專(zhuān)利名稱(chēng)：用于診斷或治療bcl2相關(guān)癌癥的組合物和方法
用于診斷或治療BCL2相關(guān)癌癥的組合物和方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680039776. 8、申請(qǐng)日為2006年9月11日的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明者CarloΜ· Croce 和 George A. Calin
政府資助
本發(fā)明全部或部分由來(lái)自國(guó)家癌癥研究所的基金號(hào)P01CA76259、P01CA81534和 P30CA56036資助。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及癌癥的診斷特別是BCL2相關(guān)癌癥的診斷。本發(fā)明還包括用于治療與 BCL2基因和/或基因產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法和組合物。本發(fā)明還提供了用于改進(jìn)抗癌療法例如化學(xué)療法和其他常規(guī)癌癥療法的新的方法和組合物。
發(fā)明背景
在一百多種不同的生物(包括果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)和人)中發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA，miR)。據(jù)認(rèn)為miRNA在這些生物中參與許多調(diào)節(jié)發(fā)育的過(guò)程。miRNA通常從60至70個(gè)核苷酸的折疊RNA前體結(jié)構(gòu)加工而來(lái)，所述前體從miRNA基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)。RNA前體或加工的miRNA產(chǎn)物可容易被檢測(cè)到，并且這些分子的缺乏可表明相應(yīng)的miRNA基因的功能的缺失或丟失。
癌癥是美國(guó)和全世界死亡率和發(fā)病率的重要來(lái)源。特別地,慢性淋巴細(xì)胞性白血病(“CLL”)和其他BCL2相關(guān)癌癥(例如，急性髓細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤(例如，濾泡性淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤)、癌(例如，腦癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、肝細(xì)胞癌和胃癌)、血液的惡性腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性疾病)是成年人的臨床上重要的腫瘤性疾病(neoplastic disease)。例如,CLL是西方國(guó)家中成年人白血病的最常見(jiàn)形式,在美國(guó)前列腺癌的年齡校正的發(fā)病率現(xiàn)在超過(guò)男性中所有其他癌癥的年齡校正的發(fā)病率，并且，排在肺癌之后，為該國(guó)男性癌癥死亡的第二大病因。
在超過(guò)一半的報(bào)導(dǎo)的CLL病例中發(fā)生在13ql4上的半合子和/純合子丟失，其構(gòu)成了 CLL中最常見(jiàn)的染色體異常。經(jīng)鑒定來(lái)自CLL患者的組織樣品的核型具有相對(duì)少量的染色體異常，這表明觀察到的13ql4上的缺失的特異性和頻率具有病理顯著性。此外， 13ql4缺失也在60%的前列腺癌中發(fā)生，這表明位于13ql4的一種或更多種腫瘤抑制基因參與CLL和前列腺癌的發(fā)病機(jī)理。
CLL和前列腺癌中13ql4缺失的克隆純合型和雜合型缺失的存在和非常高的頻率表明該區(qū)域中的缺失與某些癌癥類(lèi)型的病因?qū)W相關(guān)。為了鑒定缺失區(qū)域中的基因，已對(duì)幾個(gè)組使用了定位克隆。迄今為止，已就DNA和/或RNA水平上的改變?cè)贑LL的偶發(fā)性和家族性病例中鑒定和 篩選了來(lái)自13ql4的刪除區(qū)域的總共8個(gè)基因Leul(BCMS或EST70/ Leul)、Leu 2 (ALTI 或 1B4/Leu2)、Leu 5 (CAR)、CLLD6、KPNA3、CLLD7、L0C51131 (假定的鋅指蛋白NY-REN-34抗原)和CLLD8。然而，詳細(xì)的基因分析，包括詳盡的雜合子丟失(LOH)、 突變和表達(dá)的研究，未能證明這些基因中任何基因在致癌作用中是固有涉及的。
CLL的惡性的、大部分非分裂的B細(xì)胞過(guò)度表達(dá)Bcl2基因(Kitada，S.，等人， Blood 91:3379-3389(1998))，在通過(guò)抑制細(xì)胞死亡而促進(jìn)真核細(xì)胞的存活中起著中心作用的凋亡抑制因子(Cory, S.，和 Adams, J. M.，Nature Reviews 2:647-656(2002))。Bcl2 的過(guò)度表達(dá)與許多類(lèi)型的人癌癥包括白血病、淋巴瘤和癌相關(guān)(Sanchez-Beato，M.，等人，Blood 101:1220-1235(2003))。在濾泡性淋巴瘤中和部分彌漫性B細(xì)胞淋巴淋中，發(fā)現(xiàn)BCL2的活化機(jī)制是染色體易位t (14; 18) (q32;q21),該易位將BCL2基因置于免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子的控制之下，這導(dǎo)致該基因的表達(dá)脫離控制(Tsujimoto, Y.，等人，Science 226:1097-1099(1984) ; Tsujimoto, Y.,等人，Science 228:1440-1443(1985))。然而， BCL2基因在低于5%的CLL病例中與免疫球蛋白基因座緊靠(Adachi，M.，等人，J. Exp. Med. 171:559-564 (1990))，BCL2在大部分CLL癌癥中的過(guò)度表達(dá)的機(jī)制仍然未知。
目前對(duì)CLL的治療通常包括化學(xué)療法，單獨(dú)地或與自體骨髓移植一起施用的化學(xué)療法。使用的化學(xué)治療劑通常對(duì)于患者是有毒性的，通常在相對(duì)大部分的患者只導(dǎo)致部分緩解。用于BCL2相關(guān)癌癥的療法也可包括化學(xué)療法，通常在腫瘤的手術(shù)切除后進(jìn)行。然而， 對(duì)于CLL，化學(xué)治療劑的治療特征(在進(jìn)行或不進(jìn)行手術(shù)的情況下)是有限的。
單獨(dú)使用化療的治療是有限的，因?yàn)榘┘?xì)胞通常變得對(duì)廣譜的結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的化學(xué)治療劑具有抗性。該抗性，稱(chēng)為“多抗藥性(multidrug resistance)” (MDR),是治療癌癥患者中面臨的共同問(wèn)題，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗性代表了臨床腫瘤學(xué)中的主要問(wèn)題。
凋亡是事件順序的重要組成部分，在所述事件順序期間，化療藥物誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，并且研究已表明Bcl2在抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡中具有至關(guān)重要的作用(Kim，R等人， Cancer 101(11) : 2491-2502 (2004))。此外，經(jīng)工程改造過(guò)度表達(dá)Bcl2的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)許多不同藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)的抗性(Kamesaki等人，Cancer Res. 53:4251-4256(1993); Miyashita and Reed, Blood 81:151-157(1993))。
存在對(duì)用于CLL和其他BCL2相關(guān)癌癥的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的診斷的需要。也存在用于BCL2相關(guān)癌癥例如CLL的經(jīng)濟(jì)、有效的對(duì)患者沒(méi)有顯著負(fù)影響的療法的需要。還存在針對(duì)抑制Bcl2的表達(dá)的新的抗癌療法的需要，只要廣泛的普通癌癥與Bcl2蛋白的過(guò)度表達(dá)相關(guān)。此外，存在對(duì)相對(duì)于其他常規(guī)抗癌療法展示增加的功效的改進(jìn)的抗癌療法的需要。 此外，存在對(duì)鑒定可增加癌細(xì)胞對(duì)抗癌劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性從而改進(jìn)癌癥療法的試劑和方法的需要。還存在對(duì)在過(guò)度表達(dá)抗凋亡蛋白例如Bcl2的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法的需要。
發(fā)明概述
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些具有與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的microRNA 在過(guò)度表達(dá)Bcl2蛋白的癌細(xì)胞中擺脫了控制。
因此，本發(fā)明提供了在需要該治療的受試者中預(yù)防癌癥或治療與BCL2基因或基因產(chǎn)物(例如，RNA、蛋白質(zhì))過(guò)度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法，其包括施用有效量的至少一種miR 基因產(chǎn)物。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“BCL2”是指BCL2核酸(例如，BCL2基因、cDNA、RNA轉(zhuǎn)錄物、DNA構(gòu)建體)，而“Bcl2”是指Bcl2蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR 基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQ ID NO: 55的核苷酸3741至3749互補(bǔ)的核苷酸序列。此類(lèi)miR基因產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于miR15、miR16、miR-15b和miR-16_2。miR15和miR16基因位于13ql4，通常分別稱(chēng)為mir_15a和miR-16-l。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“miR15”和 “miR-15a”可互換使用，對(duì)于術(shù)語(yǔ)“miR16”和“miR-16-l ”亦如此。在其他實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、 miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、 miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186 和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195 和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。
本發(fā)明還提供了用于治療患有與Bcl2過(guò)度表達(dá)相關(guān)的癌癥的受試者的藥物組合物，其包含至少一種化學(xué)治療劑和至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-16-l。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、 miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、 miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、 miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、 miR-15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2、miR-195 和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。
本發(fā)明還包括確定在具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中癌癥療法的功效的方法，其包括對(duì)受試者施用至少一種藥物，然后測(cè)量包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因產(chǎn)物的表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，在施用試劑后，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的增加表明成功的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種 miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2, miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、 miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR_9、miR-137、miR-217、miR-186 和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、 miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR_15a 或miR-16-l。
本發(fā)明還提供了用于增加抗癌療法(例如，化學(xué)療法、放射療法)的功效的方法， 其包括與至少一種抗癌療法一起對(duì)腫瘤細(xì)胞提供至少一種miR基因產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。 在其他實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種 miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、miR_15b、 miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、 miR-143,miR-96,miR-103,miR-107,miR-129,miR-9,miR-137,miR-217,miR-186 和其組合。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、 miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR_15a或 miR-16-l。
本發(fā)明還提供了增加癌細(xì)胞對(duì)抗癌劑的細(xì)胞毒性的敏感性的方法，其包括對(duì)癌細(xì)胞提供至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或 miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、 miR-15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2, miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、 miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、 miR-217、miR-186和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、 miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2、miR-195 和其組合。在某些實(shí)施方案中， miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在特定的實(shí)施方案中，抗癌劑是化療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌劑是輻照處理。
本發(fā)明還包括誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的方法，其包括將細(xì)胞與至少一種包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的miR基因產(chǎn)物接觸。在特定的實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物包含與SEQ ID NO: 55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195、 miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、 miR-107,miR-129,miR-9,miR-137,miR-217,miR-186 和其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、miR-16-2、miR-195 和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。用于這些方法的合適的細(xì)胞包括，但不限于，表達(dá)Bcl2蛋白的癌細(xì)胞和其他細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了在受試者中診斷BCL2相關(guān)癌癥的方法，其包括確定相對(duì)于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平，來(lái)自受試者的樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平， 其中miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物包含與SEQ ID NO: 55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種 miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-l、miR-15b、 miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、 miR-143,miR-96,miR-103,miR-107,miR-129,miR-9,miR-137,miR-217,miR-186 和其組合。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR 基因產(chǎn)物選自 miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、 miR-15b、miR-16-2、miR-195和其組合。在某些實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物不是miR_15a或 miR-16-l。


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圖1A和IB分別是預(yù) 測(cè)的miR15和miR16前體RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖示。使用 Matthews,等人，J. Mol. Biol. 288:911-940 (1999)的 “mfold” 程序(版本 3.1)進(jìn)行RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并進(jìn)行手工加工以在螺旋片段中容納G/U擺動(dòng)堿基配對(duì)。經(jīng)過(guò)加工的miR15和miR16miRNA的序列以下劃線(xiàn)標(biāo)示。改編自L(fǎng)agos-Quintana,等人， Science^M: 853-858 (2001)。
圖2A是CLL中13ql4腫瘤抑制基因基因座內(nèi)的基因圖，該基因圖顯示miR15/16 基因簇的定位。在圖中顯示了遺傳標(biāo)記的位置和基因的位置。
圖2B是由水平條紋框標(biāo)記的之前報(bào)導(dǎo)的13ql4缺失。
圖2C是D13S1150和D13S272標(biāo)記之間的基因座的圖?；蛎Q(chēng)下面的箭頭標(biāo)示該基因座中各基因的方向，垂直條塊標(biāo)示與各基因相應(yīng)的相應(yīng)的外顯子的位置。
圖2D是Alu 18和D13S272標(biāo)記之間的基因座的圖。條塊和框標(biāo)示LEU2/ALT1和 LEUl的外顯子的位置。短的垂直箭頭標(biāo)示miR15和miR16基因的位置。圓圈標(biāo)示用于篩選來(lái)源于兩個(gè)獨(dú)立的白血病病例(CLL-A和CLL-B)的融合的體細(xì)胞雜交克隆的PCR引物的位置。加陰影線(xiàn)的框代表存在于雜種中的染色體13的位置。“一 31.4kb—”表示克隆 CLL-A中大約31. 4kb的缺失區(qū)域，其來(lái)源于具有CLL (具有t (2; 13) (ql2; ql3)易位)、雙側(cè)性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(bilateral retinoblastoma)和潰瘍性結(jié)腸炎的患者。長(zhǎng)垂直箭頭表示具有t (2; 13) (q32;ql4)易位的克隆CLL-B中的斷裂點(diǎn)，“一 29kb ―”表示來(lái)自該CLL 克隆的大約29kb的缺失區(qū)域。
圖3A是正常人腎、前列腺、肝、胰腺癌、骨骼肌(“Sk肌”)、睪丸、⑶5+B細(xì)胞(⑶5+)、 白血病細(xì)胞(“Per BI LeukO和骨髓(“BM”)中的miR15和miR16基因表達(dá)的Northern 印跡分析。
圖3B是18個(gè)CLL患者中微衛(wèi)星標(biāo)記D13S272和D13S273的雜合子(“L0H”)丟失分析。來(lái)自正常人⑶5+細(xì)胞的DNA用作對(duì)照。樣品的LOH狀態(tài)表示為“+/+”、“+/-”、 “-/-”、“NI” (未提供資料)、“？” (無(wú)足夠的材料)和“ND” (未進(jìn)行)。溴化乙錠染色的 Northern印跡凝膠用作標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照。
圖 4A 描述了人 miRNA(miR-15a(Hsa_miR-15;SEQ ID NO:58)或 miR-16-1 (Hsa miR-16;SEQ ID NO :59))和人 BCL2 cDNA (Hsa BCL2; SEQ ID NO :57))以及小鼠 miRNA(miR-15a(Mmu_miR-15;SEQ ID NO:61)或 miR-16-1(Mmu_miR_16;SEQ ID NO:62))與小鼠BCL2cDNA (Mmu_BCL2; SEQ ID NO:60)之間的miR: :mRNA互補(bǔ)區(qū)(紅色核苷酸)。標(biāo)示兩種不同的3’ UTR突變型構(gòu)建體3’ Ml (其缺少負(fù)責(zé)miRNA: :mRNA相互作用的所有9個(gè)bp) 和3’M2 (其缺少互補(bǔ)區(qū)域中的前5個(gè)bp)的miR-15a和miR-16-l中的被靶向的缺失的位
圖4B是描述5種不同的CLL樣品(CLL)的每一種中以及來(lái)自正?；颊叩蘑?陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞的混合樣品(⑶5混合物)中的Bcl2蛋白的水平的Western印跡。Jurkat細(xì)胞(T細(xì)胞白血病細(xì)胞系)用作Bcl2蛋白表達(dá)的對(duì)照。β-肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)的水平用于標(biāo)準(zhǔn)化。如通過(guò)微陣列信號(hào)強(qiáng)度所確定的，各樣品中的miR-16-l和miR-15a microRNA 的相對(duì)表達(dá)在下面相應(yīng)的泳道中示于印跡下面。
圖5A是描述未轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞(MEG-01 WT)以及用空載體 (MEG-01-pRS-neo-GFP)轉(zhuǎn)染的 MEG-01 細(xì)胞、用包含 mir-15a/miR-16_l 基因簇的載體 (MEG-01-pRS-15a/16-l WT)轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞或用載體(所述載體包含在miR_16a前體的 3'區(qū)域具有 +7 (C 至 T)置換的 mir-15a/miR-16-l 基因簇)(MEG-01-pRS-15a/16_lMUT)轉(zhuǎn)染的MEG-01細(xì)胞中，Bcl2蛋白水平以及不同凋亡活性劑(例如，APAFU Pro_C9、C9、PARP 和經(jīng)切割的PARP)的全長(zhǎng)和切割的形式水平的Western印跡。以一式兩份的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)。pRS-15a/16-lWT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示APAF1(凋亡蛋白酶活化因子1、細(xì)胞色素C相互作用因子(interactor))、pro-半胱天東酶9 (內(nèi)源性凋亡途徑)和多聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP,不同的凋亡途徑的終效應(yīng)物)的斷裂。肌動(dòng)蛋白用作上樣對(duì)照。
圖5B 是描述用 miR-15a 和 / 或 miR-16-l 有義(miR_15a, miR16_l)或 miR_15a 和 / 或 miR-16-l 反義(miR-15a_AS、miR16_l_AS) RNA 寡核苷酸轉(zhuǎn)染的 MEG-Ol 細(xì)胞中的 Bcl2 蛋白質(zhì)水平的Western印跡(WB)。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對(duì)照(MEG-Ol-WT)。使用β肌動(dòng)蛋白 (肌動(dòng)蛋白)的水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。進(jìn)行Northern印跡(NB)分析以估量miR-15有義和miR-16 有義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染功效。RT-PCR產(chǎn)物代表了相同細(xì)胞中BCL2轉(zhuǎn)錄物的mRNA水平，將該水平針對(duì)β肌動(dòng)蛋白(肌動(dòng)蛋白)mRNA的水平(RT-PCR)標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6A是描述在用miR-15-a和/或miR-16-l有義RNA寡核苷酸(分別為miR15a S和miR-16-lS)或miR-15-a和/或miR-16-l反義RNA寡核苷酸(分別為miR15a A和 miR-16-ΙΑ)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，相對(duì)腎熒光素酶轉(zhuǎn)染對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化的熒火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)的相對(duì)抑制(抑制倍數(shù))的條形圖。用空對(duì)照載體(pGL-3-Cont)或miR-15-a和/或miR-16-l 有義或反義RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以一式三份重復(fù)(n=6)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)2次。
圖6B是描述相對(duì)腎熒光素酶轉(zhuǎn)染對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化的熒火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)的相對(duì)抑制的條形圖。用空對(duì)照載體(pGL-3-Cont)、miR-15-a和miR-16-l有義 RNA 寡核苷酸(pSR-15a/16-lS+3，UTR)或 miR-15-a 和 miR-16-l 反義 RNA 寡核苷酸 (pSR-15a/16-lA+3’ UTR) RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3’ UTR表示融合至野生型BCL23’ UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因。也轉(zhuǎn)染兩種不同的3’^1 突變體，一種缺乏1^1 -15-&和1^1 -16-1中的互補(bǔ)性miRNA: :mRNA區(qū)域的所有9個(gè)bp (pSR_15a/16_l S+3’M1),另一個(gè)缺乏相同互補(bǔ)區(qū)域中的前5個(gè)bp(pSR-15a/16-l S+3’M2)。以一式三份重復(fù)(n=6)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)2次。
根據(jù)下列本發(fā)明的實(shí)施方案的更具體描述，本發(fā)明的前述目的和其他目的、特征和有利方面將很顯然。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的描述如下。
當(dāng)通過(guò)參考其優(yōu)選實(shí)施方案，明確地顯示和描述本發(fā)明時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解此處可在形式和內(nèi)容上進(jìn)行不同的改變而不背離由所附權(quán)利要求包含的本發(fā)明的范圍。
如此處可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”是指來(lái)自 miR基因的未加工的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)閙iR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)，術(shù)語(yǔ)“miR 基因產(chǎn)物”不包括蛋白質(zhì)。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱(chēng)為“miR前體”，通常包含長(zhǎng)度大約為70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^(guò)RNA酶(例如Dicer、Argonaut、RNAse III (例如，大腸桿菌RNA酶III))降解將miR前體加工成活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。該活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱(chēng)為“加工的” miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟的” miRNA。
可通過(guò)天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過(guò)合成加工途徑 (例如，使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得活性19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解為還可通過(guò)生物或化學(xué)合成產(chǎn)生活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子而不必從miR前體加工。
表I中提供了大量miR基因產(chǎn)物的序列。所有核苷酸序列此處以5’至3’的方向給出。
表1-人miR基因產(chǎn)物的序列004權(quán)利要求
1.增加具有BCL2相關(guān)癌癥的受試者中抗癌療法的功效的方法，其包括 a)對(duì)受試者施用至少一種抗癌療法；和 b)對(duì)受試者施用至少一種miR基因產(chǎn)物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與BCL2基因轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列； 其中，抗癌療法的功效被增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-15a或miR-16-l。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR_15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137, miR-217, miR-186 和其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR_15b、miR-16-2, miR-195 和其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物包含與SEQID N0:55的核苷酸3741-3749互補(bǔ)的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗癌療法是化學(xué)療法。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗癌療法是放射療法。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述淋巴瘤選自濾泡性淋巴瘤、小細(xì)胞淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療受試者中與BCL2基因和/或基因產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)相關(guān)的癌癥的方法和組合物以及用于改進(jìn)抗癌療法例如化學(xué)療法和放射療法的方法和組合物。本發(fā)明還包括用于確定癌癥療法在受試者中的功效的方法和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的方法。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK103028120SQ20121038080
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2006年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
發(fā)明者C·M·克羅斯, G·A·卡林 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)