專利名稱：一種治療癌癥的組合藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種治療癌癥的組合藥物。
背景技術(shù)：
癌癥是各種惡性腫瘤的統(tǒng)稱，其細(xì)胞的生長和分裂處于失控狀態(tài)，能侵入正常組織，經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)或腔內(nèi)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)離其起源的部位生長，嚴(yán)重挑戰(zhàn)人類健康和生命安全。常見癌癥包括肝癌、腸癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、腦腫瘤、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、血癌與骨癌等。在世界范圍內(nèi)，其中殺傷力最強(qiáng)的是肺癌、胃癌和肝癌，分別約占癌癥死亡人數(shù)的18%、10%和9%。在我國肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血 病、惡性淋巴瘤、鼻咽癌等是常發(fā)性癌癥，且以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌最為多見。癌癥的治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、祀向治療、免疫治療、激素治療及血管生成抑制劑療法等。其中前三者為目前臨床治療的主要手段，根據(jù)病人癌癥種類、位置及所處的時期而采用不同的療法。而放療、化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對人體正常細(xì)胞也有損傷，副作用大且患者生活質(zhì)量差、生存率低。因此，篩選高效低毒的抗癌藥物一直是癌癥治療的重要研究領(lǐng)域。設(shè)計專門針對腫瘤細(xì)胞特定信號途徑或特定癌細(xì)胞靶位點的藥物，近年來越來越受到人們的極大關(guān)注。隨著研究者對細(xì)胞死亡現(xiàn)象本質(zhì)的探究，尤其是對細(xì)胞凋亡分子機(jī)理的闡明，使人們對抗癌藥物的篩選及其作用機(jī)理有了全新的認(rèn)識。有目的地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡已成為一種治療腫瘤的有效手段。索拉非尼(Sorafenib，分子式C21H16ClF3N4O3,分子量 4M. 83，CAS 號 475207_59_1 )，是人工合成的小分子化合物，已被FDA正式批準(zhǔn)用于腎癌和肝細(xì)胞癌的臨床治療藥物。索拉非尼是個典型的酪氨酸激酶抑制劑，可有效抑制Raf激酶活性，阻斷Ras/ Raf/MEK/ ERK和RTK信號途徑，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)索拉菲尼可抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖，減小腫瘤的體積，還可通過抑制RET磷酸化抑制HEK細(xì)胞的增殖；索拉非尼還可通過下調(diào)Mcl-1、上調(diào)Bim水平誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡；在肝細(xì)胞癌模型中，索拉非尼通過抑制Ras/ Raf/MEK/ ERK和RTK信號途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成。ABT-263 商品名Navitoclax 分子式=C47H55ClF3N5O6S3,分子量974. 6I。ΑΒΤ-263是一種口服形式具有ΒΗ3結(jié)構(gòu)域的化學(xué)合成小分子物質(zhì)，其為Bcl-2家族蛋白靶向抑制齊U，與該家族眾多BH結(jié)構(gòu)域抑凋亡蛋白如Bcl-xL、Bcl-2及Bcl_w都有很強(qiáng)的親和性。ABT-263可以打斷Bcl-2/Bcl-xl與促凋亡蛋白的相互作用，引發(fā)Bax移位，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，繼而引起凋亡。目前主要用于治療淋巴癌，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，現(xiàn)已處于II期臨床試驗階段
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種治療癌癥的組合藥物。本發(fā)明的體內(nèi)和體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼和ABT-263聯(lián)合用藥能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，對癌癥治療具有顯著療效，所取得的抗癌效果具有協(xié)同和增效作用，是一種高效低毒的抗癌藥物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種治療癌癥的組合藥物，由索拉非尼和ABT-263組成。本發(fā)明在初步實驗中發(fā)現(xiàn)，索拉非尼和ABT-263的摩爾比為(O. 75 15) :1時，有良好的效果。所述的癌癥為肝癌、胃癌或結(jié)直腸癌。本發(fā)明的實驗研究發(fā)現(xiàn)，6μM索拉非尼和0·4μMABT-263對肝癌細(xì)胞BEL7402、結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116具有良好的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的效果，而對正常細(xì)胞L02影響不明顯。本發(fā)明的另一個目的是在于提供上述組合物在制備治療或預(yù)防惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明可用于誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞，不僅限于實例中所列舉的癌細(xì)胞類型。


圖I ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞存活率的影響 圖2 ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響
圖3 ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用對正常細(xì)胞形態(tài)的影響 圖4平板克隆實驗顯示ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞殺傷作用 圖5流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡
圖6 HCT116移植的裸鼠異種模型，腫瘤生長曲線與重量分析 圖7 TUNEL分析HCT116移植的裸鼠異種模型 圖8腫瘤異種移植模型的裸鼠體重分析
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。所有實施例所用細(xì)胞的培養(yǎng)、藥品的添加以及癌細(xì)胞凋亡均按以下方法進(jìn)行。一、材料
I.細(xì)胞株肝癌細(xì)胞BEL-7402、Huh7、!fepG2，胃癌細(xì)胞株AGS，結(jié)直腸癌細(xì)胞HCTl 16、DLDl，正常腎上皮細(xì)胞HEK293T，正常肝細(xì)胞L02，人正常包皮成纖維細(xì)胞株HFF。2.試劑ABT-263購自香港Active biochemicals公司；索拉非尼購自香港Acctive biochemicals公司;胎牛血清產(chǎn)自美國Hyclone公司；McCoy’ 5A培養(yǎng)基粉末產(chǎn)自北京ABChem公司；DMEM培養(yǎng)基粉末、青霉素鏈霉素產(chǎn)自美國Gibico公司；PBS粉末購自武漢飛羿科技；PI產(chǎn)自美國BIPEC Biopharma公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑FuGENETMHD產(chǎn)自瑞士羅氏公司；轉(zhuǎn)染試劑速爾-Super購自敏航科技公司。3.儀器5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，低溫超速離心機(jī)(Haraeus公司，德國),倒置突光顯微鏡(Olympus,日本),透射電子顯微鏡(日立一H 600型)。
二、主要試劑配制
I)細(xì)胞培養(yǎng)基McCoy’ 5A與DMEM
將購置的DMEM與McCoy’ 5A培養(yǎng)基粉末完全溶解于去離子水中，磁力攪拌器攪拌至粉末完全溶解，加入適量NaHCO3 (每升DMEM加入3. 7克NaHCO3,
每升McCoy’ 5A加入2. 2克NaHCO3),繼續(xù)攪拌至溶解完全；加入HCl調(diào)節(jié)pH 值至7. 04左右，于超菌操作臺中使用無菌濾器抽濾培養(yǎng)基，4°C保存。待用時 加入10%胎牛血清及1%的青霉素/鏈霉素,混勻后即可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 2 )青霉素/鏈霉素雙抗溶液
使用PBS將青霉素和鏈霉素配制成10，000U/ml母液，濾膜過濾除菌，_20°C保存。使用時以100U/ml工作濃度加入培養(yǎng)基中。
3)胰酶
將胰酶粉末溶于D-hank’ s緩沖液(pH8. 5)，配成0. 25%母液，4°C溶解過夜；待溶解完全后抽濾除菌，與滅菌后的0. 02%EDTA (pH8. 5)等體積混勻，4°C保存。4) PBS 溶液
140mM NaCl、2. 7mM KCl、1.8mM KH2PO4UOmM Na2HPO4JnAddH2O 攪拌均勻，PH調(diào)至7. 4，加入0. P/oDEPC攪拌過夜，高壓蒸汽滅菌，4°C保存。5)1%結(jié)晶紫配制
由無水乙醇配制0. 5%濃度5X母液，室溫避光保存，使用前用生理鹽水以1:4 稀釋成IX工作液，避光保存，于24小時內(nèi)使用。三、實驗方法
I、細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存 I)細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存管由液氮罐中取出，立即置于37°c水浴中，快速解凍；后移入IOcm細(xì) 胞培養(yǎng)皿中，加入9ml相應(yīng)培養(yǎng)基；置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2)細(xì)胞傳代
打開生物安全柜通風(fēng)預(yù)處理5分鐘，并用酒精將操作臺擦拭干凈，取出細(xì)胞培 養(yǎng)皿于生物安全柜中操作。用真空泵吸走上清培養(yǎng)基，滅菌PBS清洗2遍；力口 Λ Iml胰酶，左右晃動使其覆蓋整個培養(yǎng)皿底部，吸去胰酶；37°C，5% C02培 養(yǎng)箱中靜置2-3分鐘，取出培養(yǎng)皿，用移液槍吸取6ml細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕吹打；吸 去4ml,最后加入8ml新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3)細(xì)胞凍存
取鋪滿培養(yǎng)皿底部達(dá)80%密度的細(xì)胞，由胰酶消化，于15ml離心管中1500rpm 離心5分鐘，去除上清，血清重懸；以DMSO :血清(含細(xì)胞)=1 9的比例 分裝于2ml凍存管中，完整標(biāo)記細(xì)胞名稱、凍存日期及傳代次數(shù)；-80°C過夜，
之后轉(zhuǎn)入液氣te中凍存。2、藥物處理細(xì)胞方法(6孔板示例)
將細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜使其貼壁。6孔板每孔體系為2ml，加藥組用微量移液器吸取Iml孔中培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，加入藥物并混勻，吸回至對應(yīng)孔中，輕輕搖勻；對照組為不含藥物的培養(yǎng)液。
3、臺盼藍(lán)計數(shù)法
I)將細(xì)胞樣品處理為單細(xì)胞懸液，加入適量臺盼藍(lán)染色液(IOX)，輕輕混勻，小心吸取20 μ I細(xì)胞懸液，快速加入到覆有蓋玻片的血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)室中。2)普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞計數(shù)室中的細(xì)胞，染色后死細(xì)胞顯示藍(lán)色，活細(xì)胞為無色透明。細(xì)胞計數(shù)室一個大方格中的所有活細(xì)胞或死細(xì)胞作為一組數(shù)據(jù)進(jìn)行 記錄。每個細(xì)胞樣品至少需要8組數(shù)據(jù)。3)計算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率=未染色細(xì)胞數(shù)/(藍(lán)色細(xì)胞數(shù)+未染色細(xì)胞數(shù)) X100%。4、平板克隆形成 I)細(xì)胞預(yù)處理
①取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞HCT116、BEL7402與L02，胰蛋白酶消化并 吹打成單個細(xì)胞。②將細(xì)胞懸液稀釋，以六孔板每孔2000個細(xì)胞的密度接種，輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì) 胞分散均勻。37°C 5% C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時，使其貼壁。③待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行藥物處理，HCT116處理24小時而BEL7402與L02處 理48小時后，換回新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10天至出現(xiàn)肉眼可見克隆，
終止培養(yǎng)。2)結(jié)晶紫染色
棄去六孔板中上清培養(yǎng)基，用PBS小心浸洗2次。六孔板每孔加入300 μ I IX結(jié)晶紫工作液，避光染色15分鐘，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。3)計算克隆形成率
將平板倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計數(shù)克隆，計算克隆形成 率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。5、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡峰subGl
1)細(xì)胞接種于六孔板中，待貼壁后用ΑΒΤ-263與Sorafenib處理細(xì)胞；
2)收集藥物處理后的細(xì)胞并用PBS重懸；
3)PBS洗滌細(xì)胞，2000rpm離心5分鐘，重復(fù)一次；
4)Iml預(yù)冷后的75%酒精吹打細(xì)胞沉淀使之成為均一懸液，4°C固定過夜；
5)PBS洗滌固定過的細(xì)胞，3000rpm離心10分鐘，重復(fù)一次；
6)加入400 μ I PBS 重懸細(xì)胞，10 μ I lmg/ml 的 RNase Α,3μ I 10mg/ml 的 PI，避光靜置15分鐘。7)經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，調(diào)式流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長Ex 488nm和發(fā)射波Em 530nm 下檢測。PI紅色熒光使用PI通道(FL2或FL3)檢測。6、癌細(xì)胞異種移植
I) 5周齡雄性BALB/c裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司；
取對數(shù)生長期的HCT116 WT細(xì)胞，胰酶消化，冰冷PBS清洗2次，以去除胎牛血清。PBS調(diào)整細(xì)胞密度為3 X 106/ml。2)在32只裸鼠右側(cè)腋下皮下注射HCT116 WT細(xì)胞懸液O. 2m，建立裸鼠異種移
植模型。
3)將出瘤的32只接種HCT116 WT裸鼠隨機(jī)分為四組，分別灌胃O. 1%DMS0，單藥100mg/kg ABT-263,單藥 25mg/kg Sorafenib,以及雙藥 100mg/kg ABT-263
與25mg/kg Sorafenib ；16只接種HCTl 16 p21_/_裸鼠隨機(jī)分為兩組,分別灌胃
O.1%DMS0,以及雙藥 100mg/kg ABT-263 與 25mg/kg Sorafenib ；16 只 HCTl 16Bax-/-裸鼠與HCT116 p21_/_進(jìn)行同樣分組與給藥。4)接種腫瘤第五天開始灌胃，每兩天灌胃一次。腫瘤出現(xiàn)后每天監(jiān)測裸鼠體重與腫瘤大小并進(jìn)行記錄，腫瘤體積計算公式腫瘤體積=aXb2n/6 (a:瘤體最長徑，
b:瘤體最短徑),并繪制生長曲線。5)給藥20天后，處死裸鼠并取出腫瘤組織，測量并記錄每個腫瘤組織樣品的重 量。每個腫瘤組織樣品各取一部分于4%甲醛溶液中浸泡，以備組織切片TUNEL分析 細(xì)胞凋亡。TUNEL (脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)用于
斷裂DNA 3’ -OH標(biāo)記，方法參照羅氏TUNEL試劑盒。7、統(tǒng)計分析
發(fā)明中所有數(shù)據(jù)均為三次獨立實驗平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，由Student’s t test評估兩 組數(shù)據(jù)間的顯著水平差異。P <0.05代表有統(tǒng)計學(xué)意義。四、實驗結(jié)果
實驗分對照組、實驗組。采用不加藥物、單一藥物和兩種藥物同時添加，通過對癌細(xì)胞、正常細(xì)胞以及癌細(xì)胞異種移植的影響檢測兩種藥物聯(lián)合作用的協(xié)同效果。實驗例I :顯微觀察索拉非尼(6μΜ)和ABT-263 (O. 4 μ Μ)聯(lián)合用藥對肝癌細(xì)胞Huh7、!fepG2、Bel7402、結(jié)直腸癌細(xì)胞HCTl 16、DLDl及胃癌細(xì)胞AGS的影響。研究發(fā)現(xiàn)，6 μ M索拉非尼單獨作用于肝癌細(xì)胞Huh7、H印G2、BEL7402,結(jié)直腸癌細(xì)胞DLDl與胃癌細(xì)胞AGS 48小時，或結(jié)直腸癌細(xì)胞HCTl 16 24小時，細(xì)胞存活均未發(fā)生明顯變化。但用0.4μΜ ABT-263與6 μ M索拉非尼聯(lián)合處理以上癌細(xì)胞時，細(xì)胞存活率顯著降低，其中HCT116細(xì)胞尤其明顯，聯(lián)合處理24小時后，細(xì)胞存活率已降至30%左右，相比之下，單獨0.4μΜ的ABT-263并不影響癌細(xì)胞的存活，如圖I所示。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞幾乎全部皺縮變圓，呈漂浮狀，出現(xiàn)大量死亡，如圖2。以上結(jié)果表明ABT-263能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。為了研究這種組合藥物聯(lián)合處理對正常細(xì)胞的毒性，6 μ M索拉非尼與O. 4 μ M
ABT-263聯(lián)合處理正常細(xì)胞L02、HEK293T、HFF，結(jié)果顯示這種聯(lián)合處理不影響正常細(xì)胞的存活圖3。因此，這兩種藥物的聯(lián)合使用對正常細(xì)胞具有較輕副作用。
實驗例2 :平板克隆形成實驗檢測索拉非尼(6 μ Μ)和ΑΒΤ-263 (0.4μ Μ)聯(lián)合用藥對肝癌細(xì)胞Bel7402、結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116及正常肝細(xì)胞L02的影響。平板克隆形成實驗進(jìn)一步證實了 ABT-263可顯著增強(qiáng)索拉非尼的抗腫瘤效 果，如圖4所示。以上結(jié)果表明，ABT-263與索拉非尼具有顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。
實驗例3 :流式細(xì)胞儀檢測ABT-263與索拉非尼聯(lián)合用藥對誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的影響。為進(jìn)一步確定ABT-263協(xié)同索拉非尼誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的方式。我們用0.4μΜΑΒΤ-263、6μΜ索拉非尼單獨處理及雙藥同時處理Huh7、H印G2、BEL7402細(xì)胞48小時及HCTl 16細(xì)胞24小時，之后用PI單染，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡特有的SubGl峰。結(jié)果顯示，以上四種腫瘤細(xì)胞在用兩種藥物分別單獨處理時，其凋亡程度均不顯著，而當(dāng)用兩種藥物聯(lián)合處理時，上述腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡程度均顯著增強(qiáng)，凋亡比率達(dá)60%以上(圖5)。以上結(jié)果說明，ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用，能夠顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，其中HCT116對ABT-263聯(lián)合索拉非尼誘導(dǎo)的凋亡作用最為敏感。
實驗例4 ABT-263與索拉非尼聯(lián)合作用對裸鼠腫瘤異種移植的影響。為進(jìn)一步探索ABT-263與索拉非尼聯(lián)合在動物體內(nèi)的抗腫瘤作用，我們建立了裸鼠腫瘤異種移植模型。異種移植第5天開始,按照裸鼠體重以ABT-263 100 mg/kg,索拉非尼75mg/kg的濃度，每兩天灌胃一次，第25天處死小鼠取組織樣。HCT116細(xì)胞異種移植模型中，雙藥有顯著的抑瘤效果，ABT-263單藥抑瘤作用微弱，而索拉非尼單藥抑瘤效果也僅 為雙藥的一半，如圖6所示。為確定雙藥聯(lián)合對HCT116異種移植腫瘤的抑制是由凋亡造成的，我們進(jìn)行了TUNEL凋亡檢測實驗。如圖7所示，HCT116異種移植模型中，雙藥組TUNEL陽性細(xì)胞(白色箭頭所示褐色區(qū)域)最多，單藥組僅有極微弱TUNEL染色，對照組則全為陰性，這說明該雙藥系統(tǒng)確實在裸鼠體內(nèi)顯著誘導(dǎo)了 HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外，實驗過程中通過監(jiān)測藥物處理后裸鼠體重變化，發(fā)現(xiàn)三種異種移植模型中，雙藥處理組裸鼠體重均沒有發(fā)生顯著降低，如圖8，該結(jié)果說明在實驗濃度下的ABT-263與索拉非尼雙藥聯(lián)合具有較輕的毒副作用。
權(quán)利要求
1.一種治療癌癥的組合藥物，由索拉非尼和ABT-263組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合藥物，其特征在干，由索拉非尼和ABT-263組成，索拉非尼和ABT-263的摩爾比為(O. 75 15) :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的組合藥物，其特征在于，所述的癌癥為肝癌、胃癌或結(jié)直腸癌。
4.權(quán)利要求f3所述組合藥物在制備治療或預(yù)防惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療癌癥的組合藥物，由索拉非尼和ABT-263組成。索拉非尼和ABT-263的摩爾比為(0.75～15)1時，有良好的效果。本發(fā)明的體內(nèi)和體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼和ABT-263聯(lián)合用藥能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，對癌癥治療具有顯著療效，所取得的抗癌效果具有協(xié)同和增效作用，是一種高效低毒的抗癌藥物。
文檔編號A61P35/00GK102836160SQ201210381420
公開日2012年12月26日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者李文化, 李靖茹, 劉鑫, 梅運軍 申請人:武漢大學(xué)