一種微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明采用微酸環(huán)境靶向多肽修飾表面富氨基的樹狀高分子材料包封基因自組裝制成微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。本發(fā)明選用來(lái)源于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C的多肽修飾高分子載體，以pH敏感的細(xì)胞膜插入方式濃集附著于細(xì)胞和靜電吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，并降低毒副作用。所述腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)具有腫瘤微酸環(huán)境下的細(xì)胞膜作為靶點(diǎn)和多肽作為靶向頭基的優(yōu)點(diǎn)，靶向和治療效率高、制備簡(jiǎn)捷，可用于制備靶向治療人體來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源的腫瘤細(xì)胞藥物。
【專利說(shuō)明】一種微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及藥物遞送系統(tǒng)，具體涉及一種微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，對(duì)抗癌藥物遞送的研究是引人注目的熱點(diǎn)。所述抗癌藥物不同于普通藥物，其毒副作用大，對(duì)機(jī)體正常器官造成的損害非常大；有效專一地將抗癌藥物運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位減少毒副作用以及由此引起的經(jīng)濟(jì)損失是當(dāng)務(wù)之急。
[0003]有研究指出，腫瘤靶向給藥系統(tǒng)是治療腫瘤的新型藥物遞送策略。所述靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建主要有兩種策略:被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向；被動(dòng)靶向主要是基于腫瘤組織特有的EPR效應(yīng)，而主動(dòng)靶向則是利用可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)受體的頭基修飾給藥系統(tǒng)達(dá)到靶向輸送的作用。目前，腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的研究取得了很大的進(jìn)展，但腫瘤靶向遞送仍然需要更深的研究以及更好的完善。
[0004]近來(lái)pH敏感靶向策略成為設(shè)計(jì)腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。目前已知，幾乎所有的實(shí)體瘤都存在微酸環(huán)境，腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的高攝取，在無(wú)氧條件下葡萄糖被酵解成乳酸，形成酸性環(huán)境；另一方面，腫瘤的異常血管引起腫瘤供氧不足、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)失控引起缺氧和代謝失常增加了無(wú)氧代謝；腫瘤細(xì)胞自身通過(guò)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子以適應(yīng)低氧環(huán)境和相應(yīng)糖酵解產(chǎn)生乳酸后的酸性環(huán)境，因此，以微酸環(huán)境作為靶點(diǎn)介導(dǎo)腫瘤靶向遞送具有比被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向更廣泛的適用性。
[0005]目前已知，來(lái)源于細(xì)·菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C的pH敏感肽pHLIP，在弱酸性條件下(pH 6~6.5)可插入細(xì)胞膜，形成跨細(xì)胞膜螺旋；所述pHLIP肽修飾的藥物或納米載藥系統(tǒng)，經(jīng)EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織后，可在腫瘤組織細(xì)胞外的酸性環(huán)境下插入腫瘤細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)從腫瘤組織間隙向腫瘤細(xì)胞的定位。此外，新型納米級(jí)樹枝狀合成高分子聚賴氨酸具有高度分枝，單分散性，末端氨基豐富等良好性質(zhì)，通過(guò)親水性雙功能高分子聚乙二醇連接在pHLIP肽末端，合成載體DGL-PEG-pHLIP，可將pHLIP特異性插入酸性環(huán)境下的腫瘤細(xì)胞膜的性質(zhì)轉(zhuǎn)移到載體上。
[0006]還有研究證實(shí)，促血管形成因子是腫瘤生長(zhǎng)所必需的，而最重要的促血管形成因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF。所述VEGF是一種選擇性的內(nèi)皮細(xì)胞分裂原，其能增加微血管的通透性，選擇性刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)VEGF表達(dá)可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，因此，可選用有效下調(diào)VEGF表達(dá)的小干擾RNA作為治療基因、載體包封治療基因形成微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。但迄今為止，尚未見有關(guān)微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新型的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，以更好地解決現(xiàn)有腫瘤靶向給藥系統(tǒng)存在的靶向效率低的問(wèn)題。
[0008]本發(fā)明采用微酸環(huán)境靶向多肽修飾的表面富氨基的樹枝狀高分子材料包封治療基因自組裝制成微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)；所述腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)選用來(lái)源于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C的多肽修飾高分子載體，以pH敏感的細(xì)胞膜插入方式濃集附著于細(xì)胞和靜電吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，降低毒副作用。
[0009]具體而言，本發(fā)明的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，為微酸環(huán)境靶向多肽修飾的聚賴氨酸型樹枝狀高分子作為載體包封治療基因自組裝構(gòu)建的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽和治療基因組成，所述多肽修飾高分子材料包封治療基因自組裝形成納米粒；
[0010]其中，所述高分子材料與聚乙二醇的摩爾比是1:10，高分子材料與多肽的摩爾比是1: 1，高分子材料與治療基因的質(zhì)量比是6:1 ；
[0011]所述高分子材料為表面富氨基的聚賴氨酸型樹狀分枝物，選自聚賴氨酸型樹狀分枝物；
[0012]所述聚乙二醇選自馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亞胺；
[0013]所述多肽是序列為AEQNPIY WARYADffLFTTPLLLLDLALLV DADEGT 的 pHLIP 肽，所述PHLIP肽來(lái)源于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C ;所述多肽pHLP在微酸環(huán)境下插入細(xì)胞膜形成跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；
[0014]所述治療基因選自可特異性沉默腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因或其它所有具有抗腫瘤效果的基因；
[0015]本發(fā)明中，所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，可在納米給藥系統(tǒng)表面結(jié)合肝素形成表面負(fù)電的納米給藥系統(tǒng)；其中，所述肝素與基因質(zhì)量比1:1~32:1。
[0016]本發(fā)明的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，步驟為:
[0017]將高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┘状贾信渲瞥蓛?chǔ)備液，取適量于西林瓶中吹干，稱取適量的聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶解到PH 8.0的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物摩爾比為1:10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)后；稱取適量的PHLIP肽溶于適量二甲基亞砜中配制成適宜濃度的溶液，加入到高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物一聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶液中，與高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物摩爾比1:1，再加入pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液，一定溫度下反應(yīng)24h，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體，轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500和多肽pHLIP ;再與治療基因以質(zhì)量比6:1渦旋反應(yīng)30s，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0019](I)利用可在微酸環(huán)境下插入細(xì)胞膜形成跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的多肽修飾納米給藥系統(tǒng)制備本腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，具有腫瘤微酸環(huán)境作為腫瘤靶點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，靶向和治療效率高、制備簡(jiǎn)捷；[0020](2)所述納米給藥系統(tǒng)上修飾的多肽可將插入微酸環(huán)境下的細(xì)胞膜的特性賦予納米給藥系統(tǒng)，使納米給藥系統(tǒng)具有更高的腫瘤靶向效率；該納米給藥系統(tǒng)表面的正電性具有細(xì)胞攝取的性質(zhì)，提高對(duì)細(xì)胞的攝取效率和治療效率；
[0021](3)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，不需特殊的處理，可直接用于細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)。
[0022]本發(fā)明的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，提高了納米給藥系統(tǒng)靶向腫瘤細(xì)胞的效率，多肽的修飾使載治療基因納米給藥系統(tǒng)具有了高效定位腫瘤細(xì)胞的能力，可在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)得到較高的攝取效率，并避免了其他正常細(xì)胞的攝取，提高給藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤的治療效率，可用于制備靶向治療人體來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源的腫瘤細(xì)胞藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是氫核磁共振表征聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體DGL-PEG-pHLIP，其中，
[0024]A:氫核磁共振表征聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺，
[0025]B:微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體DGL-PEG-pHLIP。
[0026]圖2是紫外光譜表征DGL-PEG-pHLIP、未修飾載體DGL-PEG、pHLIP肽以及多肽溶劑。
[0027]圖3是透射電鏡表征微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的粒徑及表面形態(tài)。
[0028]圖4是瓊脂糖凝膠電泳考察納米給藥系統(tǒng)中包封基因的影響，其中，肝素加入可改變納米給藥系統(tǒng)表面的正電位，使納米給藥系統(tǒng)表面呈負(fù)電位，從而避免納米給藥系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞。
[0029]圖5是馬爾文納米粒度分析`儀表征未修飾的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的粒徑和e電位。
[0030]圖6是螢光顯微鏡定性考察“中性環(huán)境正常細(xì)胞”和“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”與未修飾的含肝素的納米給藥系統(tǒng)，及微酸環(huán)境靶向多肽修飾的含肝素的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)孵育30min后細(xì)胞結(jié)合納米給藥系統(tǒng)的效率；其中，
[0031]A、B:螢光顯微鏡定性考察“中性環(huán)境正常細(xì)胞”和“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”與未修飾的含肝素的納米給藥系統(tǒng)孵育30min后細(xì)胞結(jié)合納米給藥系統(tǒng)的效率；
[0032]C、D:微酸環(huán)境靶向多肽修飾的含肝素的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)孵育30min后細(xì)胞結(jié)合納米給藥系統(tǒng)的效率。
[0033]圖7是共聚焦顯微鏡考察微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)pHLIP修飾納米給藥系統(tǒng)的細(xì)胞靶向機(jī)制和內(nèi)吞機(jī)制，其中，
[0034]A 酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”標(biāo)記細(xì)胞膜，與微酸環(huán)境靶向多肽修飾的含肝素的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)5min ；
[0035]B 酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”標(biāo)記細(xì)胞膜，與微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)孵育IOmin ；
[0036]C 酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”標(biāo)記酸性細(xì)胞器，與微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)孵育15min ；
[0037]D 酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”標(biāo)記細(xì)胞核，與微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)孵育20min ；
[0038]標(biāo)尺:1Oiim。
[0039]圖8是螢光顯微鏡定性考察未修飾的納米給藥系統(tǒng)(B、E)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)(C、F)在“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”上介導(dǎo)綠色螢光蛋白報(bào)告基因表達(dá)的效率。
[0040]圖9是定性表征“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育納米給藥系統(tǒng)后目的基因VEGF的mRNA，其中，
[0041]1、2、3、4分別代表空白對(duì)照、載對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、載治療基因的未修飾納米給藥系統(tǒng)和載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤IE向納米給藥系統(tǒng)，Adobe Photoshop CS3對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行半定量。
[0042]圖10是活體成像系統(tǒng)定性考察微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)在荷皮下實(shí)體瘤裸鼠模型上的腫瘤靶向效率，白色線圈內(nèi)為腫瘤區(qū)域。
[0043]圖11是定性考察未修飾的納米給藥系統(tǒng)(A-C)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)(D-F)在荷皮下實(shí)體瘤裸鼠模型上介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)紅色螢光蛋白的效率。
[0044]圖12是定性評(píng)價(jià)荷皮下實(shí)體瘤裸鼠模型靜脈注射納米給藥系統(tǒng)48h后腫瘤細(xì)胞內(nèi)目的基因VEGF的mRNA，其中，
[0045]1、2、3、4分別代表空白對(duì)照、載對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、載治療基因的未修飾納米給藥系統(tǒng)和載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤IE向納米給藥系統(tǒng)，Adobe Photoshop CS3對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行半定量。
[0046]圖13是定性評(píng)價(jià)荷皮下實(shí)體瘤裸鼠模型靜脈注射納米給藥系統(tǒng)48h后腫瘤細(xì)胞內(nèi)目的基因VEGF的蛋白表達(dá)，其中，
[0047]1、2、3、4分別代表空白對(duì)照、載對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、載治療基因的未修飾納米給藥系統(tǒng)和載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤IE向納米給藥系統(tǒng)，Adobe Photoshop CS3對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行半定量。
[0048]圖14是定量評(píng)價(jià)納米給藥系統(tǒng)對(duì)皮下移植腫瘤生長(zhǎng)抑制效率，其中，
[0049]A:體積變化；B:第28d腫瘤稱重；C:腫瘤生長(zhǎng)抑制效果組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)；
[0050]*P〈0.05 ;**P〈0.01 ;***P〈0.001 ;淺色星代表載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)與其它組間差異的顯著性；黑色星代表載治療基因的未修飾納米給藥系統(tǒng)與其它組間差異；灰色星代表載對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)與其它組間差異；斜線表示差異不顯著。
[0051]圖15是定性檢測(cè)腫瘤血管密度探討腫瘤生長(zhǎng)抑制機(jī)制；腫瘤功能性血管通過(guò)綠色螢光共價(jià)連接的蕃茄凝集素標(biāo)記；腫瘤相關(guān)血管則通過(guò)識(shí)別血管性血友病因子的抗體進(jìn)行標(biāo)記，其中，
[0052]A、B、C、D分別為生理鹽水組、載對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、載治療基因的未修飾納米給藥系統(tǒng)和載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
【具體實(shí)施方式】[0053]實(shí)施例1
[0054]將聚賴氨酸溶于適量甲醇中配制成10mg/ml的溶液,取IOOii I于西林瓶中吹干；將聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶于適量的0.035MpH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318 U I聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，制得聚賴氨酸-聚乙二醇(DGL-PEGltl) ；pHLIP的N-末端連接一個(gè)半胱氨酸，形成含有游離巰基的pHLIP。再將pHLIP肽溶于適量二甲基亞砜中，配制成lmg/ml的多肽溶液，取182 ill加入到聚賴氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入500 ill pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，將制得的聚賴氨酸-聚乙二醇-多肽(Dgl-PEgic1-PHlIP1)轉(zhuǎn)移到MWCO5000超濾離心管中，12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體。
[0055]實(shí)施例2 [0056]將聚賴氨酸溶于適量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取IOOyl于西林瓶中吹干；將聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶于適量的0.035MpH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318 U I聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，制得聚賴氨酸-聚乙二醇(DGL-PEGltl);pHLIP的N-末端連接一個(gè)半胱氨酸，形成含有游離巰基的pHLIP。再將pHLIP肽溶于適量二甲基亞砜中，配制成lmg/ml的多肽溶液，取182 ii I加入到聚賴氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入500 ii I pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液,于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，將制得的聚賴氨酸-聚乙二醇-多肽(Dgl-PEgiq-PHlIP1)轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中，12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體，超純水復(fù)溶到離心管中，冷凍干燥，取Img產(chǎn)物500重水溶解并轉(zhuǎn)移至核磁管中，以聚乙二醇純品作為對(duì)照進(jìn)行核磁共振氫譜表征。
[0057]實(shí)施例3
[0058]將聚賴氨酸溶于適量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取IOOyl于西林瓶中吹干；將聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶于適量的0.035MpH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318iil聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，制得聚賴氨酸-聚乙二醇(DGL-PEGltl), —半轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中，12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500，制得未修飾載體，超純水復(fù)溶到離心管中；pHLIP的N-末端連接一個(gè)半胱氨酸，形成含有游離巰基的pHLIP。另一半繼續(xù)反應(yīng)，將pHLIP肽溶于適量二甲基亞砜中，配制成lmg/ml的多肽溶液，取91 加入到聚賴氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入250 Ul pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，將制得的聚賴氨酸-聚乙二醇-多肽(Dgl-PEgiq-PHlIP1)轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中，12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體，將載體用超純水復(fù)溶到離心管中；取未修飾載體和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體，以PHLIP多肽純品和空白溶劑作為對(duì)照進(jìn)行紫外光譜表征。
[0059]實(shí)施例4
[0060]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 y g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。[0061]實(shí)施例5
[0062]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 ii g/ml，將新鮮制得的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。取適量新鮮制得的載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)于銅片上加熱晾干，冷凍電鏡下觀察載治療基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的外觀形態(tài)和粒徑。
[0063]實(shí)施例6
[0064]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為1:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0065]實(shí)施例7
[0066]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為2:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0067]實(shí)施例8
[0068]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為4:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0069]實(shí)施例9
[0070]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為8:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0071]實(shí)施例10
[0072]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為16:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0073]實(shí)施例11
[0074]將肝素鈉溶解在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為32:1，分別制得載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
[0075]實(shí)施例12
[0076]稱取0.14g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入電泳液I X TAE，加入10 ill 500iig/ml溴乙啶，微波加熱至沸，使瓊脂糖完全溶解，室溫放置約50° C，倒入電泳槽中，置入梳子，冷凝成凝膠。新鮮制備(I)載治療基因的含不同量肝素的納米給藥系統(tǒng)、(2)載治療基因的不含肝素的納米給藥系統(tǒng)、(3)載治療基因的含不同量肝素的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、(4)載治療基因的不含肝素的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。將各組樣品加入至凝膠中，并以游離治療基因作為對(duì)照，加入基因分子量標(biāo)記物，開啟電源，電壓為100V，約25min停止，紫外燈下觀察基因的遷移。
[0077]實(shí)施例13
[0078]新鮮制備(I)載治療基因的含不同量肝素的納米給藥系統(tǒng)、(2)載治療基因的不含肝素的納米給藥系統(tǒng)、(3)載治療基因的含不同量肝素的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)、(4)載治療基因的不含肝素的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。馬爾文納米粒度分析儀表征未修飾的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的粒徑和e電位。
[0079]實(shí)施例14
[0080]治療基因用綠色熒光探針Y0Y0-1標(biāo)記?；蛴?.05M pH 8.0Tris緩沖液稀釋到2mg/ml，取200iil加入到60 0.1mM的Y0Y0-1水溶液，基因與熒光探針體積比為10:3混合，室溫避光孵育60min ;以此標(biāo)記了 Y0Y0-1的治療基因制備載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。將肝素鈉溶解在PH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到上述新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為2:1，分別制得螢光標(biāo)記的載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-74 02細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH 7.4環(huán)境下該細(xì)胞模擬“中性環(huán)境正常細(xì)胞”，pH 6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”;采用新鮮制備的上述系統(tǒng)分別以PH 6.0和pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋；然后分別與“中性環(huán)境正常細(xì)胞”和“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育5min，劑量為g每孔，用OLYMPUS IX 71顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)合結(jié)果并拍照。
[0081]實(shí)施例15
[0082]治療基因用紅色熒光探針Y0Y0-3標(biāo)記。基因用0.05M pH 8.0Tris緩沖液稀釋到2mg/ml，取200iil加入到60iU 0.1mM的Y0Y0-3水溶液，基因與熒光探針體積比為10:3混合，室溫避光孵育60min ;以此標(biāo)記了 Y0Y0-3的治療基因制備載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。將肝素鈉溶解在PH 7.4磷酸鹽緩沖液中，稀釋成IOOy g/ml，分別加入到上述新鮮制得的載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)中，使肝素與治療基因的質(zhì)量比為2:1，分別制得螢光標(biāo)記的載治療基因的含肝素的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH 6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”，采用麥胚凝集素連接的螢光探針標(biāo)記細(xì)胞膜；采用新鮮制備的納米給藥系統(tǒng)以PH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋，與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育5min，劑量為5 u g每孔，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)合結(jié)果并拍照。
[0083]實(shí)施例16
[0084]治療基因用紅色熒光探針Y0Y0-3標(biāo)記?；蛴?.05M pH 8.0Tris緩沖液稀釋到2mg/ml，取200iil加入到60 0.1mM的Y0Y0-3水溶液，基因與熒光探針體積比為10:3混合，室溫避光孵育60min。以此標(biāo)記了 Y0Y0-3的治療基因制備載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”，采用麥胚凝集素連接的螢光探針標(biāo)記細(xì)胞膜；采用新鮮制備的納米給藥系統(tǒng)以PH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋，與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育lOmin，劑量為5 y g每孔，用共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)吞結(jié)果并拍照。
[0085]實(shí)施例17
[0086]治療基因用紅色熒光探針Y0Y0-3標(biāo)記?；蛴?.05M pH 8.0Tris緩沖液稀釋到2mg/ml，取200iil加入到60 0.1mM的Y0Y0-3水溶液，基因與熒光探針體積比為10:3混合，室溫避光孵育60min。以此標(biāo)記了 Y0Y0-3的治療基因制備載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”，采用Lysotracker標(biāo)記與靜電吸附介導(dǎo)內(nèi)吞有關(guān)的酸性細(xì)胞器；采用新鮮制備的納米給藥系統(tǒng)以pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋，與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育15min，劑量為g每孔，用共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)吞結(jié)果并拍照。
[0087]實(shí)施例18
[0088] 治療基因用紅色熒光探針Y0Y0-3標(biāo)記?；蛴?.05M pH 8.0Tris緩沖液稀釋到2mg/ml，取200iil加入到60 0.1mM的Y0Y0-3水溶液，基因與熒光探針體積比為10:3混合，室溫避光孵育60min。以此標(biāo)記了 Y0Y0-3的治療基因制備載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH
6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”，采用Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核；采用新鮮制備的納米給藥系統(tǒng)以pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋，與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育20min，劑量為5 y g每孔，用共聚焦顯微鏡觀察入核結(jié)果并拍照。
[0089]實(shí)施例19
[0090]以編碼綠色螢光蛋白基因作為報(bào)告基因，以報(bào)告基因代替治療基因，將報(bào)告基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOy g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與報(bào)告基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載報(bào)告基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，pH 6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”;采用新鮮制備的上述系統(tǒng)以pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋；然后分別與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育2h后，用新鮮培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48h，劑量為5 u g每孔，用OLYMPUSIX 71顯微鏡觀察綠色螢光蛋白表達(dá)結(jié)果并拍照。
[0091]實(shí)施例20
[0092]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 y g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以陰性對(duì)照基因代替治療基因，將陰性基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOy g/ml，將新鮮制得的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與陰性對(duì)照基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載陰性對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以Bel-7402細(xì)胞作為細(xì)胞模型，PH 6.0環(huán)境下該細(xì)胞模擬“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”;采用新鮮制備的上述系統(tǒng)以pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋；然后分別與“酸性環(huán)境腫瘤細(xì)胞”孵育2h后，用新鮮培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48h。Trizol試劑提取全RNA。260nm處UV_vis法確定RNA濃度。采用TaKaRa one-step RNA PCR 試劑盒取 0.5mg 全 RNA 進(jìn)行 RT-PCR。GAPDH RNA 作為內(nèi)參；VEGF引物序列為:正向，5 ’ -GGCAG AATCATCACG AAGTG GTG-3，;反向，5 ’ -GGGTC TCGAT TGGATGGCAG TAG-3’ ；利用這些引物生成VEGF265個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物；RT_PCR條件為:反轉(zhuǎn)錄，42。C*45min 和 85。OlOmin ;變性，95。C*3min ;擴(kuò)增 40 循環(huán)，95。C*12s;退火，62。Cfor 40s ;反應(yīng)后,產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。結(jié)果采用AdobePhotoshop CS3定量。[0093]實(shí)施例21
[0094]Balb/c裸鼠腹腔注射10%水合氯醛(5ml/kg)麻醉，Bel-7402細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于Hank’s液中，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度至2~4X 107/ml。將人肝腫瘤細(xì)胞株以包含2~8X IO6個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘤細(xì)胞的0.1~0.2ml細(xì)胞懸液接種于裸鼠背側(cè)部近腋下部皮下。
[0095]實(shí)施例22
[0096]DGL-PEG 或 DGL-PEG-pHLIP (2mg DGL/ml 溶于 IOOmM HEPES 8.3)與近紅外螢光探針NIR 783 (5mg/ml 二甲基甲酰胺溶液)摩爾比為1:5，室溫下反應(yīng)211，MWCO 3000超濾純化，12000rpm離心30minX3次以除去未反應(yīng)的探針。以此突光探針標(biāo)記的載體制備納米給藥系統(tǒng)。將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 u g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。選取皮下腫瘤直徑大于0.5cm且體重相近的荷瘤裸鼠兩只，尾靜脈注射荷Bel-7402人肝癌細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型，劑量為30i!g基因每鼠，在2h和4h，實(shí)施動(dòng)物麻醉，活體成像法測(cè)定各組的體內(nèi)的分布。
[0097]實(shí)施例23
[0098]以編碼紅色螢光蛋白基因作為報(bào)告基因，以報(bào)告基因代替治療基因，將報(bào)告基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOy g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與報(bào)告基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載報(bào)告基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。尾靜脈注射荷Bel-7402人肝癌細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型，劑量為30 y g基因每鼠，48h后取出腫瘤，冷凍切片，切片厚度20 iim，DAPI復(fù)燃，用OLYMPUS IX 71顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的紅色螢光蛋白表達(dá)結(jié)果并拍照。
[0099]實(shí)施例24
[0100]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOii g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以陰性對(duì)照基因代替治療基因，將陰性基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOy g/ml，將新鮮制得的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與陰性對(duì)照基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載陰性對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)；尾靜脈注射荷Bel-7402人肝癌細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型，48h后取出腫瘤，劑量為30 Ug基因每鼠，Trizol 試劑提取全 RNA ；260nm 處 UV-vis 法確定 RNA 濃度；采用 TaKaRa one-step RNAPCR試劑盒取0.5mg全RNA進(jìn)行RT-PCR ；GAPDH RNA作為內(nèi)參；VEGF引物序列為:正向，5’_GGCAGAATCA TCACG AAGTG GTG-3’ ；反向，5’ -GGGTCTCGAT TGGAT GGCAG TAG-3’ ；利用上述引物生成VEGF265個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。RT-PCR條件為:反轉(zhuǎn)錄，42° C*45min和85。OlOmin;變性，95° C*3min ;擴(kuò)增40循環(huán)，95° C*12s;退火，62° C for 40s ;反應(yīng)后，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。結(jié)果采用Adobe Photoshop CS3定量。
[0101]實(shí)施例25
[0102]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 y g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以陰性對(duì)照基因代替治療基因，將陰性基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOii g/ml，將新鮮制得的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與陰性對(duì)照基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載陰性對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。尾靜脈注射荷Bel-7402人肝癌細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型，劑量為30 y g基因每鼠，48h后取出腫瘤，腫瘤樣品液氮下研磨，加入RIPA強(qiáng)裂解液，冰上超聲400W共lOmin，14000g離心5min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度；12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上樣45 y g蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉2h，VEGF 一抗室溫孵育過(guò)夜，TBST和TBS分別清洗兩次和一次，二抗室溫下孵育2h,曝光。采用Adobe Photoshop對(duì)蛋白條帶定量。
[0103]實(shí)施例26
[0104]將治療基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成100 y g/ml，將新鮮制得的未修飾載體溶液或者微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液分別加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與治療基因的質(zhì)量比·為6:1，渦旋30s，制成載治療基因的納米給藥系統(tǒng)和微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。以陰性對(duì)照基因代替治療基因，將陰性基因溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成IOOy g/ml，將新鮮制得的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體溶液加入到基因溶液中，使聚賴氨酸與陰性對(duì)照基因的質(zhì)量比為6:1，渦旋30s，制成載陰性對(duì)照基因的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)；采用尾靜脈注射給藥，在皮下腫瘤體積達(dá)到150mm3后第0、6、12、18、24d給藥，共5次，每次注射含30y g基因的小干擾RNA納米載藥系統(tǒng)(系統(tǒng)中DGL與基因的質(zhì)量比為6:1)，或同等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)中，如遇到以下任一情況，則施以安樂(lè)死手術(shù):(1)動(dòng)物體重下降至給藥前85%以下；
(2)腫瘤任一方向長(zhǎng)度超過(guò)2cm ; (3)動(dòng)物狀況虛弱不能進(jìn)食；(4)腫瘤潰瘍腐爛。第一次給藥28d后，對(duì)所有動(dòng)物施行安樂(lè)死手術(shù)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。荷皮下肝腫瘤裸鼠按照上述方式分組并給藥，每組12只裸鼠。每隔Id記錄皮下腫瘤的最長(zhǎng)徑與最短徑(第Od為第一次給藥)，以下面公式計(jì)算腫瘤體積，比較各組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制效率的差異。
[0105]V=a2XbX /6, a是最長(zhǎng)徑，b是最短徑
[0106]實(shí)施例27
[0107]在小干擾RNA納米載藥系統(tǒng)對(duì)皮下肝腫瘤生長(zhǎng)抑制效果考察實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組動(dòng)物施行安樂(lè)死，并獲得各組具代表性腫瘤樣品，石蠟包埋，進(jìn)行免疫染色;Alexa Fluor555紅色熒光修飾的CD34抗體標(biāo)記切片上的腫瘤相關(guān)血管；生物素化番茄凝集素結(jié)合腫瘤新生的功能血管，采用Alexa Fluor 488綠色突光連接的鏈霉素識(shí)別。
【權(quán)利要求】
1.一種微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽和治療基因組成，所述多肽修飾高分子材料包封治療基因自組裝形成納米粒; 其中， 所述高分子材料與聚乙二醇的摩爾比是1:10， 所述高分子材料與多肽的摩爾比是1:1， 所述高分子材料與治療基因的質(zhì)量比是6:1。
2.按權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的高分子材料為表面富氨基的聚賴氨酸型樹狀分枝物，選自聚賴氨酸型樹狀分枝物。
3.按權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述聚乙二醇選自馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亞胺。
4.按權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述多肽是序列為 AEQNPIY WARYADffLFTTPLLLLDLALLV DADEGT 的 pHLIP 肽，所述 pHLIP肽源于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的跨膜螺旋蛋白C。
5.按權(quán)利要求4所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述PHLIP肽在微酸環(huán)境下插入細(xì)胞膜形成跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。
6.按權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述治療基因選自可特異性沉默腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因或其它所有具有抗腫瘤效果的基因。·
7.按權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述納米給藥系統(tǒng)表面結(jié)合肝素形成表面負(fù)電的納米給藥系統(tǒng)。
8.按權(quán)利要求7所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述肝素與納米給藥系統(tǒng)中的治療基因的質(zhì)量比為1:1~32:1。
9.權(quán)利要求1所述的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括步驟: 將高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┘状贾信渲瞥蓛?chǔ)備液，取適量于西林瓶中吹干，稱取適量的聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶解到pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物摩爾比為1:10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)后；稱取適量的pHLIP肽溶于適量二甲基亞砜中配制成適宜濃度的溶液，加入到高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物一聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺一聚乙二醇3500 —琥珀酰亞胺溶液中，與高分子材料聚賴氨酸型樹狀分枝物摩爾比1:1，再加入pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液，一定溫度下反應(yīng)24h，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向載體，轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇3500和多肽pHLIP ;再與治療基因以質(zhì)量比6:1渦旋反應(yīng)30s，制得微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求1的微酸環(huán)境靶向多肽修飾的腫瘤靶向納米給藥系統(tǒng)在制備靶向治療人或動(dòng)物的腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K9/14GK103705465SQ201210380990
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月9日
【發(fā)明者】韓亮, 蔣晨 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)