一種新型的多功能介孔生物活性玻璃支架及其制備方法和用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種多功能介孔生物活性玻璃支架，所述生物活性玻璃支架為無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)，并且90%～99.999%的大孔都是互相連通的；所述生物活性玻璃支架還含有1～15摩爾%的銅，以所述活性玻璃支架CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)算。本發(fā)明還提供了多功能介孔生物活性玻璃支架的制備方法，采用溶膠-凝膠法制備了不同銅含量的介孔生物活性玻璃支架；制備出含銅的介孔生物活性玻璃支架具有良好的成血管潛力、成骨性、藥物傳輸和抗菌性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種新型的多功能介孔生物活性玻璃支架及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域和材料學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于骨修復(fù)的多功能介孔生物活性玻璃及其骨組織工程支架。
【背景技術(shù)】
[0002]骨組織工程是利用工程和生命科學(xué)的原理和方法再生新的骨組織，以修復(fù)和替代病變或缺損骨組織，或增進(jìn)其功能的技術(shù)。
[0003]在生物材料支架上種植細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體內(nèi)或體外培養(yǎng)活體組織，隨后將它們植入缺損或病變的部位，以修復(fù)缺損或病變骨組織。這是采用組織工程的方法構(gòu)建新的骨組織，或恢復(fù)病變骨組織功能的途徑之一。
[0004]治療骨缺損，尤其是由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤或遺傳性畸形所引起的大段骨缺損仍然是臨床治療中的一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。為了解決這些問(wèn)題，多孔生物活性支架已被廣泛用于修復(fù)骨缺損。為了更好的修復(fù)大段骨缺損，生物活性支架材料不僅要具備骨傳導(dǎo)性(引導(dǎo)的新骨生長(zhǎng))，同時(shí)能夠促進(jìn)新骨形成及血管生成。此外，在骨外科重建手術(shù)種，常常也伴隨著由細(xì)菌感染而引起的骨髓炎。
[0005]為了更好地治療大段骨缺損，理想的生物活性多孔支架應(yīng)具備成骨促進(jìn)性、誘導(dǎo)成血管化以及抗感染的多功能相結(jié)合。然而，據(jù)我們所知，目前的生物活性的多孔支架材料很少具有“真正的”多功能特性。因此，如何開(kāi)發(fā)具有多功能特性的生物活性多孔支架材料仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一目的在于獲得一種成骨促進(jìn)性、誘導(dǎo)成血管化以及抗感染的多功能相結(jié)合，同時(shí)保持良好物理性能的多孔支架。
[0007]本發(fā)明的第二目的在于獲得一種成骨促進(jìn)性、誘導(dǎo)成血管化以及抗感染的多功能相結(jié)合，同時(shí)保持良好物理性能的多孔支架的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第三目的在于獲得一種成骨促進(jìn)性、誘導(dǎo)成血管化以及抗感染的多功能相結(jié)合，同時(shí)保持良好物理性能的骨移植物。
[0009]本發(fā)明的第四目的在于獲得一種多孔生物玻璃支架的用途，其具有成骨促進(jìn)性、誘導(dǎo)成血管化以及抗感染的多功能組合，同時(shí)保持良好物理性能。
[0010]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多功能介孔生物活性玻璃支架，
[0011]所述生物活性玻璃支架為無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)，并且90%~99.999%的大孔都是互相連通的；
[0012]所述生物活性玻璃支架還含有I~15摩爾％的銅，以所述無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)算。
[0013]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的孔隙率不低于85%。[0014]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的介孔孔分布是2~9nm，優(yōu)選5 + lnm。
[0015]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的藥物釋放可維持3-10天，優(yōu)選7± I 天。
[0016]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的抗菌效率可達(dá)70-90%，優(yōu)選90%。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的比表面為300~450m2/g,優(yōu)選 330±10m2/g。 [0018]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步驟的方法制備的:
[0019](a)采用溶膠-凝膠法提供溶膠溶液；
[0020]所述溶膠溶液含有6~10重量份的介孔模板劑，10~15重量份的娃原料，I~2重量份的磷酸三烷基酯和鈣鹽，所述磷酸烷基酯和鈣鹽之間為化學(xué)計(jì)量比；其中還含有I~15摩爾％的銅，所述銅以CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)；
[0021](b)用所述溶膠溶液浸潰或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅燒去除，得到生物活性玻璃支架的坯體；
[0022](c)所述步驟(b)的生物活性玻璃支架的坯體在600~700° C煅燒，去除所述成孔模板，得到燒結(jié)的生物活性玻璃支架。
[0023]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，包括如下步驟:
[0024]采用正硅酸乙酯為Si源原材料，并調(diào)整與乙醇溶劑和介孔模板劑P123的比例；
[0025]采用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值、攪拌、充分水解正硅酸乙酯；
[0026]依次加入化學(xué)計(jì)量比的磷酸三乙酯、硝酸鈣和不同含量的氯化銅、攪拌；
[0027]采用聚亞胺脂海綿為泡沫模板，將上面制備的溶膠溶液涂覆在泡沫孔壁上；
[0028]反復(fù)涂覆不同的次數(shù)、干燥；
[0029]在一定溫度下煅燒干凝膠，制備出含銅的介孔生物活性玻璃支架；
[0030]對(duì)制備的含銅的介孔生物活性玻璃支架的介孔/大孔結(jié)構(gòu)、比表面、孔容、成血管化潛力、成骨性能、藥物傳輸性和抗菌性能進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
[0031]本發(fā)明的第二方面提供一種本發(fā)明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的制備方法，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步驟的方法制備的:
[0032](a)采用溶膠-凝膠法提供溶膠溶液；
[0033]所述溶膠溶液含有6-10重量份的介孔模板劑，10~15重量的娃原料，I~2克重量的磷酸三烷基酯和鈣鹽，所述磷酸三烷基酯和鈣鹽之間為化學(xué)計(jì)量比；其中還含有I~15摩爾％的銅，所述銅以所述無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)；
[0034](b)用所述步驟(a)的溶膠溶液浸潰或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅燒去除，得到生物活性玻璃支架的坯體；
[0035](c)所述步驟(b)的生物活性玻璃支架的坯體在600-750°C煅燒，去除所述成孔模板，得到燒結(jié)的生物活性玻璃支架。
[0036]優(yōu)選地，所述磷酸三烷基酯為磷酸三乙基酯。
[0037]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，[0038]米用正娃酸乙酯為娃源，
[0039]采用醇類(lèi)溶劑得到溶膠溶液；
[0040]所述硅源與醇類(lèi)試劑的質(zhì)量比為1: (7-15)。
[0041]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述醇類(lèi)溶劑選自Cl~C4烷基醇，優(yōu)選乙醇。
[0042]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，
[0043]采用市售的P123為介孔模板劑，
[0044]其與醇類(lèi)溶劑的質(zhì)量比為1: (10-20)。
[0045]本文中，所述P123為市售得到，其結(jié)構(gòu)為聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物。
[0046]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，
[0047]采用鹽酸、硝酸作為催化劑，調(diào)節(jié)后溶液的pH值為2-4。
[0048]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，采用的成孔模板為聚亞胺脂海綿(屬于泡沫模板)，涂覆的次數(shù)為3-5次。
[0049]本發(fā)明的第三方面提供一種移植物，所述移植物含有如本發(fā)明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接種于所述生物活性玻璃支架的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞，并且干細(xì)胞的接種量為2 X IO6~5 X IO7個(gè)細(xì)胞/cm3生物活性玻璃支架。`
[0050]優(yōu)選的，所述干細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
[0051]本發(fā)明的第四方面提供一種本發(fā)明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的用途，其用于制備骨移植物的支架。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052]通過(guò)下面的結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明所做的詳細(xì)說(shuō)明，可以更好地理解上文所述內(nèi)容。其中所給附圖為實(shí)例I的結(jié)果。
[0053]圖1為不同銅含量的介孔玻璃支架SEM圖，銅含量對(duì)于支架大孔結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。
[0054]圖2為不同銅含量的介孔玻璃支架XRD圖，獲得的支架沒(méi)有明顯結(jié)晶，因此是無(wú)定型的。
[0055]圖3為銅含量I和5%的介孔玻璃支架TEM圖，支架孔壁內(nèi)部具有高度有序的納米介孔孔道結(jié)構(gòu)。
[0056]圖4為不同銅含量的介孔玻璃支架的N2吸附脫附以及孔分布圖，其具有比較一致的介孔吸附脫附曲線和介孔孔分布。
[0057]圖5為人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附在不同銅含量的介孔玻璃支架上。
[0058]圖6為不同銅含量的介孔玻璃支架支持骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖和ALP活力表達(dá)。
[0059]圖7為含銅的介孔玻璃支架提高了成骨細(xì)胞VEGF的分泌以及HIF-1a和VEGF的表達(dá)。
[0060]圖8為含銅的介孔玻璃支架提高了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨相關(guān)的基因表達(dá)。
[0061]圖9為含銅的介孔玻璃支架的離子浸提液提高了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活力。
[0062]圖10為含銅的介孔玻璃支架的離子浸提液提高了成骨細(xì)胞VEGF的分泌以及HIF-1a和VEGF的表達(dá)。
[0063]圖11為含銅的介孔玻璃支架的離子浸提液提高了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨相關(guān)的基因表達(dá)。
[0064]圖12為含銅的介孔玻璃支架維持了長(zhǎng)時(shí)間可持續(xù)的藥物釋放。
[0065]圖13為含銅的介孔玻璃支架顯示出了優(yōu)良的抗菌性能。
【具體實(shí)施方式】
[0066]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)改進(jìn)制備工藝，將銅離子引入到介孔生物活性玻璃支架中去，實(shí)現(xiàn)了介孔生物玻璃支架的多功能性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0067]本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下:
[0068]先前的研究表明，介孔生物活性玻璃具有優(yōu)良的成骨活性和藥物傳輸特性。銅離子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的低氧壓(Hypoxia)，從而提高細(xì)胞的成血管化潛力。通過(guò)介孔模板、溶膠-凝膠法和大孔模板相結(jié)合的方法制備了含銅的介孔生物活性玻璃支架，具有工藝比較簡(jiǎn)單，條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)。但是本領(lǐng)域并沒(méi)有如何開(kāi)發(fā)具有多功能特性的生物活性多孔支架材料仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。
[0069]而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用含銅的介孔生物活性玻璃支架用作人體硬組織修復(fù)和植入材料具有良好的生物活性、成血管誘導(dǎo)性、藥物傳輸和抗菌性等多功能特性。因此，本方面制備的含銅的介孔生物活性玻璃支架具有很強(qiáng)的實(shí)用意義。
[0070] 本發(fā)明的技術(shù)手段和所獲得的效果如下:
[0071]本發(fā)明采用溶膠-凝膠法制備了含銅的介孔生物活性玻璃多功能支架。更具體地，本發(fā)明采用正硅酸乙酯、硝酸鈣、磷酸三乙酯、氯化銅和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123)為原材料，以聚亞胺脂海綿泡沫為多孔支架模板，溶膠-凝膠法制備了含銅的介孔生物活性玻璃多功能支架。通過(guò)系統(tǒng)研究含銅的介孔生物活性玻璃支架發(fā)現(xiàn)其具有良好的成血管潛力、成骨性、藥物傳輸和抗菌性等性能來(lái)確定其是否能夠用作新型的生物活性植入材料。
[0072]含銅的介孔玻璃支架具有有序的納米介孔結(jié)構(gòu)和連通的大孔結(jié)構(gòu)，高的比表面、孔容。不同銅含量的介孔玻璃支架能夠很好地支持人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附，增殖和堿性磷酸酶的表達(dá)。隨著銅的引入，能夠顯著地促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中VEGF的分泌，以及低氧壓因子(HIF-1a)的表達(dá)。同時(shí)，含銅的介孔生物活性玻璃支架顯著地提高了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨相關(guān)的基因表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，含銅的介孔生物活性玻璃支架釋放的含Cu，Ca和Si等離子產(chǎn)物也顯著地促進(jìn)了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞VEGF的分泌和低氧壓因子(HIF-1a)的表達(dá)，同時(shí)提高了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨相關(guān)的基因表達(dá)。而且，制備的支架具有很好的藥物傳輸能力和顯著的抗菌性能。因此，含銅的介孔玻璃支架具有很好的成血管化潛力、成骨特性、藥物傳輸和抗菌性，是一種新型的多功能生物活性支架材料，可能用于大塊骨缺損修復(fù)。
[0073]術(shù)語(yǔ)
[0074]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“含有”或“包括”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語(yǔ)“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語(yǔ)“含有”或“包括”中。
[0075]如本文所用，所述的“烷基”，除非另有說(shuō)明，指的是含有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷烴。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基。[0076]術(shù)語(yǔ)“純化的或分離的”指純化的或分離的物質(zhì)基本上不含有其他細(xì)胞、蛋白質(zhì)或多肽。
[0077]術(shù)語(yǔ)“異種移植”指將所需生物材料(如干細(xì)胞)從某一物種中取出并再施用于另一物種對(duì)象的方法。
[0078]術(shù)語(yǔ)“自體移植”指將所需生物材料(如干細(xì)胞)從某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
[0079]術(shù)語(yǔ)“異體移植”指將所需生物材料(如干細(xì)胞)從同一物種的某個(gè)體中取出并再施用于另一不同病人的方法。
[0080]以下對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行詳述:
[0081]含銅的介孔玻璃支架的制備和表征
[0082]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多功能介孔生物活性玻璃支架，
[0083]所述生物活性玻璃支架為無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)，并且90%~99.999%的大孔都是互相連通的；
[0084]所述生物活性玻璃支架還含有I~15摩爾％的銅，以所述無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)算。
[0085]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的孔隙率不低于85%。
[0086]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的介孔孔分布是2~9nm，優(yōu)選5 + Inm0`[0087]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的藥物釋放可維持3-10天，優(yōu)選7± I 天。
[0088]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的抗菌效率可達(dá)70-90%，優(yōu)選90%。
[0089]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架的比表面為300~450m2/g,優(yōu)選 330±10m2/g。
[0090]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步驟的方法制備的:
[0091 ] (a)采用溶膠-凝膠法提供溶膠溶液；
[0092]所述溶膠溶液含有6~10重量份的介孔模板劑，10~15重量份的娃原料，I~2重量份的磷酸三烷基酯和鈣鹽，所述磷酸烷基酯和鈣鹽之間為化學(xué)計(jì)量比；其中還含有
I~15摩爾％的銅，所述銅以CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)；
[0093](b)用所述溶膠溶液浸潰或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅燒去除，得到生物活性玻璃支架的坯體；
[0094](c)所述步驟(b)的生物活性玻璃支架的坯體在600~700° C煅燒，去除所述成孔模板，得到燒結(jié)的生物活性玻璃支架。
[0095]具體的，所述硅原料優(yōu)選的是正硅酸乙酯。
[0096]優(yōu)選地，所述磷酸三烷基酯為磷酸三乙基酯。
[0097]所述的鈣鹽是可溶性鹽，通常為硝酸鈣或氯化鈣。
[0098]所述的銅通常采用銅鹽的方式加入，例如為氯化銅或硝酸銅。
[0099]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，[0100]米用正娃酸乙酯為娃源，
[0101]采用醇類(lèi)溶劑得到溶膠溶液；
[0102]所述硅源與乙醇的質(zhì)量比為1: (7-15)。
[0103]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述醇類(lèi)溶劑選自Cl~C4烷基醇，優(yōu)選乙醇。
[0104]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，
[0105]采用市售的P123為介孔模板劑，
[0106]其與醇類(lèi)溶劑的質(zhì)量比為1: (10-20)。
[0107]本文中，所述P123為市售得到，其結(jié)構(gòu)為聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物。
[0108]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中，[0109]采用鹽酸或硝酸作為催化劑，調(diào)節(jié)后溶液的pH值為2-4。
[0110]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，采用聚亞胺脂海綿為泡沫模板，涂覆的次數(shù)為
3-5 次。
[0111]需要說(shuō)明的是，可用于本發(fā)明的成孔模板沒(méi)有特別限制，可以是任何多孔的海綿材料，只要所述成孔模板可在煅燒過(guò)程中去除，例如聚亞氨酯海綿、EVC海綿和高彈海綿等。通常，成孔模板的孔隙率為95~99.9%，但不局限于此。
[0112]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，包括如下步驟:
[0113]采用正硅酸乙酯為Si源原材料，并調(diào)整與乙醇溶劑和介孔模板劑P123的比例；
[0114]采用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值、攪拌、充分水解正硅酸乙酯；
[0115]依次加入化學(xué)計(jì)量比的磷酸三乙酯、硝酸鈣和不同含量的氯化銅、攪拌；
[0116]采用聚亞胺脂海綿為泡沫模板，將上面制備的溶膠溶液涂覆在泡沫孔壁上；
[0117]反復(fù)涂覆不同的次數(shù)、干燥；
[0118]在一定溫度下煅燒干凝膠，制備出含銅的介孔生物活性玻璃支架；
[0119]對(duì)制備的含銅的介孔生物活性玻璃支架的介孔/大孔結(jié)構(gòu)、比表面、孔容、成血管化潛力、成骨性能、藥物傳輸性和抗菌性能進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
[0120]發(fā)明人還提供一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】:
[0121]將P123與乙醇按照1:(10-20)質(zhì)量比混合、溶解，將分析純正硅酸乙酯與乙醇按I: (7-15)的比例混合，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2-4，在室溫下充分?jǐn)嚢?0±10分鐘，然后加入四水合硝酸鈣、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化銅(Cu含量:1-15%)。攪拌3-5小時(shí)后，用于涂覆聚亞胺脂海綿3-5次，在室溫干燥24小時(shí)，并在600-750°C中煅燒3_8小時(shí)。
[0122]通過(guò)XRD、TEM、SEM和N2吸附-脫附等手段對(duì)不同銅含量的介孔玻璃支架的物相、介孔結(jié)構(gòu)、大孔結(jié)構(gòu)、比表面和介孔孔容等進(jìn)行系統(tǒng)的表征。
[0123]本發(fā)明的浸潰、涂覆、干燥、煅燒、和通常還有的冷卻步驟可以用本領(lǐng)域常規(guī)的設(shè)備和方法進(jìn)行。
[0124]干細(xì)胞
[0125]本發(fā)明的第三方面提供一種移植物，所述移植物含有如本發(fā)明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接種于所述生物活性玻璃支架的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞，并且干細(xì)胞的接種量為2 X IO6~5 X IO7個(gè)細(xì)胞/cm3生物活性玻璃支架。[0126]本發(fā)明的干細(xì)胞的來(lái)源沒(méi)有特別限制，可以是任何來(lái)源的干細(xì)胞，通常，本發(fā)明的干細(xì)胞是自體的、或同種異體的干細(xì)胞。獲取干細(xì)胞的部位也沒(méi)有特別限制，可以是脂肪干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或其他干細(xì)胞。此外，成骨細(xì)胞也可替代干細(xì)胞用作骨組織工程化構(gòu)建的種子細(xì)胞。
[0127]優(yōu)選的，所述干細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
[0128]可用于本發(fā)明的干細(xì)胞可以來(lái)自任何脊椎動(dòng)物，較佳地是哺乳動(dòng)物，更佳地是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，尤其是人。
[0129]盡管自體的干細(xì)胞是優(yōu)選的，但異體的干細(xì)胞的來(lái)源更為常用。研究已表明，不同生長(zhǎng)、發(fā)育階段的同種異體干細(xì)胞，可以在有組織相容性差異并且具有完全免疫功能的同種異體動(dòng)物體內(nèi)形成干細(xì)胞組織。
[0130]分離和獲得干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。一種優(yōu)選的方法是密度梯度離心法和酶消化法。 [0131]干細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將干細(xì)胞在37°C、飽和濕度、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于):1)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+5~20%胎牛血清；2) DMEM培養(yǎng)基+5~20%小牛血清；3) DMEM培養(yǎng)基+5~20%自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種抗生素、各種誘導(dǎo)因子。
[0132]適用于本發(fā)明的干細(xì)胞應(yīng)能在體內(nèi)或體外增殖。一種優(yōu)選的干細(xì)胞是體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
[0133]骨移植物
[0134]由于本發(fā)明的多功能介孔生物活性玻璃支架與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞特別是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的相容性非常好，因此特別適合作為骨修復(fù)的支架材料。
[0135]將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞接種到生物相容性?xún)?yōu)異的多功能介孔生物活性玻璃支架形成干細(xì)胞一生物活性玻璃復(fù)合物，將這一“干細(xì)胞一生物活性玻璃”復(fù)合物植入到缺損部位，隨著生物活性玻璃的逐漸降解吸收，新骨形成，達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。
[0136]本發(fā)明的組織工程骨移植物的制備方法簡(jiǎn)便，將一定數(shù)量的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞接種于生物活性玻璃即可。
[0137]本發(fā)明的組織工程化骨移植物的形狀沒(méi)有特別限制，可以按照組織缺損的形狀任意塑形。通常，移植物為長(zhǎng)條形。
[0138]本發(fā)明組織工程化骨中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞濃度通常約為
0.5X 106/cm3(陶瓷支架體積)至5X 108/cm3或更高，較佳地為IX 106/cm3至IX 108/cm3,更佳地為5X IOfVcm3至5X IOVcm3生物活性玻璃。通常，以培養(yǎng)液調(diào)整骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞濃度，然后與可降解材料混合?；旌蠒r(shí)，培養(yǎng)液與可降解材料的比例沒(méi)有特別限制，但是以該材料能夠吸附的培養(yǎng)液最大量為宜。
[0139]此外，在本發(fā)明的組織工程化骨移植物中，還可添加或復(fù)合其他各種細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、各種抗生素，從而保持骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞表型、促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和/或脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)，以及促進(jìn)組織工程化骨在體內(nèi)生長(zhǎng)。
[0140]除了將組織工程化骨移植物植入體內(nèi)之外，還將其置于體外生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，從而進(jìn)行組織工程化骨的構(gòu)建，在體外形成具有一定組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生化組成與生物力學(xué)強(qiáng)度的組織工程化骨。
[0141]用本發(fā)明方法形成的組織工程化骨移植物，可直接植入體內(nèi)的骨缺損處。
[0142]如無(wú)具體說(shuō)明，本發(fā)明的各種原料均可以通過(guò)市售得到；或根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備得到。除非另有定義或說(shuō)明，本文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。
[0143]本發(fā)明的其他方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
[0144]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。若沒(méi)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，則按照通用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行(例如Sambrook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)。除非另外說(shuō)明，否則所有的份數(shù)為重量份,所有的百分比為重量百分比，所述的聚合物分子量為數(shù)均分子量。
[0145]除非另有定義或說(shuō)明，本文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。
[0146]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但它們并不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0147]實(shí)例1:
[0148]將P123與乙醇按照`1:15質(zhì)量比混合、溶解，將分析純正硅酸乙酯與乙醇按1:8.7的比例混合，并用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為2，在室溫下充分?jǐn)嚢?0分鐘，然后加入四水合硝酸鈣、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化銅(Cu摩爾含量:0，1，2，5%)。攪拌5小時(shí)后，用于涂覆聚亞胺脂海綿3次，在室溫干燥24小時(shí)，并在650°C中煅燒5小時(shí)。
[0149]然后進(jìn)行材料表征、成血管化、成骨性、藥物傳輸和抗菌性能研究，如圖1~13所
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[0150]所述含銅的介孔玻璃支架的多功能性研究得到如下結(jié)論:
[0151](I)含銅的介孔玻璃支架的成血管化潛力
[0152]將不同銅含量的介孔玻璃支架與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，然后用ELISA方法測(cè)試細(xì)胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法測(cè)試HIF-1a和VEGF的表達(dá)。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)研究支架釋放的離子產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明，含銅的介孔玻璃支架顯著提提高了 VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。含銅的介孔玻璃支架具有非常優(yōu)良的成血管化潛力。
[0153](2)含銅的介孔玻璃支架的細(xì)胞相容性和成骨促進(jìn)性
[0154]將不同銅含量的介孔玻璃支架或其浸提液與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，研究材料對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖、堿性磷酸酶活性以及成骨相關(guān)的基因表達(dá)。結(jié)果表明含銅的介孔玻璃支架及其釋放的離子產(chǎn)物能夠顯著地促進(jìn)牙骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，具有成骨促進(jìn)性。
[0155](3)含銅的介孔玻璃支架的藥物傳輸和抗菌性[0156]將含銅的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬藥物溶液中12小時(shí)，測(cè)試藥物傳輸，發(fā)現(xiàn)含銅的介孔玻璃支架能夠有效地裝載藥物，并維持長(zhǎng)時(shí)間的藥物傳輸。
[0157]同時(shí)采用E.coli菌與含銅的介孔玻璃支架作用，發(fā)現(xiàn)引入銅在介孔生物活性玻璃支架中顯著地抑制了細(xì)菌的活力，顯示出良好的抗菌性能。
[0158]實(shí)例2:
[0159]將P123與乙醇按照1:15質(zhì)量比混合、溶解，將分析純正硅酸乙酯與乙醇按1:10的比例混合，并用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為2，在室溫下充分?jǐn)嚢?0分鐘，然后加入四水合硝酸鈣、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化銅(Cu摩爾含量:0，1，2，5%)。攪拌5小時(shí)后，用于涂覆聚亞胺脂海綿5次，在室溫干燥24小時(shí)，并在700°C中煅燒5小時(shí)。
[0160]然后進(jìn)行材料表征、成血管化、成骨性、藥物傳輸和抗菌性能研究。
[0161]將不同銅含量的介孔玻璃支架與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，然后用ELISA方法測(cè)試細(xì)胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法測(cè)試HIF-1a和VEGF的表達(dá)。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)研究支架釋放的離子產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明，含銅的介孔玻璃支架顯著提提高了 VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。含銅的介孔玻璃支架具有非常優(yōu)良的成血管化潛力。
[0162]將不同銅含量的介孔玻璃支架或其浸提液與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，研究材料對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖、堿性磷酸酶活性以及成骨相關(guān)的基因表達(dá)。結(jié)果表明含銅的介孔玻璃支架及其釋放的離子產(chǎn)物能夠顯著地促進(jìn)牙骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，具有成骨促進(jìn)性。
[0163]將含銅的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬藥物溶液中12小時(shí)，測(cè)試藥物傳輸，發(fā)現(xiàn)含銅的介孔玻璃支架能夠有效地裝載藥物`，并維持長(zhǎng)時(shí)間的藥物傳輸。
[0164]同時(shí)采用E.coli菌與含銅的介孔玻璃支架作用，發(fā)現(xiàn)引入銅在介孔生物活性玻璃支架中顯著地抑制了細(xì)菌的活力，顯示出良好的抗菌性能。
[0165]實(shí)例3:
[0166]將P123與乙醇按照1:12質(zhì)量比混合、溶解，將分析純正硅酸乙酯與乙醇按1:10的比例混合，并用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為4，在室溫下充分?jǐn)嚢?0分鐘，然后加入四水合硝酸鈣、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化銅(Cu摩爾含量:0，1，2，5%)。攪拌5小時(shí)后，用于涂覆聚亞胺脂海綿8次，在室溫干燥24小時(shí)，并在600°C中煅燒5小時(shí)。
[0167]然后進(jìn)行材料表征、成血管化、成骨性、藥物傳輸和抗菌性能研究。
[0168]將不同銅含量的介孔玻璃支架與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，然后用ELISA方法測(cè)試細(xì)胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法測(cè)試HIF-1a和VEGF的表達(dá)。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)研究支架釋放的離子產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明，含銅的介孔玻璃支架顯著提提高了 VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表達(dá)。含銅的介孔玻璃支架具有非常優(yōu)良的成血管化潛力。
[0169]將不同銅含量的介孔玻璃支架或其浸提液與人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，研究材料對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖、堿性磷酸酶活性以及成骨相關(guān)的基因表達(dá)。結(jié)果表明含銅的介孔玻璃支架及其釋放的離子產(chǎn)物能夠顯著地促進(jìn)牙骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，具有成骨促進(jìn)性。
[0170]將含銅的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬藥物溶液中12小時(shí)，測(cè)試藥物傳輸，發(fā)現(xiàn)含銅的介孔玻璃支架能夠有效地裝載藥物，并維持長(zhǎng)時(shí)間的藥物傳輸。
[0171]同時(shí)采用E.coli菌與含銅的介孔玻璃支架作用，發(fā)現(xiàn)引入銅在介孔生物活性玻璃支架中顯著地抑制了細(xì)菌的活力，顯示出良好的抗菌性能。
[0172]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。 [0173]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種多功能介孔生物活性玻璃支架，其特征在于， 所述生物活性玻璃支架為無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)，并且90%~99.999%的大孔都是互相連通的； 所述生物活性玻璃支架還含有I~15摩爾％的銅，以所述無(wú)定型玻璃結(jié)構(gòu)中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)算。
2.如權(quán)利要求1所述的生物活性玻璃支架，其特征在于，所述生物活性玻璃支架的比表面為 300 ~450m2/g，優(yōu)選 330±10m2/g。
3.如權(quán)利要求1所述的生物活性玻璃支架，其特征在于，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步驟的方法制備的: (a)采用溶膠-凝膠法提供溶膠溶液； 所述溶膠溶液含有6~10重量份的介孔模板劑，10~15重量份的娃原料,I~2重量份的磷酸三烷基酯和鈣鹽，所述磷酸烷基酯和鈣鹽之間為化學(xué)計(jì)量比；其中還含有I~15摩爾％的銅，所述銅以CuO-CaO-P2O5-SiO2的總物質(zhì)的量計(jì)； (b)用所述溶膠溶液浸潰或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅燒去除，得到生物活性玻璃支架的坯體； (c)所述步驟(b)的生物活性玻璃支架的坯體在600~700°C煅燒，去除所述成孔模板，得到燒結(jié)的生物活性玻璃支架。
4.一種如權(quán)利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的制備方法，其特征在于，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步驟的方法制備的: (a)采用溶膠-凝膠法提供溶膠溶液； 所述溶膠溶液含有6-10重量份的介孔模板劑，10~15重量的娃原料，I~2克重量的磷酸三烷基酯和鈣鹽，所述磷酸三烷基酯和鈣鹽之間為化學(xué)計(jì)量比；其中還含有I~15摩爾％的銅，所述銅以0.4-0.6克的總物質(zhì)的量計(jì)； (b)用所述步驟(a)的溶膠溶液浸潰或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅燒去除，得到生物活性玻璃支架的坯體； (c)所述步驟(b)的生物活性玻璃支架的坯體在600-750°C煅燒，去除所述成孔模板，得到燒結(jié)的生物活性玻璃支架。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中， 采用正硅酸乙酯為硅源， 采用醇類(lèi)溶劑得到溶膠溶液； 所述硅源與醇類(lèi)試劑的質(zhì)量比為1: (7-15)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中， 采用市售的P123 (聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物)為介孔模板劑， 其與醇類(lèi)溶劑的質(zhì)量比為1: (10-20)。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)的所述溶膠-凝膠法中， 采用鹽酸或硝酸作為催化劑，調(diào)節(jié)后所述溶液的pH值為2-4。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的成孔模板采用泡沫模板，更優(yōu)選采用聚亞胺脂海綿，涂覆所述成孔模板的次數(shù)為3-5次。
9.一種移植物，其特征在于，所述移植物含有如權(quán)利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接種于所述生物活性玻璃支架的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞選自骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞，并且干細(xì)胞的接種量為2 X IO6~5 X IO7個(gè)細(xì)胞/cm3生物活性玻璃支架。
10.一種如權(quán)利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的用途，其特征在于，用于制備骨移 植物的支架。
【文檔編號(hào)】A61L27/12GK103721292SQ201210382838
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月10日
【發(fā)明者】吳成鐵, 常江 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所