子蛋白(CSP)及pfs25蛋白自身作為載體蛋白，得到系列pfs25蛋白和載體蛋白偶聯(lián)物，可以提升Pfs25蛋白的免疫原性并維持較長時間的免疫應答，具體參見 PNAS. 2007; 104(1) :293-298 的公開。上述研究工作，都采用化學試劑在蛋白質(zhì)水平進行偶聯(lián)，雖然pfs25的免疫原性得到了增強，但是其缺陷在于pfs25蛋白-載體偶聯(lián)物結構不確定、偶聯(lián)效率低、生產(chǎn)工藝復雜，從而增加了生產(chǎn)過程中質(zhì)控的難度。因此，本領域迫切需要研制新類型的Pfs25衍生抗原，用于防治瘧疾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種新的惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物，作為傳播阻斷疫苗的候選抗原，以解決Pfs25蛋白免疫原性弱的問題。本發(fā)明的第一方面，提供了一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物，具體而言，該衍生物是基因重組的Pfs25蛋白二聚體，具有如下結構pfs25-L-pfs25其中pfs25代表pfs25蛋白突變體，L代表連接臂(linker)。所述的pfs25蛋白突變體包括相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突變體，即去除了 Pfs25天然序列N端22個氨基酸的信號肽序列和C端的24個氨基酸的膜結合區(qū)域，和/或?qū)ο喈斢谔烊恍蛄械?12、165、187位的天冬酰胺進行點突變。在一個優(yōu)選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為丙氨酸。在一個優(yōu)選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺。在一個優(yōu)選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酸。所述的連接臂由甘氨酸、絲氨酸組成，具有如下結構Sa_(GbS)。，其中S代表絲氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4，c=l-4的整數(shù)。在一個優(yōu)選的方案中，連接臂具有SGGGGS的結構。在一個優(yōu)選的方案中，連接臂具有(GGGGS)3的結構。在一個優(yōu)選的方案中，連接臂具有(GGGS)4的結構在更優(yōu)選的方案中，惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 5所示的氨基酸序列。在在更優(yōu)選的方案中，惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 7所示的氨基酸序列。本發(fā)明的第二方面，提供了惡性瘧原蟲Pfs25蛋白二聚體衍生物的用途，用于制備預防惡性瘧的傳播阻斷疫苗。本發(fā)明的(pfs25)2蛋白衍生物，分子結構上是由多肽連接臂連接的兩個pfs25蛋白亞基形成二聚體，多肽連接臂對兩個Pfs25蛋白亞基的生物活性沒有影響，保持了 pfs25蛋白自身的性質(zhì)。本研究的數(shù)據(jù)顯示，(pfs25) 2蛋白可以和抗pfs25的標準單抗4B7特異反應，這反映了(pf s25) 2分子保留了 pf s25蛋白的免疫反應性；(pf s25) 2分子接種小鼠后，能夠激發(fā)比Pfs25蛋白單體更高的免疫應答，證明了(pfs25)2分子具備更強的免疫原性。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明表達了(pfs25-3E)2 二聚體，該二聚體能夠與抗pfs25標準單抗4B7特異反應，說明該衍生物保持了 pfs25蛋白質(zhì)的免疫原性。在小鼠體內(nèi)試驗中，該二聚體激發(fā)的抗體水平，與二聚體的免疫劑量成正相關。在與pfs25-3E單體的對比試驗中，在相同劑量下，二聚體激發(fā)的抗體水平比單體提高了 10倍以上。
本發(fā)明的(pfs25)2蛋白衍生物，利用基因重組手段，在宿主體內(nèi)直接表達成為Pfs25的二聚體蛋白，通過純化操作可以獲得純度很高的(pfs25)2 二聚體蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)工藝簡單、可控性高、疫苗成分均一。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，(pfs25-3E)2 二聚體在酵母表達系統(tǒng)中高表達，其表達產(chǎn)物占酵母發(fā)酵上清中總蛋白含量的65%以上，通過離子交換層析、凝膠過濾層析兩步純化，即可得到純度達95%以上的目標蛋白，適合大規(guī)模生產(chǎn)。相對而言，已有技術中采用的體外化學偶聯(lián)方法，雖然增大了免疫原的分子量，提高了免疫原性，但由于偶聯(lián)反應的隨機性和不可控性，使得產(chǎn)物不均一。以Pfs25蛋白自身偶聯(lián)為例，最終可以獲得Pfs25 二聚體、pfs25三聚體、pfs25四聚體甚至到十聚體。僅就偶聯(lián)得到的二聚體而言，由于發(fā)生偶聯(lián)的部位不同，事實上包括了各種不同構象的異構體。這種偶聯(lián)產(chǎn)物的復雜性，造成產(chǎn)品質(zhì)控的不確定性。此外，由于偶聯(lián)工藝的復雜性和偶聯(lián)反應的不充分，造成偶聯(lián)反應不易控制、生產(chǎn)成本高，不利于產(chǎn)業(yè)化放大。總體而言，本發(fā)明(pfs25)2蛋白衍生物免疫原性強，產(chǎn)品結構均一，生產(chǎn)工藝簡單可控，有望成為針對惡性瘧疾的傳播阻斷型疫苗的候選抗原。


圖I:重組表達質(zhì)粒pf s25_3E/pGAPZ a A酶切鑒定泳道1:DL2000 DNA marker, 2000，1000，750，500，250，100泳道2: Xho I 和 Xba I 雙切 pf s25_3E/pGAPZ a A 重組質(zhì)粒圖2:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS11572 小時表達上清 SDS-PAGE 分析泳道I:protein marker(kd) :96, 67, 43, 31, 21, 14泳道2: pfs25標準蛋白泳道3-8:pfs25/pGAPZ a A/GS115陽性克隆表達產(chǎn)物泳道9: pGAPZ a A/GS115酵母菌(陰性對照)圖3: pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115 重組菌表達產(chǎn)物 Western-blot 鑒定泳道l:pGAPZa A/GS115 Pcihia pastoris (陰性對照)泳道2:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重組菌 24 小時表達泳道3:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重組菌 48 小時表達
泳道4:pfs25/pGAPZ a A/GS115 重組菌 72 小時表達泳道5: pfs25標準蛋白圖4:pfs25_3Q/pGAPZ a A/GS115 重組菌表達分析泳道I :pfs25標準品；泳道2-10 Q2-Q10克隆重組菌表達產(chǎn)物圖5:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115重組菌表達上清離子交換層析 泳道I: I. OM NaCl 洗脫峰；泳道2:0. 3Μ NaCl 洗脫峰泳道3:流穿峰； 泳道4:柱前樣圖6:pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115重組菌表達上清凝膠過濾層析泳道1-6:分部收集的第I至6管管樣品圖I:重疊 PCR 獲得(pf S25-3E) 2 基因泳道I:DNA Marker DL2000 ；泳道2:引物a與引物b的PCR結果泳道3:引物c與引物d的PCR結果；泳道4:弓丨物a與引物d的PCR結果圖8:重組表達質(zhì)粒(pf s25-3E) 2/pPICZ a A酶切鑒定泳道I:DNA Marker DL2000 ；泳道2:弓丨物a與引物d的PCR結果泳道3: Xba I 和 Xho I 雙酶切(pfs25_3E) 2/pPICZ a A泳道4: Xba I 單酶切(pf s25_3E) 2/pPICZ a A泳道5:DNA Marker D507A: 11849，10085，8023，6133，5026，3997，3049，2087圖9: SDS-PAGE 分析(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重組酵母菌 72 小時表達上清泳道1、2:兩個不同的(pfs25_3E)2/pPICZa A/GS115重組菌克隆；泳道3:pPICZaA/GS115 ;泳道4:標準蛋白質(zhì)分子量(Kd)圖10: Western-blot 鑒定(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重組酵母菌表達上清泳道l:pPICZa A/GS115酵母菌表達上清泳道2: (pfs25_3E)2/pPICZa A/GS115重組酵母菌72小時表達上清圖11:離子交換層析純化(pfs25_3E) 2/pPICZ a A/GS115重組菌表達上清泳道l:pPICZa A/GS115酵母菌表達上清；泳道2:標準蛋白質(zhì)分子量(Kd) :96, 67，45，30，20，14泳道3: (pfs25_3E)2/pPICZaA/GS115重組酵母菌表達上清泳道4:0. lmol/L NaCl 洗脫峰；泳道5:0. 3mol/L NaCl 洗脫峰泳道6:1. OmoI/L NaCl 洗脫峰圖12:凝膠過濾層析純化(pf S25-3E) 2蛋白泳道I:標準蛋白質(zhì)分子量(Kd)；泳道2: (pfs25-3E) 2 蛋白質(zhì)
具體實施例方式傳播阻斷型惡性瘧疾疫苗針對瘧原蟲有性階段的配子期和無性階段的細胞前期及紅細胞內(nèi)期的不同抗原，痕疾疫苗分三大類肝內(nèi)期疫苗、紅內(nèi)期疫苗以及傳播阻斷型疫苗(transmissionblocking vaccines, TBVs)。傳播阻斷型疫苗是以蚊階段痕原蟲特異表達的蟲體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體。蚊吸入被免疫的人血后，蚊中腸內(nèi)發(fā)育的瘧原蟲與人的抗體產(chǎn)生抗原抗體反應，從而導致蚊體內(nèi)瘧原蟲有性生殖及孢子增殖受到阻斷。目前研究較多的傳播阻斷疫苗候選抗原有惡性瘧原蟲相關蛋白Pfs25、Pfs28、Pfs48/45 和 Pfs230,間日瘧相關蛋白 Pvs25、Pvs28、Pvs48 等。雖然傳播阻斷型疫苗不能預防免疫個體感染瘧疾，亦不能減輕瘧疾癥狀，但能阻 斷按蚊將瘧原蟲從一個宿主傳播至另一個宿主。當這種疫苗與瘧疾保護性疫苗或抗瘧藥聯(lián)合應用時，TBVs可阻斷那些對藥物產(chǎn)生抗性而幸存下來的瘧原蟲的傳播。TBVs的另一個用途是對旅游者進行免疫，以防止他們將瘧原蟲帶入非流行區(qū)，造成流行。由于肝內(nèi)期疫苗、紅內(nèi)期疫苗候選抗原分子暴露于人體免疫系統(tǒng)，受到人體免疫壓力等因素的影響，候選抗原存在廣泛的基因多態(tài)性。TBVs候選抗原主要表達于蚊蟲階段瘧原蟲表面，此類抗原并不在脊椎動物免疫系統(tǒng)選擇壓力之下，所以這些蛋白顯示出非常低的多態(tài)水平，不會出現(xiàn)抗原變異，有利于疫苗免疫效果，被認為可以有效地阻斷瘧疾從蚊媒向人的傳播，是當前瘧疾疫苗研究的熱點之一。天然Pf s25抗原及其突變體Pfs25 (Plasmodium falciparum s25)是惡性痕原蟲合子或動合子主要表面蛋白，是介導動合子穿越圍食膜和對蚊中腸壁基底膜侵入的關鍵性蛋白。天然的pfs25蛋白質(zhì)，存在于惡性瘧原蟲子孢子囊膜表面，由217個氨基酸組成，分子量25Kd，富含半胱氨酸。在結構上，Pfs25天然蛋白的N端22個氨基酸是信號肽序列，C端的24個氨基酸是膜結合區(qū)域，該蛋白存在四個“EGF樣的結構域”，23個半胱氨酸形成了九對二硫鍵。Pfs25是糖蛋白，一共有四個糖基化位點，其中，112、165、187和202位的天冬酰胺(Asn，N)上形成了 N型糖鏈，196位的絲氨酸(Ser, S)上形成了糖基化磷脂酰肌醇錨定的糖鏈(GPI_anchor)。具體參見 Kaslow DC 等在 Nature. 1988 May 5; 333 (6168) :74-6.的公開。Pfs25蛋白采用酵母表達，常常出現(xiàn)過度的糖基化修飾以及表達產(chǎn)物的不均一的問題。在已有的研究中，Kaslow DC設計了一種非糖基化突變體pfs25-B，該突變體相當于pfs25天然序列的第22-188位氨基酸，并將112、165、187三個位點的天冬酰胺突變?yōu)楸彼?Ala，A)，使其喪失糖基化功能。pfs25-B在酵母表達，得到較均一的表達產(chǎn)物，參見Nature. 1988 May 5; 333 (6168) :74-6.以及US5217898。用該突變體制備的單抗4B7,目前已經(jīng)成為pfs25蛋白的標準化單抗供全球研究人員使用，參見The Journalof experimental medicine. 1991 Novl; 174(5) : 1203-8。2003 年，Zou L 設計了另一種非糖基化突變體，該突變體相當于Pfs25天然序列的第23-193位氨基酸，并將112、165、187三個位點的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０?Gln，Q)。該突變體在釀酒酵母和畢赤酵母中成功表達，美國NIH基于該突變體進行了 I期臨床研究，結果參見Zou L等在Vaccine. 2003Apr2; 21 (15) :1650-7.的公開以及 Wu Y 等在 PloS one. 2008; 3 (7) :e2636.的公開。
本發(fā)明人在前期工作中，設計了另一種非糖基化突變體，相當于pfs25天然序列的第23-193位氨基酸，并將112、165、187三個位點的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼?Glu，E)，在畢赤酵母中成功表達，得到的Pfs25蛋白突變體能夠和4B7特異性反應，且在接種小鼠后可以激發(fā)免疫應答。上述突變體均為本發(fā)明所用，分別簡稱為pfs25_3A突變體、pfs25_3Q突變體和pfs25-3E突變體。 化學交聯(lián)方法獲得的Pfs25蛋白衍生物pfs25蛋白質(zhì)在人體內(nèi)能夠激發(fā)免疫應答，但是，血清抗體效價較低，維持時間短暫。作為候選疫苗而言，Pfs25蛋白質(zhì)的免疫原性較弱，有待于進一步的增強。Feng Qian等將pfs25蛋白與重組綠膿桿菌外毒素A (rEPA)在體外進行化學交聯(lián)，得到的交聯(lián)物pfs25-rEPA的免疫原性明顯高于pfs25蛋白本身，具體參見Vaccine. 2007; 25 (20) : 3923 - 3933。Joanna Kubler-Kielb 等研究了一 系列的 pfs25 蛋白交聯(lián)物，包括Pfs25與自身交聯(lián)、pfs25與卵清蛋白(OVA)交聯(lián)、pfs25與重組綠膿桿菌外毒素A (rEPA)交聯(lián)，可以采用不同的連接集團，使得pfs25與載體蛋白或自身之間以酰胺鍵、腙鍵、硫醚鍵等不同方式連接，得到多種連接產(chǎn)物。交聯(lián)物對NIH小鼠進行2-3次注射免疫，末次免疫后3月、7月的抗體水平高于末次免疫后一周的抗體水平，具體參見PNAS. 2007;104(1):293 - 298?；蛑亟M方法獲得的Pfs25蛋白衍生物運用DNA重組技術，可將具有不同功能的蛋白結構域片段重組成為融合蛋白，例如，將具有不同抗原結合特性的抗體可變區(qū)序列進行重組得到雙特異性抗體，以及將某些受體的胞外可溶性片段與抗體Fe片段融合得到新的融合蛋白等等。具有不同功能的蛋白結構域片段之間進行重組操作時，通常需要在兩個功能片段之間增加一個連接臂(linker), 一般情況下該連接臂對于兩個被連接的蛋白功能片段僅僅起到物理連接的作用，而不賦予融合蛋白新的功能，也不影響兩個被連接蛋白片段的功能。連接臂的設計，多選擇分子量小、性質(zhì)不活潑的甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)和絲氨酸(Ser, S)構成linker,例如,悅劍鋒等在設計“抗-GD2/抗-⑶16”雙特異性單鏈抗體時，采用“SGGGGS”作為linker (《生物醫(yī)學工程學雜志》，2007; 24 (3) :659-663. )；TrinhR等在構建抗HER2/neu單鏈抗體時，在VH和VL之間采用了(GGGGS) 3作為linker (MolImmunol. 2004 Jan; 40 (10) :717-22. ) ；Xi Y等在構建人白細胞抗原B7_2胞外區(qū)和假單胞菌外毒素A突變體(PE40KDEL)融合蛋白時，選用(GGGGS)4作為linker (J Immunother. 2006Nov-Dec; 29 (6) : 586-95.);在極個別情況下，也有研究人員使用天冬酰胺(Asn，N)、脯氨酸(Pro, P)、賴氨酸(Lys, K)和繳氨酸(Val, V)等其他氨基酸構成連接臂(linker)的。例如，Lu P等在設計β -葡聚糖酶和木聚糖酶融合蛋白時，采用了(GGGGS) η (η < 3)、(EAAAK)η (η ^ 3)兩種類型的 linker (Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Jun; 79 (4) : 579-87.)；Xu J等構建AnsB-C與GnRH3-hinge-MVP雜合多肽的融合蛋白，兩者之間插入Asp-Pro酸不穩(wěn)定的二肽linker。在以上研究中，甘氨酸和絲氨酸構成的linker形成一段柔性的多肽鏈，沒有固定的空間結構；而包含谷氨酸、丙氨酸、賴氨酸的linker如(EAAAK) η (η ( 3)則形成相對剛性的α螺旋二級結構；包含脯氨酸的linker，具有強烈的中斷多肽二級結構的作用，用于分隔緊密相鄰的多肽。后兩種linker可能賦予融合蛋白新的功能或者影響兩個pfs25亞基的功能。本發(fā)明旨在將兩個pfs25串聯(lián)成為二聚體，以期增加pfs25的免疫原性。本發(fā)明的連接臂僅僅起到物理連接作用，并不賦予融合蛋白新的功能，也不影響兩個Pfs25亞基的功能。因此，甘氨酸、絲氨酸構成的，可形成柔性結構的linker適應于本發(fā)明。甘氨酸和絲氨酸的不同組合及l(fā)inker長度不是固定的，只要滿足本發(fā)明目的即可。酵母表達質(zhì)粒pPICZ a A、pGAPZ α A、抗生素Zeocin和菌株GSl 15均購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I、BstX I和T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購自Roche公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；標準蛋白質(zhì)分子量購自GE公司。抗pfs25單克隆抗體 4B7 和 pfs25 標準蛋白由美國 MR4 (Malaria Research and Reference ReagentResource Center, NIH)提供；HRP標記兔抗鼠IgG購自Sigma公司；其他試劑為進口或國產(chǎn)·分析純。實施例I、Pfs25蛋白突變體基因的合成與酵母表達載體構建( I)突變體基因設計與合成根據(jù)GenBank中公布的pfs25基因信息(GenBank locus X07802),其編碼的天然Pfs25蛋白第23位至第193位氨基酸序列如下KVTVDTVCKRGFLIQMSGHLECKCENDLVLVNEETCEEKVLKCDEKTVNKPCGDFSKCIKIDGNPVSYACKCNLGYDMVNNVCIPNECK g VTCGNGKCILDTSNPVKTGVCSCNIGKVPNVQDQNKCSKDGETKCSLKCLKE g ETCKAVDGIYKCDCKDGFIID 畫 ESSICT其中相當于天然pfs25蛋白第112，165，187位為天冬酰胺(N)，是pfs25蛋白的糖基化位點。本發(fā)明設計的pfs25蛋白非糖基化突變體，簡稱為pfs25_3E，該突變體相當于天然Pfs25蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112，165，187的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼?，具體見序列表SEQ. NO. I。按照畢赤酵母喜好密碼子設計編碼本發(fā)明突變體(SEQ. NO. I)的核苷酸序列，見序列表SEQ. NO. 2。按照Zou L 等在 Vaccine. 2003Apr 2; 21 (15) :1650-7.公開的 pfs25 蛋白突變體序列，簡稱為pfs25-3Q，具體見序列表SEQ. NO. 3。本發(fā)明設計了符合畢赤酵母喜好密碼子的核苷酸序列，見序列表SEQ. NO. 4。上述SEQ. NO. 2、SEQ. NO. 4核苷酸序列委托上海生工生物工程有限公司合成，上海生工生物工程有限公司合成的SEQ. NO. 2、SEQ. NO. 4核苷酸序列分別克隆到pUC57載體，稱為pfS25-3E/pUC57、pfS25-3Q/pUC57，測序正確；合成引物以凍干形式提供。(2)酵母表達載體構建包含目的基因的克隆載體pfs25_3E/pUC57和包含三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子的酵母表達載體pGAPZ α Α,分別用限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I進行雙酶切操作。利用T4DNA連接酶將目的基因亞克隆到pGAPZ a A得到重組質(zhì)粒pfs25_3E/pGAPZ α Α,轉(zhuǎn)化E. coli ToplOF’，提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定陽性克隆，pfs25-3E/pGAPZa A質(zhì)粒的Xho I和Xba I雙酶切電泳見圖I。采用相同方法，將pfs25_3Q基因克隆到包含三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子的酵母表達載體pGAPZ a A上，得到重組質(zhì)粒pfs25_3Q/pGAPZ a A0上述兩種表達載體Pfs25_3E/pGAPZ a A、pfs25_3Q/pGAPZ a A經(jīng)測序鑒定，結果正確。Pfs25-3E 突變體 DNA 序列見 SEQ. NO. 2，pfs25_3Q 突變體 DNA 序列見 SEQ. NO. 4。實施例2、Pfs25-3E突變體的表達及表達產(chǎn)物的鑒定陽性重組表達質(zhì)粒Pfs25_3E/pGAPZ a A經(jīng)BstX I酶切線化后，電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115 ;以空白質(zhì)粒pGAPZ a A轉(zhuǎn)染酵母菌，制備陰性對照菌株。電轉(zhuǎn)條件
I.5kV，250yF，200Q。電擊結束后，立即加入800 μ I IM山梨醇，混勻，30°C放置2小時，取
適量轉(zhuǎn)化物涂布于含有100 μ g/ml Zeocin的YPD固體篩選培養(yǎng)基上，30°C濕盒靜置，3-5天后可見單克隆菌落出現(xiàn)。挑取陽性克隆，即為酵母重組菌Pfs25-3E/pGAPZaA/GS 115。挑取Pfs25-3E/pGAPZ a A/GS115陽性克隆轉(zhuǎn)接到3mlYPD液體培養(yǎng)基的20ml三角瓶中，30°C>250r/min搖床培養(yǎng)、表達，每隔24h取樣，8000r/min離心3min，取上清_20°C保存。陰性對照菌株pGAPZ aA/GSl 15同步培養(yǎng)并留樣。將所有重組菌及陰性菌不同時間的表達上清留樣進行電泳操作，分離膠的濃度為10%，濃縮膠的濃度為5%，采用考馬斯亮藍作為蛋白染色劑。以pfs25標準品作為陽性對照，陰性菌表達上清作為陰性對照，pfs25-3E/pGAPZ a A/GS 115重組酵母菌培養(yǎng)72小時的表達上清電泳結果見圖2。所有重組菌在21kd的位置有目的蛋白條帶，這說明pfs25蛋白質(zhì)被重組酵母菌分泌表達到培養(yǎng)基中。將pfs25-3E/pGAPZ aA/GSl 15 培養(yǎng) 24、48、72 小時的表達上清進行 SDS-PAGE，以pfs25標準蛋白、pGAPZ a A/GS115陰性菌表達上清作對照。SDS-PAGE電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，逐次與4B7單克隆抗體和HRP標記兔抗鼠IgG反應，化學發(fā)光法顯色觀察結果。結果見圖3，可見不同培養(yǎng)時間的表達產(chǎn)物與pfs25標準蛋白有相同的特異性反應，隨著培養(yǎng)時間延長，表達量增加。實施例3、Pfs25-3Q突變體的表達采用實施例2的轉(zhuǎn)化方法制備pfs25_3Q/pGAPZaA/GS115重組菌，共挑選9個克隆，分別表示為克隆Q2-10。挑取Q2-10陽性酵母重組菌轉(zhuǎn)接到3mlYPD液體培養(yǎng)基的20ml三角瓶中，30°C、250r/min搖床培養(yǎng)、表達，72小時取樣，8000r/min離心3min，取上清進行SDS-PAGE檢測。所有重組菌在標準蛋白的相應位置有目的蛋白條帶，但表達量較低，具體結果見圖4。實施例4、發(fā)酵罐表達的重組pfs25_3E蛋白純化采用10升發(fā)酵罐對Pfs25_3E/pGAPZ a A/GS115重組菌進行發(fā)酵培養(yǎng)。挑選單克隆菌落在IOOmLYPD中進行培養(yǎng)，29. 0°C，pH6. (Γ4. 0,250rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)18小時后，鏡檢合格的種子接種到發(fā)酵罐中，以1:15的比例接種。發(fā)酵參數(shù)為29.0°C，ρΗ6·(Γ4·0，溶氧>20%，轉(zhuǎn)速約 350rpm，通氣速度 350L/h，Antifoam 204作為消泡劑(SIGMA)。發(fā)酵表達時，發(fā)酵罐自動補加50% (V/V)的葡萄糖，使發(fā)酵液中的葡萄糖終濃度維持在O. 5-lg/L，表達24小時后，以4000rpm、15min離心，收集上清作為表達產(chǎn)物。收集表達上清6. 5升，用O. 45um的中空纖維超濾膜進行初步過濾后，用5kD的超濾膜濃縮，得到濾過液200毫升。濾過液上樣離子交換層析，層析介質(zhì)為SP Sepharose BigBeadsCGE healthcare),以NaCl溶液梯度洗脫，先用O. 3M NaCl進行洗脫，收集洗脫液；再用I. OM NaCl進行洗脫，收集洗脫液；取部分洗脫液電泳檢查，可見I. OM NaCl洗脫峰為目標蛋白，純度達到95%以上；0. 3M NaCl洗脫峰則含有較多雜蛋白，具體見圖5。將O. 3M NaCl洗脫液進行第二步凝膠過濾層析,介質(zhì)為superdex 200,洗脫液為O. lmol/L的NaCl，分部收集洗脫液；取凝膠過濾洗脫液電泳檢查，可見在第4_6管為目標蛋白，純度達到95%以上；第1-3管為雜蛋白，具體見圖6。將I. OM NaCl進行離子交換層析洗脫液與凝膠過濾層析4_6管的洗脫液合并，常規(guī)方法透析、凍干，得到280mg的pfs25純品蛋白。實施例5、采用(GGGGS)3十五肽連接臂的pfs25 二聚體基因的合成和表達載體的構建 (I)、(pfs25_3E)2 二聚體基因的構建以pfs25_3E/pUC57載體質(zhì)粒為模板進行重疊PCR (overlapping PCR)操作,兩個拷貝的Pfs25基因通過(GGGGS)3的十五肽“連接臂(linker)串聯(lián)成為二聚體基因，連接臂的G代表甘氨酸，S代表絲氨酸。利用引物設計軟件Primer premier5. O設計四條引物,委托上海生工生物工程有限公司合成。引物a:GGACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGAAAGTAACAGTCGATACT (下劃線為 Xho I 識別位點)；引物b:AGATCCACCGCCTCCGGAACCACCACCCCCAGAACCGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATGATAAATC ；引物c:GGAGGTGGCGGTTCTGGGGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTAAAGTAACAGTCGATACTGTGTGTAAGAGAGGCTT ；引物d GGTCTGATTAAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATG (下劃線為 Xha I 識別位點)目的基因的重疊PCR分四步進行第一次PCR :用“引物a”和“引物b”，模板是pfs25_3E/pUC57載體質(zhì)粒；第二次PCR :用“引物c”和“引物d”，模板是pfs25-3E/pUC57載體質(zhì)粒；第三次PCR :不添加引物，將第一次PCR和第二次PCR的產(chǎn)物混合，10個循環(huán)；第四次PCR :用“引物a ”和“引物d ”，模板是第三次PCR產(chǎn)物。PCR 反應條件95°C、4min ;95°C、60 秒，55°C、60 秒，72°C、70 秒，30 個循環(huán)；72°C、7min。通過四次PCR操作獲得的雙拷貝pfs25_3E基因，簡稱為pfs(25_3E)2，電泳結果見圖7。將overlapping PCR產(chǎn)物純化后，按照試劑盒說明書與pMD18_T Simple Vector進行連接反應。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10F’感受態(tài)細菌，涂布Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，對所獲得的克隆進行PCR、Xho I和Xba I雙酶切鑒定及測序分析，結果均為陽性的克隆就是(pfs25-3E) 2/pMD18-T 重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I分別對pf s (25-3E) 2/pMD18_T質(zhì)粒和pPICZ a A載體質(zhì)粒進行雙酶切操作，利用T4DNA連接酶將(pfs25-3E) 2基因與pPICZ a A載體片段連接，過夜，得到的(pf s25-3E) 2/pPICZ a A重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T0P10F’感受態(tài)細菌，涂布zeocin抗性選擇的LB固體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，PCR、酶切和測序鑒定陽性克隆。重組表達質(zhì)粒(pfs25-3E)2/pPICZαA經(jīng)引物a和引物d進行PCR、Xho I和Xba I雙酶切，電泳后，在IOOObp的位置有目的基因條帶，結果見圖8。(pfs25-3E)2DNA測序結果見SEQ. NO. 6，推測的蛋白質(zhì)序列見SEQ. NO. 5。(2)、Pfs25_3Q 二聚體基因的構建以Pfs25_3Q/pUC57 質(zhì)粒為模板，重疊 PCR(overlapping PCR)構建 &€825_30)2基因。四條重疊PCR引物，其中引物a和引物c與Pfs25-3E相同，引物b和引物d與Pfs25-3E不同，具體為引物b: AGATCCACCGCCTCCGGAACCACCACCCCCAGAACCGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTGGTCGATGATAAATC ；引物d GGTCTAGATTAAGTACATATTGATGATTCCTGGTCGATG引物b和引物d中下劃線標示的三聯(lián)體密碼，與Pfs25_3E的引物不同，具體對應于Pfs25-3Q蛋白突變體187位的谷氨酰胺。參照(pfs25-3E)2:聚體基因的構建和克隆步驟，得到(pfs25_3Q) 2/pMD18_T質(zhì)粒和(pfs25-3Q)2/pPICZ a A重組表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定結果正確。(pfs25_3Q) 2DNA測序結果見序列表SEQ. NO. 8，推測的蛋白質(zhì)序列見SEQ. NO. 7。實施例6、采用(GGGS) 4十六肽連接臂的pfs25 二聚體基因的合成和表達載體的構建以pfs25_3E/pUC57載體質(zhì)粒為模板進行重疊PCR (overlapping PCR)操作，兩個拷貝的Pfs25基因通過(GGGS) 4的十六肽“連接臂(linker)串聯(lián)成為二聚體基因，連接臂的G代表甘氨酸，S代表絲氨酸。利用引物設計軟件Primer premier5. O設計四條引物,委托上海生工生物工程有限公司合成。引物a:GGACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGAAAGTAACAGTCGATACT (下劃線為 xho I 識別位點)引物b:AGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGAGCCACCTCCAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATGATAAATC引物c:GGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGCTCTAAAGTAACAGTCGATACTGTGTGTAAGAGAGGCTT引物d:GGTCTAGATTAAGTACATATTGATGATTCCTCGTCGATG (下劃線為 xba I 識別位點)參照實施例5的克隆操作步驟，構建了包含(GGGS) 4作為linker的pfs25_3E 二聚體的重組表達質(zhì)粒(pfs25-3E) ’ 2/pPICZ α Α,經(jīng)測序鑒定結果正確，(pfs25_3E) ’ 2的DNA測序結果見SEQ. NO. 10，推測的蛋白質(zhì)序列見SEQ. NO. 9。實施例7、重組酵母菌(pfs25-3E)2/pPICZ aA/GSl 15的構建及鑒定陽性重組表達質(zhì)粒(pfs25_3E)2/pPICZ a A經(jīng)BstX I酶切線化后，電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115。電擊結束后，立即加入800 μ I IM山梨醇，混勻，30°C放置2小時，取適量轉(zhuǎn)化物涂布于含有100 μ g/ml Zeocin的YPD固體篩選培養(yǎng)基上，30°C濕盒靜置，3-5天后可見單克隆菌落出現(xiàn)。隨機挑取若干菌落接種于3πι1ΥΗ)培養(yǎng)基中，30°C生長過夜，收集菌體，用引物a、引物d進行PCR鑒定，陽性酵母重組菌為(pfs25-3E)2/pPICZ a A/GS115。挑取(pfS25-3E)2/pPICZαA/GS115重組酵母菌菌落，于2mlYB)培養(yǎng)液中，30°C，250r/min培養(yǎng)過夜，次日離心收集菌體，轉(zhuǎn)接于3ml YI3D培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h補加 甲醇至終濃度為2%，并留樣。培養(yǎng)及誘導表達至72h，收集上清。pPICZ aA/GSl 15菌作為陰性對照同步誘導表達。將所有重組菌及陰性菌不同時間的表達上清留樣進行電泳操作，分離膠的濃度為10%，濃縮膠的濃度為5%，采用考馬斯亮藍作為蛋白染色劑，結果見圖9。結果顯示在45kd的位置有目的蛋白質(zhì)，這說明(pfs25-3E)2蛋白質(zhì)被重組酵母菌分泌表達到培養(yǎng)基中。利用專業(yè)的凝膠電泳條帶分析軟件ImageQuant TL (GE Healthcare公司)對圖9的結果中(pfs25-3E)2蛋白的含量進行了分析，結果見表I。可以看到(pfs25-3E)2蛋白(條帶4)占重組酵母表達上清總蛋白的68%，該表達量完全可以用于未來的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。表I : ImageQuant TL 軟件分析(pf s25_3E) 2/pPICZ a A/GS115 重組酵母菌表達上
清
權利要求
1.一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白的二聚體衍生物，具有如下結構pfs25_L_pfs25 其中pfs25代表pfs25蛋白突變體，L代表連接臂(linker)； 所述的pfs25蛋白突變體包括相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突變體； 所述的連接臂具有如下結構Sa_(GbS)。，其中S代表絲氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4, c=l-4的整數(shù)。
2.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突變體相當于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換為丙氨酸。
3.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突變體相當于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺。
4.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突變體相當于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酸。
5.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的連接臂具有SGGGGS的結構。
6.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的連接臂具有(GGGGS)3的結構。
7.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的連接臂具有(GGGS)4的結構。
8.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，Pfs25蛋白的二聚體衍生物具有序列表Seq. No. 5所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，Pfs25蛋白的二聚體衍生物具有序列表Seq. No. 7所示的氨基酸序列。
10.根據(jù)權利要求1-9的任一項所述的Pfs25蛋白的二聚體衍生物的用途，用于制備預防惡性瘧疾的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于傳染病防治領域，具體涉及用于阻斷惡性瘧疾傳播的疫苗的候選靶抗原。本發(fā)明采用基因重組手段，構建成惡性瘧原蟲pfs25蛋白二聚體衍生物，該二聚體衍生物包括被連接臂連接的兩個pfs25蛋白質(zhì)單元。獲得的二聚體衍生物增強了pfs25蛋白的免疫原性，在動物體內(nèi)能夠激發(fā)更高的抗體應答。該二聚體可被重組酵母細胞高表達產(chǎn)生，并分泌到培養(yǎng)基中。經(jīng)純化，得到成分均一的表達產(chǎn)物，適合大規(guī)模生產(chǎn)。該惡性瘧原蟲pfs25蛋白二聚體衍生物有望成為惡性瘧傳播阻斷型疫苗的候選抗原。
文檔編號A61P33/06GK102838668SQ20121033867
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權日2012年9月13日
發(fā)明者陳勇, 蔣琳, 高雪峰, 雷清, 楊軍, 李剛 申請人:蘭州生物制品研究所有限責任公司