專利名稱：基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制與凋亡中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種人源而/7的新用途。特別是人源而/7基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制與凋亡中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤(glioma)是由神經(jīng)外胚層分化而來的膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜等)發(fā)生的腫瘤。膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率位于第一位，約占45%左右。膠質(zhì)瘤的治療問題是神經(jīng)外科中較為棘手的一個問題，由于其死亡率高，預(yù)后較差，無法控制的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡減慢，腫瘤細(xì)胞侵襲性強等使腫瘤的治療面臨巨大的困難，患病后手術(shù)加放化療的平均生存期僅為8 11個月。目前腫瘤治療主要有以下幾種方法手術(shù)治·療、化學(xué)藥物、治療放射治療、光動力治療。但這四種治療方法對大腦損傷性大，易復(fù)發(fā)，對患者機體消耗大，也無法起到根治目的。樹突狀細(xì)胞因子(dendritic cell factor I, dcfl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59,是單次跨膜蛋白。根據(jù)基因芯片GDS2853分析顯示，隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，dcfl基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)。同時，dcfl基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除而/7后，貧/每7 (膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)表達(dá)量上調(diào)。2008年Wang，L; et al研究證明，在神經(jīng)干細(xì)胞中，過量表達(dá)而/7，可維持神經(jīng)干細(xì)胞未分化狀態(tài)，而沉默ofc/7則能促進神經(jīng)干細(xì)胞的分化。2012年Li, X; et al通過小分子microRNA-351,下調(diào)而/7的表達(dá)后，神經(jīng)干細(xì)胞系C17. 2向膠質(zhì)方向分化。以上結(jié)果都表明，而/2表達(dá)量下調(diào)可能促進膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種人源而/2基因在誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于提供人源i/c/7基因在抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增值中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供人源而/2基因在抑制腫瘤生長中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明通過培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，運用Lipofectamine 2000Transfection Reagent陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，在U251細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP_N2和PEGFP-N2-DCF1，使其分別表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作為對照。發(fā)綠色突光的融合蛋白可指示ofc/V在細(xì)胞中的分布，進一步運用ofc/V —抗和膠體金二抗，可在電鏡下觀察膠體金顆粒，從而確定其亞細(xì)胞定位。通過CCK8試劑盒，檢測細(xì)胞增殖能力。JC-I染料檢測細(xì)胞線粒體膜電位。電鏡和原子力顯微鏡觀察線粒體外觀，判斷線粒體是否發(fā)生病變。Western檢測過表達(dá)而/7后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量是否發(fā)生變化，從而在凋亡機制上做初步探索。運用裸鼠腫瘤異位移植技術(shù)，在體內(nèi)層面判斷而/7基因?qū)δz質(zhì)瘤的治療作用。
本發(fā)明通過免疫電鏡、原子力顯微鏡、CCK8增殖檢測、JC-I染色、裸鼠腫瘤異位移植等方法對而/7誘導(dǎo)U251細(xì)胞系凋亡做出判斷，結(jié)果表明dcfl通過定位于線粒體引起線粒體結(jié)構(gòu)病變，膜電位下降，從而引起凋亡相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生改變，最終導(dǎo)致凋亡。裸鼠實驗表明，而/7能顯著減小膠質(zhì)瘤的腫瘤體積，抑制腫瘤生長。



圖I為-.dcfl基因擴增及重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1酶切鑒定。A圖為以Hela細(xì)胞cDNA為模板，通過PCR法擴增獲得人源dcfl基因片段，全長972bp。圖中最左邊泳道為DNAMarkerCSM#0311),泳道I為dcfl基因PCR后擴增產(chǎn)物。B圖為重組質(zhì)粒pEGFP_N2_DCFl酶切鑒定圖。泳道I為空載PEGFP-N2經(jīng)EcoRI單酶切，2_5為陽性克隆經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后釋放出目的條帶ifc/i(972bp)及空載片段(4700bp)。表明重組質(zhì)粒pEGFP_N2_DCFl構(gòu)建成功，經(jīng)測序驗證正確后用于后續(xù)實驗方案。圖2為U251細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1。EGFP-DCFI融合蛋白(圖A, C)呈現(xiàn)核外點狀分布，B圖為DAPI細(xì)胞核染色，E圖DCFl蛋白免疫熒光，C圖為A圖與B圖疊加。F圖為D圖與E圖疊加。(放大倍數(shù)200倍；標(biāo)尺50um)
圖3為EGFP-DCF1融合蛋白與線粒體染料MitoTracker-Red共定位。EGFP-DCF1融合蛋白(圖A)與線粒體(圖B)存在共定位，C圖為A圖與B圖的疊加。圖4為'dcfl基因可定位于線粒體。Western檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP_N2_DCFl的U251細(xì)胞系線粒體中有DCFl蛋白的存在(圖A)。DCFl免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCFl的U251細(xì)胞系線粒體處有少量膠體金被標(biāo)記(圖B)。(放大倍數(shù)20000倍；標(biāo)尺500nm)
圖5為在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中過量表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖能力。U251細(xì)胞系過量表'lkdcfl引起細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞皺縮(圖A)，從左至右依次為對照組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒PEGFP-N2組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCFl。CCK8檢測表明dcfl能極顯著降低U251細(xì)胞增殖能力(圖B)，同時也表明dcfl能顯著降低U87MG細(xì)胞系增殖能力，但其抑制效果比U251稍差(圖C)。但i/c/7基因過量表達(dá)對K562，H1299，Hek293T細(xì)胞系增殖能力未有影響。*，Ρ〈0· 1;**，Ρ〈0·05，***，Ρ〈0·001。(放大倍數(shù)100 倍；標(biāo)尺 200um)
圖6為過量表達(dá)可引起U251細(xì)胞系線粒體膜電位下降。U251細(xì)胞系經(jīng)線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP處理后，線粒體膜電位下降，JC-I無法聚集，呈現(xiàn)綠色(圖A)。對照組線粒體膜電位正常，JC-I聚集體呈紅色(圖B)。轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組，JC-I也呈現(xiàn)紅色，大塊綠色為EGFP發(fā)光(圖C)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1 48小時候，JC-I主要呈現(xiàn)綠色，與藥物處理組相似(圖D)，說明過表達(dá)而/7后，U251細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生下降。(放大倍數(shù)100倍；標(biāo)尺200um)
圖7為過表達(dá)而/7引起U251細(xì)胞線粒體腫脹，最終引起細(xì)胞凋亡。(A，D，G)圖為對照，(B，E，H)圖為U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載對照pEGFP-N2，(C，F(xiàn)，I)圖為U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1。(A-C)圖為透射電鏡觀察U251細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對照與空載組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰可見(圖A，B);實驗組細(xì)胞核裂解，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu)，并包含數(shù)個自噬體存在，呈現(xiàn)典型凋亡特征(圖C)。(D-F)圖為透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)。對照與空載組線粒體結(jié)構(gòu)完整，可見嵴結(jié)構(gòu)存在(圖D，E);實驗組中多個線粒體發(fā)生嚴(yán)重腫脹，嵴發(fā)生破裂，存在嚴(yán)重病變(圖F)。(G-I)圖為原子力顯微鏡觀察抽提的U251細(xì)胞線粒體。對照與空載組線粒體尺寸在600nm左右，表面光滑(圖G，H);實驗組線粒體發(fā)生腫脹，尺寸在1600nm左右，且線粒體外膜呈現(xiàn)多孔狀結(jié)構(gòu)，這與線粒體通透性孔開放有關(guān)，表明線粒體功能發(fā)生異常(圖I)。圖8為調(diào)亡相關(guān)重要蛋白Western檢測。結(jié)果表明，過表達(dá)t/c/7后,調(diào)亡關(guān)鍵蛋白procaspase-3酶被剪切成有活性的形式(17kD，19 kD)，抑凋亡基因Bcl_2表達(dá)發(fā)生下調(diào)，促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)。從機制上對而/2引起U251細(xì)胞凋亡做出初步解釋。圖9為裸鼠成瘤實驗結(jié)果表明dcfl能顯著減小膠質(zhì)瘤的體積，抑制腫瘤生長。A圖為接種U251細(xì)胞裸鼠成瘤結(jié)果，B圖為A圖中腫瘤鼠解剖后所得腫瘤體積比較。從左至右分別為注射U251細(xì)胞，注射轉(zhuǎn)染空載對照pEGFP-N2 U251細(xì)胞，注射轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1 U251細(xì)胞。圖中明顯可見實驗組腫瘤體積小于對照組，且在成瘤時間及腫瘤生長速度上也有明顯差異。
具體實施例方式實施例一 'dcfl基因擴增及重組質(zhì)粒PEGFP-N2-DCF1酶切鑒定
I、以HeLa細(xì)胞的cDNA為模版進行PCR擴增，在dcfl弓丨物兩端分別弓I入EcoRI和BamHI酶切位點。上游引物為(5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGGAG-3’)，
下游引物為(5，-CGGGATCCGTAAAATTTCAGAATGAGCA-3’)，Tm 為 53 攝氏度，30 個循環(huán)后獲得大小為972bp的目的片段(圖1A)。2、獲得陽性重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCFl后，對重組子進行雙酶切鑒定。酶切體系中同時添加EcoRI和BamHI兩種酶，對照采用pEGFP_N2 EcoRI單酶切，37攝氏度反應(yīng)2小時，電泳鑒定酶切結(jié)果，在972bp處有條帶釋放，說明而/2片段已插入到陽性重組質(zhì)粒中(圖1B)。實施例二 質(zhì)粒pEGFP-N2-DCFl轉(zhuǎn)染
U251 細(xì)胞系鋪 24 孔板 24 小時后，米用 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP -N2-DCF1。每孔Iul lipo2000，Iug質(zhì)粒pEGFP-N2-DCF1分別溶于50ul無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘后，將兩者混勻，室溫靜置20分鐘。將孔板中培養(yǎng)基更換成400ul無血清DMEMJPA IOOul上述混合產(chǎn)物。37攝氏度培養(yǎng)6小時后，將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清DMEM。轉(zhuǎn)染后48小時檢測熒光發(fā)光情況(圖2A-C)。實施例三細(xì)胞免疫熒光
U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時，棄培養(yǎng)基，PBS洗三次。4%PFA固定10分鐘，PBS洗三次。1% Triton-XlOO通透10分鐘，PBS洗三次。2%BSA_PBS室溫封閉I小時。1%BSA_PBS稀釋DCFl兔源多抗(I: 700)，37攝氏度孵育I小時，PBS洗三次。1%BSA_PBS稀釋TRITC熒光二抗(I: 300)，避光37攝氏度孵育40分鐘，PBS洗三次，熒光顯微鏡觀察(圖2D-F)。實施例四線粒體染料Mitotracker-Red染色
含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基配制Mitotracker-Red工作液(1:1500), 37攝氏度預(yù)熱。棄培養(yǎng)基，PBS洗一次。加入預(yù)熱Mitotracker-Red工作液，37攝氏度孵育30分鐘。棄去染色液，加入預(yù)熱的含10%胎牛血清DMEM，熒光顯微鏡觀察(圖3)。
實施例五Western
細(xì)胞培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，4攝氏度保存的PBS洗三次。置于冰上，加入IOOul細(xì)胞蛋白裂解液。每隔15分鐘槍頭吹打混勻，反應(yīng)I小時后將裂解液收集于I. 5ml EP管中。4°C，12000rpm離心10分鐘。上清即為細(xì)胞全蛋白，BCA法測定濃度。每孔蛋白上樣量為25ug。電泳條件濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。轉(zhuǎn)膜條件20V，90分鐘。一抗稀釋比例1:3000，二抗稀釋比例1:10000 (圖4A)。實施例六免疫電鏡
取置于鎳網(wǎng)上電鏡切片，1%雙氧水室溫處理10分鐘，PBS (pH7. 4)洗三次。鎳網(wǎng)浮于1%BSA - PBS (pH7. 4)液滴上，室溫孵育I小時，阻斷非特異性吸附。鎳網(wǎng)轉(zhuǎn)移至1%BSA —PBS (pH7. 4)稀釋的一抗(1:700)液滴上，4°C孵育過夜。PBS (pH7. 4)洗三次，PBS (ρΗ8· 2)洗三次。I % BSA-PBS (pH8. 2) 37°C孵育 I 小時。膠體金二抗用 I % BSA-PBS (ρΗ8· 2)稀釋(I :50)，淡紅色為適宜稀釋液，載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育30分鐘。PBS (ρΗ8.2)洗三 次，PBS (ρΗ7. 4)洗三次。吸干PBS后送樣觀察(圖4Β)。實施例七CCK8細(xì)胞增殖能力檢測
于轉(zhuǎn)染開始O小時，每隔12小時對細(xì)胞增殖能力進行檢測。96孔板中，反應(yīng)液為4ulCCK8+96ul無血清DMEM，37攝氏度避光反應(yīng)30分鐘。酶標(biāo)儀測0D450nm處吸光值，繪制增殖曲線(圖5)。實施例八JC-I檢測線粒體膜電位
U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后，棄培養(yǎng)基，PBS洗一次。加入配制好的JC-I染色液(每Iml染色液=5ul JC-l+800ul ddH20+200ul 5X染色緩沖液)，37攝氏度避光反應(yīng)20分鐘。棄染色液，JC-I染色緩沖液(IX)洗兩次。熒光顯微鏡下拍照觀察(圖6)。實施例九裸鼠腫瘤移植
胰酶消化后分別收集轉(zhuǎn)染PEGFP-N2、pEGFP-N2-DCFl 48小時后的U251細(xì)胞及只添加Lipo2000的U251細(xì)胞，數(shù)量為2*107。注射于雄性6周BALB/c裸鼠右側(cè)腋下，留針30秒，共三組，每組4只。觀察裸鼠成瘤情況(圖9)。
權(quán)利要求
1.人源dcfl基因在誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡中的應(yīng)用。
2.人源dcfl基因在抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增值中的應(yīng)用。
3.人源而/2基因在抑制腫瘤生長中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人源dcf1基因在抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系增值和誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡中的應(yīng)用。本發(fā)明通過免疫電鏡、原子力顯微鏡、CCK8增殖檢測、JC-1染色、裸鼠腫瘤異位移植等方法對dcf1誘導(dǎo)U251細(xì)胞系凋亡做出判斷，結(jié)果表明dcf1通過定位于線粒體引起線粒體結(jié)構(gòu)病變，膜電位下降，從而引起凋亡相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生改變，最終導(dǎo)致凋亡。裸鼠實驗表明，dcf1能顯著減小膠質(zhì)瘤的腫瘤體積，抑制腫瘤生長。
文檔編號A61P35/00GK102940890SQ20121038245
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者文鐵橋, 謝雨瓊, 楊眉, 楊清波 申請人:上海大學(xué)