專利名稱：一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法，本發(fā)明屬于組織工程和生物制造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨是一種特異化的結(jié)締組織，具有堅(jiān)韌、彈性好、摩擦系數(shù)小等生物物理特性，主要起到承受、傳導(dǎo)運(yùn)動載荷、吸收震蕩，并順利完成各種關(guān)節(jié)功能活動等的作用。外傷以及關(guān)節(jié)的炎癥容易導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺損，影響關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，從而引起骨性關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)退化病變的發(fā)生，這類病變不僅可以使人喪失工作能力，甚至已經(jīng)成為肢體殘障的主要原因之一。成人關(guān)節(jié)端骨軟骨復(fù)合組織自關(guān)節(jié)面向深度方向可以分為透明軟骨層、鈣化層和軟骨下骨，各層以特有的組成與結(jié)構(gòu)連接并發(fā)揮不同的組織功能。其中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的成分組成為70%水分，20%11型膠原，5%蛋白多糖，主要起到支撐細(xì)胞的作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常代謝、遷移、增殖和分化以及細(xì)胞間信息傳遞。英國艾克賽特大學(xué)的C. J. Moger等人(Moger C J, Arkill K P, Barrett R, etal. Cartilage Collagen Matrix Reorientation and Displacement in Response toSurface Loading. JOURNAL OF BIOMECHANICAL ENGINEERING-TRANSACTIONS OF THEASME, 2009，131 (0310083))根據(jù)真實(shí)軟骨的結(jié)構(gòu)建立了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，在軟骨表面5-10%厚度區(qū)域軟骨纖維平行于軟骨表面，為表層；表層以下10-20%的厚度區(qū)域?qū)儆谶^渡層，軟骨纖維呈隨機(jī)取向；過渡層以下軟骨纖維呈軟骨表面垂直的取向結(jié)構(gòu)，為輻射層；輻射層以下通過鈣化層與軟骨下骨連接，關(guān)節(jié)軟骨分層排列特點(diǎn)反映了關(guān)節(jié)軟骨生理功能相適應(yīng)的生物力學(xué)變化表層主要以剪力為主，移形層和輻射層則能夠承受壓力載荷，鈣化層將關(guān)節(jié)軟骨附著于軟骨下骨上并有效隔離軟骨組織和骨組織。軟骨下骨細(xì)胞主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)則主要由I型膠原纖維、無機(jī)成分等組成，其中膠原纖維約占骨重的1/3，無機(jī)成分主要存在形式是鈣磷鹽(羥基磷灰石(HA)又是其中最重要的鈣磷鹽)，約占骨重的2/3。性能上膠原纖維柔軟而有彈性，鈣磷鹽硬而脆，組合起來成為有足夠硬度和強(qiáng)度而又有足夠韌性的骨組織。正常關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，沒有直接的血液、淋巴液供應(yīng)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因此缺乏自身愈合能力。自體細(xì)胞/組織移植及人工關(guān)節(jié)等一直以來都是整形外科或生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域中用來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損最重要、最傳統(tǒng)的技術(shù)手段，這些方法確實(shí)緩解很多人的病情、延長了無數(shù)人的生命。但仍然存在很多諸如異體移植供體嚴(yán)重不足、免疫反應(yīng)及病原體轉(zhuǎn)移，人工關(guān)節(jié)功能單一等問題。組織工程被證明是一個理想的非傳統(tǒng)治療方法，其原理是在體外構(gòu)建與缺損形狀的一致的多孔支架接種上細(xì)胞并填補(bǔ)在缺損部位，試圖在支架降解過程中細(xì)胞沿支架貼附增殖分化長成缺損組織。國內(nèi)外近些年關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨組織工程展開了一系列研究，得到了一些重要的成果，但也存在以下問題
一、利用組織工程單純修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損時，移植體與移植床之間的愈合界面為軟骨-軟骨、軟骨-骨界面，這兩種界面的整合較慢，修復(fù)過程中新生組織在移植床表面不穩(wěn)定，容易導(dǎo)致修復(fù)失敗。二、目前組織工程修復(fù)過程中軟骨組織中透明軟骨比例較少，復(fù)合組織生理功能、機(jī)械性能等不能長期維持，軟骨支架選用的材料及構(gòu)建方法的不夠仿生很可能是導(dǎo)致現(xiàn)在組織工程修復(fù)過程中軟骨組織中透明軟骨比例較少，復(fù)合組織生理功能、機(jī)械性能等不能長期維持的原因。三、骨軟骨支架親水性和相容性不夠不理想，目前骨軟骨組織工程研究中提高支架親水性的方法主要是表面改性或者支架構(gòu)建過程中間歇添加高親水性材料，采用這些方法改性材料不易分布均勻、材料改性后不能維持完整孔隙結(jié)構(gòu)等。而足夠的親水性和相容性才能保證足夠密度的細(xì)胞黏附、分化和增殖，植入體內(nèi)后有利于體液中氧和營養(yǎng)物質(zhì)的滲入，并且較大的細(xì)胞密度能夠保證細(xì)胞間建立連接并準(zhǔn)確表達(dá)功能，從而保證骨軟骨的成功修復(fù)。
目前的研究大多傾向于關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨一體化修復(fù)，使得愈合界面由軟骨-骨界面變?yōu)楣?骨界面，從而加快界面的整合，并且臨床上軟骨缺損常伴有軟骨下骨的缺損，在修復(fù)軟骨缺損的時同時應(yīng)考慮軟骨下骨的修復(fù)，骨軟骨組織工程就成為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的重要策略。新加坡國立的Dietmar W.等人(Shao X X, Hutmacher D W，Ho S T, et al. Evaluation of a hybrid scaffold/cellconstruct in repair of high-load-bearing osteochondral defects in rabbits.BIOMATERIALS, 2006，27 (7) : 1071 1080)在2005構(gòu)建了醫(yī)學(xué)等級的聚己內(nèi)酯/纖維蛋白膠的骨軟骨一體化支架兩邊分別接種BMSCs后填充動物缺損直徑4mm深5mm，3個月樣品表現(xiàn)出較好的軟骨修復(fù)特性，力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明PCL是一個比較好的軟骨下骨支架材料，但纖維蛋白膠由于其較弱的力學(xué)性能不適合作為軟骨支架。這種方式的優(yōu)點(diǎn)在于一方面兼顧到了骨、軟骨不同材料、結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度的要求，同時使用BMSCs細(xì)胞也可以在修復(fù)初期能夠大量增殖分化產(chǎn)生足夠數(shù)量的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架及其制備方法，該方法基于仿生原理，充分模擬骨軟骨的天然材料及結(jié)構(gòu)，使其制備的骨軟骨復(fù)合支架既可提高支架細(xì)胞種植密度和深度，又可針對骨軟骨不同功能區(qū)域特征促進(jìn)骨、軟骨組織的同時再生，進(jìn)而提高骨軟骨缺損的修復(fù)效果。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于所述復(fù)合支架包括含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架和包芯結(jié)構(gòu)骨支架；所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架采用含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料，定向大孔之間存在相互貫通的小孔；所述的包芯結(jié)構(gòu)骨支架由連續(xù)擠出的材料單元交錯堆積而成，并形成梯度孔隙結(jié)構(gòu)，該梯度孔隙結(jié)構(gòu)包括材料單元交錯堆積形成的大孔，以及材料單元自身的微孔，其中材料單元由包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯和包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯組成，包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯采用人工合成高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物，包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯采用膠原；所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架和包芯結(jié)構(gòu)骨支架通過“溶解-粘接”的方法連接并形成連接層。上述技術(shù)方案中，所述的含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物。所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ;所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石。本發(fā)明所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架中的定向大孔截面直徑在20 μ m-200 μ m,定向度的OI值在O. 8至I之間；所述的材料單元交錯堆積形成的大孔直徑100 μ m-lmm,材料單元自身的微孔直徑20 μ m-200 μ m。所述的連接層具有均勻孔隙結(jié)構(gòu),孔隙率 60%-90%。本發(fā)明提供的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟I)將含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制備成質(zhì)量體積濃度為10 50mg/ml的均勻、無沉淀的混合溶液；所述的含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子`材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物；牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的質(zhì)量比是O. 5 5 :1 ;2)將裝有混合溶液的模具放置在低于0°C的具有一維溫度梯度的環(huán)境中，實(shí)現(xiàn)溶液的定向結(jié)晶，然后通過冷凍干燥形成含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架；經(jīng)交聯(lián)后，清洗凍干備用;3)將膠原溶解在醋酸溶液中形成膠原溶液，溶液的質(zhì)量體積濃度為2 20mg/ml ；將人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物溶解于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量體積濃度為50 500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ;所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石；混合物中高分子材料與鈣磷陶瓷的質(zhì)量比為I 10 1 ；4)使用含包芯噴頭的專用擠壓噴射裝置，使內(nèi)噴頭噴出人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合溶液，外噴頭噴出膠原溶液，形成膠原材料包裹人工合成的高分子生物材料的連續(xù)的材料單元，按照預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和路徑，采用基于快速成形的低溫沉積制造工藝連續(xù)擠出交錯堆積制備成含包芯結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)；并經(jīng)過冷凍干燥后形成包芯結(jié)構(gòu)骨支架；經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)后，冷凍干燥備用；5)在包芯結(jié)構(gòu)骨支架的表面，利用有機(jī)溶劑溶解表層形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層溶池處粘接，通過冷凍干燥，滅菌后，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的含有連接層的骨軟骨復(fù)合支架。在本發(fā)明提供的組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法中，所述的醋酸溶液的質(zhì)量體積百分濃度為O. 5%-3%，所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為1，4_ 二氧六環(huán)或氯仿。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果①在制備骨軟骨復(fù)合支架過程中兼顧到關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨自身物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在軟骨部分模擬軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料和結(jié)構(gòu)，利用軟骨基質(zhì)材料構(gòu)建與真實(shí)軟骨結(jié)構(gòu)類似的定向結(jié)構(gòu)支架，可以提高組織工程新生軟骨的透明軟骨比例；在骨部分，通過膠原包裹人工合成高分子材料與鈣磷陶瓷的混合物形成包芯結(jié)構(gòu)骨支架，可以有效提高支架親水性和膠原分布均勻性，進(jìn)而提高細(xì)胞種植密度和深度；②在軟骨支架和骨支架端分別接種足量密度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，在修復(fù)初期能夠發(fā)揮干細(xì)胞快速增殖和分化的能力，并利用骨軟骨不同的微環(huán)境，有利于干細(xì)胞向骨軟骨不同方向的分化，增強(qiáng)修復(fù)的效果。③該高度仿生的工藝通過溶解粘接法實(shí)現(xiàn)兩種不同材料、結(jié)構(gòu)的支架的穩(wěn)定、牢固粘接，進(jìn)而保證新生軟骨和軟骨下骨穩(wěn)定連接，可實(shí)現(xiàn)并有效加快骨-骨界面的愈合速度，從而實(shí)現(xiàn)骨軟骨的一體化修復(fù)。


圖I為本發(fā)明提供的“定向結(jié)構(gòu)軟骨-包芯結(jié)構(gòu)骨”結(jié)構(gòu)的組織工程骨軟骨復(fù)合支架結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明提供的“定向結(jié)構(gòu)軟骨-包芯結(jié)構(gòu)骨”結(jié)構(gòu)的組織工程骨軟骨復(fù)合支架簡圖。圖3為本發(fā)明的方法中使用的一種專用包芯噴頭結(jié)構(gòu)原理示意圖。 圖4為定向結(jié)構(gòu)軟骨支架的電鏡圖。圖5為定向結(jié)構(gòu)軟骨支架的截面電鏡圖。圖6為骨軟骨復(fù)合支架的電鏡圖。圖7包芯結(jié)構(gòu)骨支架的微孔結(jié)構(gòu)電鏡圖.其中1_定向結(jié)構(gòu)軟骨支架；2.-連接層；3_包芯結(jié)構(gòu)骨支架；4_包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯；5_包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯；6_材料單元交錯堆積形成的大孔；7_人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合溶液；8_膠原溶液。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。圖I和圖2為本發(fā)明提供的“定向結(jié)構(gòu)軟骨-包芯結(jié)構(gòu)骨”結(jié)構(gòu)的組織工程骨軟骨復(fù)合支架示意圖。該組織工程骨軟骨復(fù)合支架包括含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架I和包芯結(jié)構(gòu)骨支架3 ;所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架采用含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料，定向大孔之間存在相互貫通的小孔；所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架中的定向大孔截面直徑在20 μ m-200 μ m，定向度的OI值在O. 8至I之間；(參見圖4、圖5);含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物。所述的包芯結(jié)構(gòu)骨支架由連續(xù)擠出的材料單元交錯堆積而成，并形成梯度孔隙結(jié)構(gòu)，該梯度孔隙結(jié)構(gòu)包括材料單元交錯堆積形成的大孔6，以及材料單元自身的微孔，其中材料單元由包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯4和包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯5組成，包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯采用人工合成高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物7，包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯5采用膠原；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ;所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石。所述的材料單元交錯堆積形成的大孔6的直徑一般在100 μ m Imm,材料單元自身的微孔直徑20 μ m 200 μ m (參見圖7)。所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架和包芯結(jié)構(gòu)骨支架通過“溶解粘接”的方法連接并形成連接層2，連接層具有均勻孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率一般在60% 90%。本發(fā)明提供的指標(biāo)上述組織工程骨軟骨復(fù)合支架的方法，包括如下步驟
I)將含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制備成質(zhì)量體積濃度為10 50mg/ml,均勻、無沉淀的混合溶液；所述的含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物；牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的質(zhì)量比是O. 5 5 :1。2)將裝有混合溶液的模具放置在低于0°C的具有一維溫度梯度的環(huán)境中，實(shí)現(xiàn)溶液的定向結(jié)晶，然后通過冷凍干燥形成含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架；經(jīng)交聯(lián)后，清洗凍干備用;3)將膠原溶解在醋酸溶液中形成膠原溶液，溶液的質(zhì)量體積濃度為2 20mg/ml ；將人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物溶解于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量體積濃度為50 500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ；所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石；混合物中的高分子材料與鈣磷陶瓷的質(zhì)量比為I 10 :1 ;醋酸溶液質(zhì)量體積百分濃度為O. 5%-3% ;有機(jī)溶劑為1，4_ 二氧六環(huán)或氯仿；4)使用含包芯噴頭的專用擠壓噴射裝置，使內(nèi)噴頭噴出人工合成的高分子生物材 料與鈣磷陶瓷的混合溶液，外噴頭噴出膠原溶液，形成膠原材料包裹人工合成的高分子生物材料的連續(xù)的材料單元，按照預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和路徑，采用基于快速成形的低溫沉積制造工藝連續(xù)擠出交錯堆積制備成含包芯結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)；并經(jīng)過冷凍干燥后形成包芯結(jié)構(gòu)骨支架；經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)后，冷凍干燥備用；5)在包芯結(jié)構(gòu)骨支架的表面，利用有機(jī)溶劑溶解表層形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層溶池處粘接，通過冷凍干燥，滅菌后，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的含有連接層的骨軟骨復(fù)合支架。實(shí)施例I :組織工程骨軟骨支架的構(gòu)建提取牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料和殼聚糖溶于O. 5%的醋酸溶液中制備成質(zhì)量體積濃度為10mg/ml的軟骨基質(zhì)材料-殼聚糖混合溶液，溶液中軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖的質(zhì)量比為O. 5: I。將混合溶液裝入模具中并在_200°C的低溫環(huán)境中構(gòu)建10°C /mm的溫度梯度，混合溶液凝固后冷凍干燥24小時得到定向結(jié)構(gòu)軟骨支架，支架用京尼平溶液交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。將PLGA/磷酸三鈣按5 1的質(zhì)量比混合溶于1，4_ 二氧六環(huán)中形成濃度為500mg/ml的溶液，將I型膠原溶于O. 5%的醋酸溶液中形成濃度為2mg/ml的膠原溶液，基于無加熱、液化過程的擠壓、噴射成形工藝及設(shè)計的圖2所示的專用噴頭和基于快速成形的低溫沉積制造設(shè)備制作包芯結(jié)構(gòu)骨支架，用戊二醛交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。利用噴霧器噴灑I，4- 二氧六環(huán)溶解包芯結(jié)構(gòu)骨支架表層，形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層熔池處粘接。在_20°C低溫凝固后再次冷凍干燥，滅菌后，得到“定向軟骨支架包芯骨支架”的組織工程骨軟骨復(fù)合支架。實(shí)施例2 :組織工程骨軟骨支架的構(gòu)建提取牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料和殼聚糖溶于3%的醋酸溶液中制備成濃度為50mg/ml的軟骨基質(zhì)材料-殼聚糖混合溶液，溶液中軟骨基質(zhì)材料與海藻酸鈉的質(zhì)量比為
5=Io將混合溶液裝入模具中并在_80°C的低溫環(huán)境中構(gòu)建10°C /mm的溫度梯度，混合溶液凝固后冷凍干燥24小時得到定向結(jié)構(gòu)軟骨支架，支架用多聚磷酸鈉溶液交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。將PLGA/磷酸三鈣按10 1的質(zhì)量比混合溶于氯仿中形成濃度為50mg/ml的溶液，將I型膠原溶于O. 5%的醋酸溶液中形成濃度為20mg/ml的膠原溶液，基于無加熱、液化過程的擠壓、噴射成形工藝及設(shè)計的圖2所示的專用噴頭和基于快速成形的低溫沉積制造設(shè)備制作包芯結(jié)構(gòu)骨支架，用戊二醛交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。利用噴霧器噴灑氯仿溶解包芯結(jié)構(gòu)骨支架表層，形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層熔池處粘接。在_20°C低溫凝固后再次冷凍干燥，滅菌后，得到“定向軟骨支架-包芯骨支架”的組織工程骨軟骨復(fù)合支架。實(shí)施例3 :組織工程骨軟骨復(fù)合支架用于兔關(guān)節(jié)軟骨的缺損修復(fù)提取牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料和殼聚糖溶于O. 5%的醋酸溶液中制備成濃度為20mg/ml的軟骨基質(zhì)材料-殼聚糖混合溶液，溶液中軟骨基質(zhì)材料與明膠的質(zhì)量比為I :1。將混合溶液裝入模具中并在_200°C的低溫環(huán)境中構(gòu)建10°C /mm的溫度梯度，混合溶液凝固后冷凍干燥24小時得到定向結(jié)構(gòu)軟骨支架，支架用京尼平溶液交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。將PLGA/磷酸三鈣按5 1的質(zhì)量比混合溶于1，4_ 二氧六環(huán)中形成濃度為200mg/ml的溶液，將I型膠原溶于O. 5%的醋酸溶液中形成濃度為2mg/ml的膠原溶液，基于無加熱、液化過程的擠壓、噴射成形工藝及設(shè)計的圖2所示的專用噴頭和基于快速成形的低溫沉積制造設(shè)備制作包芯結(jié)構(gòu)骨支架，用戊二醛交聯(lián)并調(diào)整為中性，凍干后備用。利用噴霧器噴灑1，4_ 二氧六環(huán)溶解包芯結(jié)構(gòu)骨支架表層，形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層熔池處粘接。在_20°C低溫凝固后再次冷凍干燥，滅菌后，得到“定向軟骨支架-包芯骨支架”的組織工程骨軟骨復(fù)合支架。將支架切成直徑4mm,厚度為6mm,其中定向結(jié)構(gòu)軟骨支架厚2mm,包芯結(jié)構(gòu)骨支架厚4_。新提取的胎兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)到第三代后分散于培養(yǎng)液中得到細(xì)胞懸液濃度為107個細(xì)胞/ml，并分別接種于潤濕的骨軟骨復(fù)合支架兩端。培養(yǎng)7天后將細(xì)胞支架復(fù)合物接種到兔關(guān)節(jié)人造缺損(直徑4mm,深度6mm)中，70天后檢測可見缺損基本得到修復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于該骨軟骨復(fù)合支架包括含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架(I)和包芯結(jié)構(gòu)骨支架(3);所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架采用含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料，定向大孔之間存在相互貫通的小孔；所述的包芯結(jié)構(gòu)骨支架由連續(xù)擠出的材料單元交錯堆積而成，并形成梯度孔隙結(jié)構(gòu)，該梯度孔隙結(jié)構(gòu)包括材料單元交錯堆積形成的大孔，以及材料單元自身的微孔，其中材料單元由包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯(4)和包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯(5)組成，包芯結(jié)構(gòu)骨支架內(nèi)芯采用人工合成高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物，包芯結(jié)構(gòu)骨支架外芯(5)采用膠原；所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架和包芯結(jié)構(gòu)骨支架通過“溶解-粘接”的方法連接并形成連接層(2)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于所述的含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ;所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石。
4.如權(quán)利要求3所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于所述含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架中的定向大孔截面直徑在20 μ m-200 μ m，定向度的OI值在O. 8至I之間；所述的材料單元交錯堆積形成的大孔(6)直徑100 μ m-lmm,材料單元自身的微孔直徑20 μ m-200 μ m。
5.如權(quán)利要求I所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，其特征在于所述的連接層具有均勻孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率60%-90%。
6.如權(quán)利要求I或2所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟 1)將含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制備成質(zhì)量體積濃度為10 50mg/ml的均勻、無沉淀的混合溶液；所述的含軟骨基質(zhì)材料的天然高分子材料采用牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的混合物；牛骨來源的軟骨基質(zhì)材料與殼聚糖、海藻酸鈉或明膠的質(zhì)量比是O. 5 5:1 ； .2)將裝有混合溶液的模具放置在低于0°C的具有一維溫度梯度的環(huán)境中，實(shí)現(xiàn)溶液的定向結(jié)晶，然后通過冷凍干燥形成含定向大孔的定向結(jié)構(gòu)軟骨支架；經(jīng)交聯(lián)后，清洗凍干備用； .3)將膠原溶解在醋酸溶液中形成膠原溶液，溶液的質(zhì)量體積濃度為2 20mg/ml;將人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合物溶解于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量體積濃度為50 500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA ;所述的鈣磷陶瓷為磷酸三鈣或羥基磷灰石；混合物中的高分子材料與鈣磷陶瓷的質(zhì)量比為I .10 1 ； 4)使用含包芯噴頭的專用擠壓噴射裝置，使內(nèi)噴頭噴出人工合成的高分子生物材料與鈣磷陶瓷的混合溶液，外噴頭噴出膠原溶液，形成膠原材料包裹人工合成的高分子生物材料的連續(xù)的材料單元，按照預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)和路徑，采用基于快速成形的低溫沉積制造工藝連續(xù)擠出交錯堆積制備成含包芯結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)；并經(jīng)過冷凍干燥后形成包芯結(jié)構(gòu)骨支架；經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)后，冷凍干燥備用； 5)在包芯結(jié)構(gòu)骨支架的表面，利用有機(jī)溶劑溶解表層形成薄層熔池，將定向結(jié)構(gòu)軟骨支架與包芯結(jié)構(gòu)骨支架在薄層溶池處粘接，通過冷凍干燥，滅菌后，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的含有連接層的骨軟骨復(fù)合支架。
7.如權(quán)利要求6所述的一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法，其特征在于所述的醋酸溶液質(zhì)量體積百分濃度為O. 5%-3%，所述的有機(jī)溶劑為1，4_ 二氧六環(huán)或氯仿。
全文摘要
一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架及其制備方法，屬于組織工程和生物制造技術(shù)領(lǐng)域。該方法模擬骨軟骨的天然材料及結(jié)構(gòu)，利用定向結(jié)晶原理制備具有定向結(jié)構(gòu)軟骨支架，利用基于快速成形技術(shù)的低溫沉積制造工藝并設(shè)計含包芯噴頭的專用擠壓噴射裝置制備包芯結(jié)構(gòu)骨支架，定向結(jié)構(gòu)支架與包芯結(jié)構(gòu)支架通過“溶解-粘接”方法連接從而構(gòu)建具有“定向結(jié)構(gòu)軟骨-包芯結(jié)構(gòu)骨”結(jié)構(gòu)的組織工程骨軟骨復(fù)合支架。本發(fā)明針對關(guān)節(jié)軟骨的缺損治療，采用具有生物活性的材料并制造具有特殊仿生結(jié)構(gòu)的骨軟骨復(fù)合支架，既可提高支架細(xì)胞種植密度和深度，又可針對骨軟骨不同功能區(qū)域特征促進(jìn)骨、軟骨組織的同時再生，從而提高骨軟骨缺損的修復(fù)效果。
文檔編號A61F2/28GK102860884SQ201210344908
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者熊卓, 張婷, 劉建, 孟國林, 張臘全, 林峰, 孫偉, 李丹 申請人:清華大學(xué)