一種靶向載體、抗腫瘤藥物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領域，具體公開了一種靶向載體、抗腫瘤藥物及其應用。本發(fā)明的可攜帶藥物的靶向載體，為連接有果糖的白蛋白；抗腫瘤藥物由靶向載體和載有的化療藥物組成。本發(fā)明的靶向載體能夠靶向作用于腫瘤細胞；本發(fā)明的抗腫瘤藥物包括化療藥物、作為藥物載體的白蛋白，以及與白蛋白連接的具有導向作用的果糖，與單獨使用的抗腫瘤化療藥物相比，具有更佳的癌細胞特異性、更強的細胞毒性，以及更優(yōu)的使用安全性，在腫瘤治療領域具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種朝向載體、抗腫瘤藥物及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領域，具體公開了一種靶向載體、抗腫瘤藥物及其應用。
【背景技術】
[0002]據(jù)報道，腫瘤細胞可通過允許除葡萄糖以外的其它基質進入其代謝途徑來轉換或補充其養(yǎng)分庫，以便適應低氧/低血糖條件。白蛋白是最豐富的血漿蛋白質(35-50g/L人血清)，其分子量為66.5kDa。白蛋白在臨床環(huán)境中作為藥物載體的作用日益增加，并且存在白蛋白遞送系統(tǒng)可用于評估若干種不同的藥物(Kratz F.Albumin as adrugcarrier:design of prodrugs, drug conjugates and nanoparticles.JControlRelease (2008) ; 32:171-83)。然而，一些炎癥疾病(例如類風濕性關節(jié)炎)會增加人血清白蛋白的攝取，因為炎癥關節(jié)炎通常發(fā)展成主要由發(fā)炎部位的高白蛋白消耗所造成的低白蛋白血癥。多烯紫杉醇(DTX)是微管解聚的抑制劑并且針對多種實體腫瘤具有廣泛的抗腫瘤活性。其被用于治療乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及非小細胞肺癌。多烯紫杉醇被認為與作為細胞毒性劑的太平洋紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(doxorubicin)和氟二氧喃P定(fluorouraciI)同樣有效或更有效(Lyseng-WiIliamson A.K.and Fenton C.Docetaxel:AReviewof its Use in Metastatic Breast Cancer Drugs(2005);65(17):2513-2531)。在20世紀中期，文獻中首次出現(xiàn)了表明腫瘤能夠截留血漿蛋白質并且利用其降解產(chǎn)物進行增殖的報道(A.L.Babson, T.Winnick Protein transfer intumor-bearing rats CancerRes., (1954), 14pp.606 - 611 ；Matsumura Y, Maeda H.A new concept for macromoleculartherapeutics in cancer chemotherapy:mechanismof tumoritropic accumulation ofproteins and theantitumor agent smancs.Cancer Resl986;46:6387-92.X
[0003]納米技術在醫(yī)學且更確切地說在藥物遞送中的使用開始迅速地擴展。目前正在針對許多物質進行關于藥 物遞送且更確切地關于癌癥療法的研究。有趣的是，藥物科學正使用納米粒子來降低毒性、減輕副作用以及增加功效。中國的一項關于納米白蛋白結合性的太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)的臨床試驗顯示,相比溶劑型紫杉醇(175mg/m2IV，經(jīng)3小時，每3周)，210名服用納米白蛋白結合型太平洋紫杉醇(260mg/m2IV，經(jīng)30分鐘，每3周)的轉移性乳腺癌中國患者提供了更高反應率和更長的腫瘤進展時間，而無增加的毒性(Z.Guan, F.Feng, Q.L.Li, Z.Jiang, Z.Shen, S.Yu, J.Feng, J.Huang, Z.Yao, M.J.Hawkins, Randomized study comparing nab-paclitaxel with solvent-basedpaclitaxel inChinese patients (pts)with metastatic breast cancer (MBC), J.Cl in.0ncol.(2007)25; 1038.)。
[0004]已知腫瘤內環(huán)境因惡性細胞的高糖酵解活性、血管供應不足以及血液循環(huán)緩慢而呈酸性，pH 值低至 5.6 (Griffiths JJ Are cancer cells acidic?(1991)BrJCanCer64:425-427)。因為不同的代謝途徑直接受酸度影響，所以酸性的腫瘤內環(huán)境將顯著影響腫瘤細胞的存活率和增殖。現(xiàn)有研究顯示，腫瘤中低氧在某種程度上通過誘導低氧誘導因子(HIF)-1來促進致命的癌癥表型，所述低氧誘導因子(HIF)-1可控制有助于腫瘤進展的血管生成相關性基因的表達(Evaluation of HIF-1inhibitors as anticanceragents.DrugDiscovToday2007;12:853 - 9)。
[0005]人體白蛋白在血液循環(huán)中作為藥物載體在酸性的腫瘤環(huán)境中更容易分解，從而釋放出捷帶的藥*°(Eric Sanchez, MingjieLi, Cathy Wang, et al.Ant1-Myeloma Effectsofthe Novel Anthracycline Derivative Clin CancerRes(2012);10.1158/1078-0432)。在癌癥化療領域，白蛋白作為藥物載體，其作用于癌細胞的靶向性存在缺陷，使藥物不僅作用于癌細胞，還可能作用于健康細胞，使患者健康細胞受到損傷。

【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種靶向載體及抗腫瘤藥物。本發(fā)明的靶向載體以白蛋白為藥物載體，以果糖為導向，采用該靶向載體運載的抗腫瘤藥物能夠將化療藥物靶向作用于腫瘤細胞，減少化療對正常體細胞的傷害。
[0007]本發(fā)明第一方面公開了一種可攜帶藥物的靶向載體，為連接有果糖的白蛋白。
[0008]較優(yōu)的，所述藥物為化療藥物。
[0009]較優(yōu)的，所述靶向載體針對的靶細胞為腫瘤細胞。本發(fā)明的靶向載體攜帶藥物并靶向作用于腫瘤細胞。
[0010]更優(yōu)的，所述腫瘤細胞為實體腫瘤或轉移性腫瘤。
[0011]較優(yōu)的，所述果糖和白蛋白之間的摩爾比為10~100:1。
[0012]本發(fā)明其次公開了前述靶向載體，在制備腫瘤治療藥物中的應用。
[0013]較優(yōu)的，所述腫瘤為實體腫瘤或轉移性腫瘤。
[0014]本發(fā)明還公開了連接有果糖的白蛋白，作為化療藥物靶向載體的應用。
[0015]本發(fā)明所述化療藥物可以為現(xiàn)有的任意種類的抑制腫瘤細胞生長、增殖、分化、轉移的藥物，包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0016]本發(fā)明白蛋白與果糖的連接可采用常規(guī)的蛋白與單糖的連接方式，例如共價結合或非共價結合。較優(yōu)的，白蛋白與果糖通過交聯(lián)劑進行偶聯(lián)。
[0017]更優(yōu)的，所述交聯(lián)劑為N- β -馬來酰亞胺基丙酸酰肼-TFA (ΒΜΡΗ)。
[0018]由于腫瘤細胞高表達吸收果糖的葡萄糖轉運蛋白-5，因此果糖可以被癌細胞大量攝取從而具有癌細胞導向性；但由于果糖分子量小，在血液循環(huán)中很容易被其他蛋白吸收或者進入到正常細胞內，因此將果糖與大分子白蛋白連接共同作為載體后，既可以保證靶向載體自身的穩(wěn)定，又可以保持果糖的導向作用和白蛋白對腫瘤細胞的親和力，將藥物分子靶向的作用于癌細胞，增強藥物分子的抑癌作用。
[0019]本發(fā)明第二方面公開了一種抗腫瘤藥物，包括載有化療藥物的白蛋白，所述白蛋白上還連接有果糖。
[0020]本發(fā)明所述化療藥物可以為現(xiàn)有的任意種類的抑制腫瘤細胞生長、增殖、分化、轉移的藥物，包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0021]較優(yōu)的，所述果糖、化療藥物和白蛋白之間的摩爾比為10~100:5~50:1。
[0022]較優(yōu)的，所述化療藥物選自紫杉醇(Paclitaxel)、氟尿喃唳(Fluorouracil)、多柔比星(Doxorubicin),氨甲喋呤(Methotrexate)、順鉬(Ci splat in)、卡鉬(Carboplatin)之任一種或多種的組合。
[0023]更優(yōu)的，所述化療藥物為紫杉醇。
[0024]最優(yōu)的，所述化療藥物為多烯紫杉醇。
[0025]較優(yōu)的，所述抗腫瘤藥物粒徑為80~150nm。
[0026]更優(yōu)的，所述抗腫瘤藥物粒徑為100~120nm。
[0027]當化療藥物為多烯紫杉醇時，本發(fā)明的抗腫瘤藥物的組成為:多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米微球(DFAN)。
[0028]最優(yōu)的，所述果糖、多烯紫杉醇和白蛋白之間的摩爾比為10~100:5~50:1。
[0029]較優(yōu)的，所述腫瘤為實體腫瘤或轉移性腫瘤。
[0030]更優(yōu)的，所述腫瘤為肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌或膠質瘤。
[0031 ] 本發(fā)明還公開了前述抗腫瘤藥物在單一用藥化療或聯(lián)合化療中的應用。
[0032]本發(fā)明的抗腫瘤藥物在應用于聯(lián)合化療時，是將本發(fā)明的抗腫瘤藥物與其他化療藥物、中藥等，結合放射、外科手術等方法施用于癌癥患者。
[0033]本發(fā)明第三方面公開了前述抗腫瘤藥物的制備方法，步驟如下:
[0034]I)果糖-白蛋白結合物溶液的制備:將果糖與白蛋白按照10~100:1的摩爾比例混合均勻后，加入BMPH作為交聯(lián)劑，4V反應3~6小時獲得果糖-白蛋白納米微球混合溶液；溫育后反應產(chǎn)物透析過夜，獲得果糖-白蛋白結合物溶液；
[0035]2)將化療藥物與EDC溶解在DMSO中，30~50°C水浴，水浴保溫結束后將溶液冷卻到室溫，獲得藥物溶液；
[0036]3)果糖-白蛋白-化療藥物微球溶液的制備:將步驟2)的藥物溶液在恒定攪拌速度(400-800rpm)下以0.5-1.5ml/min的速率滴加到步驟I)的果糖_白蛋白結合物溶液中，控制加入的化療藥物與白蛋白的摩爾比為5~50:1，獲得混合溶液；滴加結束后繼續(xù)以恒定的速率攪拌混合溶液，并向混合溶液中加入EDC，持續(xù)攪拌4-8小時，透析，冷凍干燥，獲得載有化療藥物的果糖-白蛋白結合物作為抗腫瘤藥物。
[0037]較優(yōu)的，步驟3)冷凍干燥的溫度為零下40~80°C。
[0038]較優(yōu)的，步驟3)冷凍干燥后，將凍干后的粉末于凍干溫度下保持48~72h。
[0039]本發(fā)明制備的果糖-白蛋白-化療藥物微球通過電子顯微鏡確定納米粒子的大小介于90~150nm之間。在生理條件(PBS pH7.4，37°C )下果糖-白蛋白-化療藥物微球在人類血清中穩(wěn)定。
[0040]本發(fā)明第四方面公開了一種治療腫瘤的方法，為將前述抗腫瘤藥物施用于腫瘤細胞或者將前述抗腫瘤藥物與其他抗腫瘤藥物一起通過聯(lián)合化療的方法施用于腫瘤細胞。
[0041]所述其他抗腫瘤藥物包括化療藥物、中藥等。
[0042]本發(fā)明最后還公開了一種使化療藥物靶向作用于腫瘤細胞的方法，為以連接有果糖的白蛋白作為化療藥物的載體，將化療藥物靶向性的施用于腫瘤細胞。
[0043]較優(yōu)的，所述白蛋白為人體血清白蛋白。
[0044]本發(fā)明制備的抗腫瘤藥物包括化療藥物、作為藥物載體的白蛋白，以及與白蛋白連接具有導向作用的果糖；其中，葡萄糖轉運蛋白5過度表達導致癌細胞對果糖的攝取增加；實體腫瘤中白蛋白的攝取量大大增強，被稱為大分子的滲透性和保持性增強；因此相比于正常細胞，化療藥物-果糖-白蛋白微球能特異性的被腫瘤細胞大量吸附，使本發(fā)明的抗腫瘤藥物具有癌細胞靶向性，減少化療對健康細胞的傷害。本發(fā)明使用多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)中存在的相同當量濃度的多烯紫杉醇在卵巢癌細胞株和肝癌細胞株中得到的體外結果顯示，DFAN的抗癌作用在酸性環(huán)境中更明顯，而多烯紫杉醇單獨作用的抗癌作用較小。此外，本發(fā)明的納米級抗腫瘤藥物的粒徑范圍為80-150nm，而腫瘤微血管孔徑(直徑)在100到1200nm之間，因此本發(fā)明的納米級抗腫瘤藥物還能增加其對腫瘤血管的滲透。
[0045]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的抗腫瘤藥物由化療藥物-果糖-白蛋白三者結合而成，能夠靶向作用于腫瘤細胞，減少了化療藥物對正常細胞的傷害；并且本發(fā)明的抗腫瘤藥物的抗癌效果在酸性環(huán)境下更明顯，相較于化療藥物的單獨使用，本發(fā)明的藥物更適宜于癌細胞PH更低的體液環(huán)境；更進一步的，納米級的藥物粒徑使得本發(fā)明的抗腫瘤藥物在腫瘤血管中的滲透性更好；可見，本發(fā)明的抗腫瘤藥物具有更佳的癌細胞特異性、更強的細胞毒性，以及更優(yōu)的使用安全性，在腫瘤治療領域具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1:肝癌細胞株(HepG2)在暴露于游離多烯紫杉醇之后存活率的pH依賴性和濃度依賴性抑制。
[0047]圖2:肝癌細胞株(HepG2)在暴露于DFAN之后存活率的pH依賴性和濃度依賴性抑制。
[0048]圖3:卵巢癌細胞株(0V5)在暴露于游離多烯紫杉醇之后存活率的pH依賴性和濃度依賴性抑制。
[0049]圖4:卵巢癌細胞(0V5)株在暴露于DFAN之后存活率的pH依賴性和濃度依賴性抑制。
[0050]圖5:正常人外周血單`個核細胞(PBMC)暴露于游離多烯紫杉醇和DFAN MTS細胞增殖檢測分析圖
[0051 ] 圖6 =DFAN的電鏡圖片
【具體實施方式】
[0052]下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件。
[0053]實施例1納米級抗腫瘤藥物的制備
[0054]1.實驗材料
[0055]白蛋白(美國Sigma-Aldrich公司)，果糖(美國Sigma-Aldrich公司)，多烯紫杉醇(美國Sigma-Aldrich)，ΒΜΡΗ(Ν_ β -馬來酰亞胺基丙酸酰肼-TFA，購自美國ThermoScientificPierce 公司)
[0056]2.實驗方法
[0057]2.1果糖-白蛋白結合物溶液
[0058]采用ΡΗ7.4的PBS緩沖溶液制備果糖、白蛋白混合溶液2mL (含有果糖500mg，并且果糖:白蛋白摩爾比為=10:1)，向制備好的果糖、白蛋白混合溶液中加入BMPH交聯(lián)劑溶液，BMPH的反應濃度為IOmM (3.0mg/mL)，將混合物在4°C下溫育5小時，溫育后反應產(chǎn)物于透析袋中對PH7.4的PBS緩沖溶透析過夜，其間換兩次緩沖溶，以除去過量的試劑，獲得果糖-白蛋白結合物溶液。
[0059]2.2多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)
[0060]將多烯紫杉醇(121.19mg)與EDC (60mg)溶解在DMSO (6ml)中，50°C水浴保溫15分鐘，保溫結束后將溶液冷卻到室溫，獲得多烯紫杉醇溶液(0.15mmol/L)。將多烯紫杉醇溶液在恒定攪拌速度(600rpm)下以lml/min的速率滴加到到果糖-白蛋白結合物溶液中(控加入的多烯紫杉醇與制白蛋白摩爾比為50:1)，獲得混合溶液。滴加結束后繼續(xù)以恒定的速率攪拌混合溶液，并向混合溶液中加入5mg EDC,持續(xù)攪拌4小時使所形成的DFAN結合物交聯(lián)，以產(chǎn)生DFAN納米粒子。
[0061]對PBS進行滲析(纖維素膜，截止12000kDa)以去除未結合的多烯紫杉醇、EDC和DMSO。反應時間后,通過使用亞米康(Amicon)的Ultra-4離心過濾裝置(美國密理博公司，Millipore USA)去除未反應的多烯紫杉醇、EDC。最后將DFAN在_60°C下凍干，保持48小時，通過電子顯微鏡確定多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)的粒徑范圍為90-150nm(實驗結果見圖6)，并且DFAN在生理條件下(PBS pH7.4，37°C)，以及在人類血清中穩(wěn)定存在。
[0062]實施例2癌細胞增殖抑制實驗
[0063]1.實驗對象
[0064]肝癌細胞(!fepG2)、卵巢癌細胞(0V5)
[0065]實施例1制備的多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)
[0066]2.實驗方法`
[0067]I)癌細胞的培養(yǎng):在處理前將肝癌細胞(IfepG2)或卵巢癌細胞(0V5)于含F(xiàn)BS (胎牛血清)的RPM1-1640培養(yǎng)基中以I X IO5個細胞/100微升/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24小時。
[0068]2)藥物溶液的制備:
[0069]一、對照組:將多烯紫杉醇溶于不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，獲得對照組藥物溶液，通過調整RPMI1640培養(yǎng)液的酸堿度以及多烯紫杉醇的加入量，獲得:pH值為5.0，多烯紫杉醇濃度分別為O μ M，0.50 μ M、1.0 μ M、1.5 μ M的藥液；ρΗ值為6.0，多烯紫杉醇濃度分別為O μ Μ，0.50 μ Μ、1.0 μ Μ、1.5 μ M的藥液；ρΗ值為7.0，多烯紫杉醇濃度分別為
Oμ Μ, 0.50 μ Μ、1.0 μ Μ、1.5 μ M 的藥液。
[0070]二、實驗組:將實施例1制備的DFAN溶于不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，獲得實驗組藥物溶液，通過調整DFAN的加入量，使實驗組藥物溶液中存在于DFAN中的多烯紫杉醇與對照組藥物溶液單獨使用的多烯紫杉醇具有相同的多烯紫杉醇當量濃度梯度，并通過調整RPMI1640培養(yǎng)液的酸堿度，獲得:ρΗ值為5.0，DFAN濃度分別為 ΟμΜ (control)，0.52 μ Μ、1.04 μ MU.56 μ M 的藥液；ρΗ 值為 6.0，DFAN 濃度分另Ij為 ΟμΜ (control)，0.52yM、L04yM、L56yM 的藥液；pH 值為 7.0，DFAN 濃度分別為ΟμΜ (control) , 0.52 μ Μ、1.04 μ MU.56 μ M 的藥液(DFAN 濃度分別為 0.52 μ Μ、1.04 μ Μ、
1.56 μ M的藥液含有的有效多烯紫杉醇濃度分別為0.50 μ Μ、1.0 μ Μ、1.5 μ Μ)。[0071]3)將不同濃度、不同pH值的實驗組藥物溶液施用于步驟I)培養(yǎng)的肝癌細胞(HepG2)或卵巢癌細胞(0V5)中，作為實驗組；將不同濃度、不同pH值的對照組藥物溶液施用于步驟I)培養(yǎng)的肝癌細胞(IfepG2)或卵巢癌細胞(0V5)中，作為對照組。
[0072]將癌細胞在未外源添加物質、含多烯紫杉醇或含DFAN的RPM1-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細胞48小時。培養(yǎng)結束后，使用CellTiter96AQue0us非放射性細胞增殖分析法(普洛麥格公司(Promega)進行定量細胞存活檢測。各孔用MTS處理I到4小時，此后使用96孔板讀取器記錄在490nm下的吸光度。所測量的甲臜(formazan)產(chǎn)物的量與活細胞數(shù)目成正比。所標繪的數(shù)據(jù)是平均值土SEM (每個數(shù)據(jù)點使用3次重復實驗)。
[0073]使用相同當量濃度的存在于DFAN中的多烯紫杉醇以及單獨使用的多烯紫杉醇在肝細胞株中得到的體外實驗結果分別見圖2和圖1，使用相同當量濃度的存在于DFAN中的多烯紫杉醇以及單獨使用的多烯紫杉醇在卵巢癌細胞株中得到的體外實驗結果分別見圖4和圖3。
[0074]實驗結果顯示，DFAN以及單獨使用的多烯紫杉醇對肝癌細胞及卵巢癌細胞的抑制均存在劑量效應；DFAN的抗癌作用在酸性環(huán)境中更明顯，而多烯紫杉醇的抗癌作用減小。在酸性環(huán)境(PH5)中，DFAN實際上比游離多烯紫杉醇活性更強。
[0075]實施例3人外周血單個核細胞的細胞毒性作用實驗
[0076]1.實驗對象
[0077]人外周血單個核細胞(PBMC)
[0078]2.實驗方法
[0079]2.1果糖-白蛋白結合物溶液
[0080]采用pH7.4的PBS緩沖溶液制備果糖、白蛋白混合溶液2mL (果糖:白蛋白摩爾比為=100:1)，向制備好的果糖、白蛋白混合溶液中加入BMPH交聯(lián)劑溶液，BMPH的反應濃度為IOmM (3.0mg/mL)，將混合物在4°C下溫育5小時，溫育后反應產(chǎn)物于透析袋中對pH7.4的PBS緩沖溶透析過夜，其間換兩次緩沖溶，以除去過量的試劑，獲得果糖-白蛋白結合物溶液。
[0081]2.2多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)
[0082]將多烯紫杉醇(121.19mg)與EDC (60mg)溶解在DMSO (6ml)中，50°C水浴保溫15分鐘，保溫結束后將溶液冷卻到室溫，獲得多烯紫杉醇溶液(0.15mmol/L)。將多烯紫杉醇溶液在恒定攪拌速度(600rpm)下以lml/min的速率滴加到到果糖-白蛋白結合物溶液中(控制加入的多烯紫杉醇與白蛋白摩爾比為5:1)，獲得混合溶液。滴加結束后繼續(xù)以恒定的速率攪拌混合溶液，并向混合溶液中加入5mg EDC,持續(xù)攪拌4小時使所形成的DFAN結合物交聯(lián)，以產(chǎn)生DFAN納米粒子。
[0083]對PBS進行滲析(纖維素膜，截止12000kDa)以去除未結合的多烯紫杉醇、EDC和DMS0。反應時間后,通過使用亞米康(Amicon)的Ultra-4離心過濾裝置(美國密理博公司，Millipore USA)去除未反應的多烯紫杉醇、EDC。最后將DFAN在_60°C下凍干，保持48小時，通過電子顯微鏡確定多烯紫杉醇-果糖-白蛋白納米粒子(DFAN)的粒徑范圍為90-120nm，并且DFAN在生理條件下(PBS pH7.4，37°C )，以及在人類血清中穩(wěn)定存在。
[0084]2.2細胞實驗
[0085]I)細胞的培養(yǎng):在處理前將人外周血單個核細胞(PBMC)于含F(xiàn)BS (胎牛血清)的RPM1-1640培養(yǎng)基中以I X IO5個細胞/100微升/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24小時。
[0086]2)藥物溶液的制備:
[0087]一、對照組:將多烯紫杉醇溶于不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，獲得對照組藥物溶液，通過調整RPMI1640培養(yǎng)液的酸堿度以及多烯紫杉醇的加入量，獲得pH值為5.0，多烯紫杉醇濃度為1.5 μ M的藥液。
[0088]二、實驗組:將本實施例制備的DFAN溶于不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，獲得實驗組藥物溶液，通過調整DFAN粉末的加入量，使實驗組藥物溶液中存在于DFAN中的多烯紫杉醇與對照組藥物溶液單獨使用的多烯紫杉醇具有相同的多烯紫杉醇當量濃度梯度，并通過調整RPMI1640培養(yǎng)液的酸堿度，獲得pH值為5.0，DFAN濃度為1.56μM的藥液(DFAN濃度為1.56 μ M的藥液含有的有效多烯紫杉醇濃度為1.5 μ Μ)。
[0089]將實驗組藥物溶液、對照組藥物溶液施用于步驟I)培養(yǎng)的人外周血單個核細胞(PBMC)中，分別獲得實驗組和對照組。
[0090]三、空白對照組:將不含任何化療藥物、pH值為5.0的RPM1-1640培養(yǎng)液施用于步驟I)培養(yǎng)的細胞中，作 為空白對照組。
[0091]3)將人外周血單個核細胞癌細胞在未外源添加物質、含多烯紫杉醇或含DFAN的RPM1-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細胞48小時。培養(yǎng)結束后，使用CellTiter96AQueous非放射性細胞增殖分析法(普洛麥格公司(Promega)進行定量細胞存活檢測。各孔用MTS處理I到4小時,此后使用96孔板讀取器記錄在490nm下的吸光度。所測量的甲膜(formazan)產(chǎn)物的量與活細胞數(shù)目成正比。所標繪的數(shù)據(jù)是平均值土SEM (每個數(shù)據(jù)點使用3次重復實驗)。
[0092]實驗結果見圖5，由圖5可知，DFAN對正常人外周血單個核細胞(PBMC)的細胞毒性作用比游離多烯紫杉醇低得多，可見本發(fā)明的以白蛋白、果糖為載體的化療藥物能夠靶向作用于癌細胞，減少對正常體細胞的損傷。
【權利要求】
1.一種可攜帶藥物的靶向載體，為連接有果糖的白蛋白。
2.如權利要求1所述的靶向載體，其特征在于，所述藥物為化療藥物。
3.如權利要求1所述的靶向載體，其特征在于，所述靶向載體針對的靶細胞為腫瘤細胞。
4.權利要求1-3任一權利要求所述靶向載體，在制備腫瘤治療藥物中的用途。
5.連接有果糖的白蛋白作為化療藥物靶向載體的應用。
6.一種抗腫瘤藥物，包括載有化療藥物的白蛋白，其特征在于，所述白蛋白上還連接有果糖。
7.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述果糖、化療藥物和白蛋白之間的摩爾比為10~100:5~50:1。
8.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述化療藥物選自紫杉醇、氟尿嘧啶、多柔比星，氨甲喋呤、順鉬、卡鉬中任一種或多種的組合。
9.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述化療藥物為多烯紫杉醇。
10.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述抗腫瘤藥物粒徑為80~150nmo
11.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述腫瘤為實體腫瘤或轉移性腫瘤。
12.如權利要求6所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述腫瘤為肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌或 膠質瘤。
【文檔編號】A61P35/00GK103656659SQ201210364794
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月26日 優(yōu)先權日:2012年9月26日
【發(fā)明者】包駿, 陳海銘 申請人:包駿