專利名稱：東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽及其編碼序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗菌肽及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽(ranatuerin-2YJ)及其編碼序列和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽又稱肽抗生素，是生物機(jī)體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的最早的免疫活性分子，包括對病原微生物起抑制作用的所有肽類物質(zhì)，具有水解活性的酶類如溶菌酶、殼多糖酶、葡聚糖酶等除外?？咕膹V泛分布于自然界中各類生物體內(nèi)，動物中以昆蟲、兩棲類、哺乳類居多，主要來源于皮膚粘膜、血液、胃腸道、肝、脾等組織器官，具有抗病原體入侵作用。 蛙科動物是自然界中分布最廣泛的兩棲類動物，遍及世界各地，其皮膚潮濕、裸露，給細(xì)菌、病毒等病原微生物提供了良好的滋生和繁衍環(huán)境。蛙科動物的皮膚在維持其生存和適應(yīng)棲息環(huán)境中起著重要的作用，為了適應(yīng)生存環(huán)境，蛙科動物的皮膚中分布了種類繁多、分子結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的生物活性物質(zhì)，主要含有生物胺、生物堿、蟾蜍配基和多肽4大類生物化學(xué)成分，形成了一個巨大的生物活性分子資源庫和藥物資源庫。其中，蛙科動物皮膚抗菌肽是抵抗病原微生物入侵先天防御系統(tǒng)中的重要組成成分，根據(jù)其結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)被劃分為以下類別，即 brevinin-1 和 brevinin-2 家族、esculentin-1 和 esculentin-2家方矣、ranalexin 家方矣、ranatuerin-1 和 ranatuerin-2 家方矣、temporin 家方矣、palustrin 家方矣、tigerinin 家方矣、japonicin-Ι 和 japonicin-2 家方矣、nigrocin-2 家方矣、dybowskin-1 和dybowskin-2 家方矣、melittin 相關(guān)妝和 Caerulein precursor 相關(guān)月太。兩棲類動物皮膚抗菌肽一般由1(Γ50個氨基酸殘基組成，分子量約f 7kDa，分子表面通常帶有正電荷，等電點(diǎn)多大于7，屬于堿性陽離子肽。已報(bào)道的蛙科動物皮膚抗菌肽的信號肽和酸性前肽的序列十分保守，以前體肽形式轉(zhuǎn)錄，最終以成熟肽形式分泌。信號肽有22個疏水氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)位于半胱氨酸-谷氨酸殘基(Cys-Glu)之間，其主要功能是促使活性肽從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外。酸性前肽位于信號肽和成熟肽之間，維持活性肽自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、防止酶解，同時也起到調(diào)節(jié)生物活性的作用。成熟肽位于酸性前肽賴氨酸-精氨酸(Lys-Arg)殘基之后，活性肽成熟過程中，信號肽和酸性前肽被分別切除，通過α-螺旋、β折疊、氨基酸修飾等途徑，最終由皮膚顆粒腺分泌至體外，介導(dǎo)一系列的生物效應(yīng)，可以在不損傷正常細(xì)胞的前提下對細(xì)菌、病毒等病原微生物起殺滅作用。東北林娃廣泛分布于中國東北部的林區(qū)濕地,包括長白山脈、大小興安嶺地區(qū)、張廣才嶺腹地等。從東北林蛙皮膚分泌物中分離得到了多種具有抑菌、抗病毒活性的抗菌肽，都可形成兩親的α -螺旋結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)理不同于傳統(tǒng)的抗生素，它不是通過抑制細(xì)菌代謝過程中某些重要生命物質(zhì)的合成來殺死細(xì)菌，而是直接通過物理方式作用于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)泄漏導(dǎo)致細(xì)菌死亡，因此該類抗菌肽不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，有望成為新一代的抗菌、抗病毒和抗癌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有抗菌活性的東北林蛙皮膚抗菌肽(ranatuerin-2YJ),以及該抗菌肽的編碼序列和制備方法及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)如下
一種東北林娃皮膚分泌的抗菌肽，其氨基酸序列為序列表SEQ ID No. I所述,其分子量為3000. 6道爾頓，等電點(diǎn)9. 7。本發(fā)明還具有如下特征
I、一種編碼東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的完整基因，其核苷酸序列為序列表SEQ IDNo. 2所述。 2、基于如上所述的一種編碼東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的完整基因，編碼東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的核苷酸序，其核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 2第124-207位所述。3、本發(fā)明的東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽采用固相化學(xué)的方法進(jìn)行制備，按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相肽合成程序進(jìn)行人工合成，合成肽經(jīng)反相HPLC島津Shim - pack VP-ODS反相色譜柱4. 6mm X 150mm純化,采用乙腈/水/三氟乙酸溶液洗脫，得到的合成肽純度高達(dá)99%
4、如上所述的一種東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽，在制備治療微生物感染疾病藥物中的應(yīng)用。抗菌肽發(fā)揮抗菌作用是通過本身帶有的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷的吸引而相互接觸，然后通過疏水氨基酸形成跨膜離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)容物流失，造成細(xì)胞死亡。本發(fā)明的抗菌肽ranatUerin-2YJ氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)顯示，其可形成α -螺旋，并具有陽離子性，屬于陽離子抗菌肽，C-端顯示親水性而N-端顯示疏水性，親水和疏水氨基酸殘基分布于螺旋輪兩側(cè)，對抗菌肽活性起關(guān)鍵作用，這些都是抗菌肽所具有的結(jié)構(gòu)特征網(wǎng)。成熟肽的C-端是Rana box,是Rana屬特有的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的抗菌肽(ranatUerin-2YJ)采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行了抑菌活性實(shí)驗(yàn)，并對其溶血活性進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明抗菌肽ranatUerin-2YJ對腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、化膿性鏈球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、蠟樣芽胞桿菌、腸出血性大腸桿菌等G+菌和G_菌均具有較強(qiáng)的抑制活性(見圖4)，10mg/mL抗菌肽ranatuerin-2YJ的溶血率為5. 64%，遠(yuǎn)低于哺乳動物紅細(xì)胞發(fā)生溶血作用時的藥物濃度，其具有顯著的抗菌活性，說明該抗菌肽ranatuerin-2YJ在不破壞哺乳動物細(xì)胞完整性的情況下，其可以抑制部分G+菌和G—菌的生長，顯示出作為新型抗生素藥物的應(yīng)用前景。


圖I為東北林蛙皮膚總RNA提取效果的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(M DNA Marker2000 ；1-3為東北林蛙皮膚總RNA)；
圖2為東北林蛙皮膚抗菌肽基因pr印roranatuerin-2YJ的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M =DNAMarker 2000 ；1 :陰性對照；2 :preproranatuerin_2YJ 基因)；
圖3為抗菌肽ranatuerin-2YJ固相化學(xué)合成的HPLC 圖4為抗菌肽ranatuerin-2YJ瓊脂擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A :腸炎沙門氏菌；B :綠膿桿菌；C :粘質(zhì)沙雷氏菌；D :金黃色葡萄球菌；E :腸出血性大腸桿菌；F :肺炎克雷伯氏桿菌；G 蠟狀芽孢桿菌:化膿性鏈球菌.其中1為抗菌肽ranatuerin-2YJ的抑菌效果；2為陰性對照)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明
實(shí)施例I
抗菌妝 ranatuerin_2YJ 基因 preproranatuerin_2YJ 的克隆
I、引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中收錄的兩棲動物蛙類活性肽基因序列，
設(shè)計(jì)并合成上游引物 XDl 5' -ATGTTCACC(T/A) TGAAGAAA(T/C) -3'，
通用型下游引物XD2 =Oligo d(T) 15，引物由上海生工生物工程有限公司合成。 2、抗菌妝基因 preproranatuerin_2YJ 的 cNDA 克隆
2.I東北林蛙皮膚總RNA的提取采用東北林蛙背部皮膚，經(jīng)超低溫冷凍研磨機(jī)(美國SPEX CertiPrep公司，型號6770)研磨成粉末狀；稱取IOOmg樣品加入ImL Trizol,充分混勻，冰浴5min,離心(12000rpm,4°C) IOmin,取上清；加入等體積預(yù)冷的氯仿,混勻，冰浴5min,離心(12000rpm, 4°C ) IOmin,取上層水相；加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，冰浴IOmin,離心(12000rpm, 4°C ) IOmin,小心棄去上清液；用ImL 75%乙醇洗漆兩次，每次12000rpm 4°C離心lOmin，吹干殘留的乙醇液，加入50 μ L DEPC水溶解沉淀，獲得東北林蛙皮膚總RNA。取5μ 東北林蛙皮膚總RNA提取液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度和濃度。結(jié)果清晰可見28SRNA、18SRNA和5SRNA三條帶，且紫外分光光度計(jì)測定OD26Q/OD28Q比值在I. 90 2. Ol之間，表明所獲得的東北林蛙皮膚總RNA無降解，完整性良好，且無明顯蛋白質(zhì)和DNA污染。2. 2 RT-PCR :取3 μ L提取的東北林蛙皮膚總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cNDA，反轉(zhuǎn)錄體系
如下所示
權(quán)利要求
1.一種東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列為序列表SEQ IDNo. I所述，其分子量為3000. 6道爾頓，等電點(diǎn)9. 7。
2.一種編碼東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的完整基因，其特征在于其核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 2所述。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種編碼東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的完整基因，其特征在于編碼東北林娃皮膚分泌的抗菌肽的核苷酸序，其核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 2第124-207位所述。
4.一種如權(quán)利要求I所述的東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽的制備方法如下采用固相化學(xué)的方法進(jìn)行制備，按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相肽合成程序進(jìn)行人工合成，合成肽經(jīng)反相HPLC島津Shim - pack VP-ODS反相色譜柱4. 6mm X 150mm純化,采用乙腈/水/三氟乙酸溶液洗 脫，得到的合成肽純度高達(dá)99%。
5.如權(quán)利要求I所述的一種東北林娃皮膚分泌的抗菌肽，其特征在于在制備治療微生物感染疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種東北林蛙皮膚分泌的抗菌肽及其編碼序列和應(yīng)用。所述的抗菌肽氨基酸序列為序列表SEQIDNo.1所示，分子量為3000.6道爾頓，等電點(diǎn)為9.7。該抗菌肽基因完整DNA序列見序列表SEQIDNo.2所示，該抗菌肽可通過氨基酸合成儀進(jìn)行制備，其具有顯著的抗菌活性，且不會對哺乳動物的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用，可用于開發(fā)制備抗菌藥物。
文檔編號A61P31/04GK102875659SQ20121038160
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者徐義剛, 肖向紅, 吳巖, 劉忠梅, 劉新亮, 楊淑靜 申請人:黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心