一種含有生物蛋白的外用溶液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有生物蛋白的外用溶液及其制備方法，特別是含有用于治療燒傷[促進(jìn)創(chuàng)面愈合，可用于燒傷創(chuàng)面（包括淺II度、深I(lǐng)I度、肉芽創(chuàng)面）、慢性創(chuàng)面（包括慢性潰瘍等）和新鮮創(chuàng)面（包括外傷、手術(shù)傷等）。將來還可能用于骨折、牙周炎、糖尿病皮膚潰瘍治療。]的生物蛋白類活性成分，如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、卵磷脂化超氧化物歧化酶外用溶液及其制備方法。本發(fā)明制劑得到的外用溶液不含有任何防腐劑或抑菌劑，避免了受傷創(chuàng)面的感染，安全性高，所用輔料中保護(hù)劑為特殊的組合物，實(shí)現(xiàn)了蛋白溶液的低溫長期保存，避免了常用蛋白制劑需要凍干粉末化才能穩(wěn)定保存的缺陷，方便病人攜帶和使用，提高了使用安全性，能夠保證外用溶液中蛋白的高純度和高活性。
【專利說明】一種含有生物蛋白的外用溶液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含有生物蛋白活性成分的外用溶液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于基因重組技術(shù)的發(fā)展，藥用蛋白質(zhì)制劑的商品化生產(chǎn)已成為現(xiàn)實(shí)。近來已有140多種重組蛋白質(zhì)制劑在進(jìn)行I期或I期以上的臨床試驗(yàn)，有12種已獲美國FDA的批準(zhǔn)。然而，由于蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，使其在純化、分離、貯存和銷售時(shí)存在獨(dú)有的因難。蛋白質(zhì)的降解途徑可分為二種類型， 即化學(xué)不穩(wěn)定性和物理不穩(wěn)定性。前者系指蛋白質(zhì)通過成鍵或斷鍵生成新的化合物；而物理穩(wěn)定性則不涉及蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵變異，而是指蛋白質(zhì)變成更高級的結(jié)構(gòu)(二級或更高)，包括變性、表面吸附、凝聚和沉淀。蛋白質(zhì)藥物的這些理化缺陷，限制了其制劑的應(yīng)用與發(fā)展。目前，為了克服蛋白質(zhì)藥物的不穩(wěn)定性，一般采用冷凍干燥技術(shù)制得凍干粉末后保存，使用時(shí)再復(fù)溶。盡管與液體制劑相比凍干制劑穩(wěn)定，但是冷凍干燥是一個非常復(fù)雜的過程，在預(yù)冷第一、第二干燥階段和儲存過程中，藥物的結(jié)構(gòu)可能受器重的物理化學(xué)變化影響而發(fā)生變化，特別是蛋白質(zhì)多肽類藥物的二、三級結(jié)構(gòu)易受破壞，失去活性而影響藥效。使用時(shí)復(fù)溶也存在諸多風(fēng)險(xiǎn)，如含量不均一、析出雜質(zhì)、有異物、成本聞、使用不方便等。
[0003]皮膚傷口愈合是復(fù)雜的生物學(xué)過程，在這一過程中，有許多細(xì)胞參與，成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是創(chuàng)傷修復(fù)的主要細(xì)胞之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞生長因子，如b-FGF、aFGF、PDGF, TGF、IGF,表皮生長因子等在創(chuàng)面愈合中有著巨大的作用，它們對皮膚傷口的纖維化、血管化和再上皮化有介導(dǎo)和調(diào)控的作用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。其中，bFGF對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)具有促進(jìn)修復(fù)和再生的作用，在組織分化、正常組織結(jié)構(gòu)和生理功能維持及損傷損傷修復(fù)等方面具有顯著的療效。研究表明:它一方面直接刺激成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白合成，形成膠原，另一方面，可以改善局部微循環(huán)和組織營養(yǎng)狀況，促進(jìn)成欣慰細(xì)胞、成肌細(xì)胞增殖，使肉芽組織迅速生長，創(chuàng)緣上皮迅速向中心爬行使創(chuàng)面縮小而愈合。但是由于成纖維生長因子、表皮生長因子等為融合蛋白，容易受到各種外界因素的影響而降低活性，制劑中的穩(wěn)定性很差，影響治療效果，高溫或過冷環(huán)境也影響其生物活性，容易發(fā)生蛋白變性。
[0004]在目前的現(xiàn)有技術(shù)中，為了解決蛋白制劑的穩(wěn)定性和凍干制劑的缺點(diǎn)，中國專利申請200510036641.3公開了一種重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的外用溶液，其中采用肝素鈉為保護(hù)劑，實(shí)現(xiàn)活性多肽溶液狀態(tài)的低溫保存。但是，在該方案中并沒有公開外用溶液中的主要有效成分rb-bFGF的活性指標(biāo)，同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道，肝素鈉可產(chǎn)生罕見皮膚刺激如燒灼感，或過敏反應(yīng)如皮疹、瘙癢等副作用，在肝素鈉軟膏的說明書的注意事項(xiàng)中已明確寫明了肝素鈉勿直接涂于潰爛傷口和粘膜組織上，不適用與嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒燙傷、以及某些疾病例如糖尿病引起的皮膚潰瘍的創(chuàng)面的治愈。從2007年12月中旬至2008年I月，美國制造公司百特公司(Baxter International Inc.)連續(xù)接到報(bào)告稱,大約有350人在使用了該公司生產(chǎn)的肝素鈉(heparin)后，產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，其中四人已經(jīng)死亡。這是近年比較大的一個肝素鈉不良反應(yīng)事件。
[0005]此外，中國專利申請201110342458.1公開了重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子外用溶液，其中采用人血白蛋白為蛋白保護(hù)劑，為了保持溶液的穩(wěn)定性，還加入了溶液保護(hù)劑甘露醇和聚乙二醇中的一種或者二者的組合。該發(fā)明案雖然避免了采用肝素類物質(zhì)如肝素鈉作為保護(hù)劑，但是采用的保護(hù)劑人血白蛋白是血液制品，雖然經(jīng)過處理，但是其中的一些物質(zhì)可能會使接受者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，甚至是感染病毒，例如艾滋病毒。對于燒傷創(chuàng)面特別是含有潰爛的創(chuàng)面容易產(chǎn)生感染，也有人血白蛋白會產(chǎn)生寒顫、發(fā)熱、顏面潮紅、皮疹、惡心嘔吐等癥狀副作用的報(bào)道。而甘露醇對蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而結(jié)晶態(tài)的甘露醇則失去保護(hù)功能； 1%或更低濃度的甘露醇通過無定型結(jié)構(gòu)的形成而阻止蛋白質(zhì)分子的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結(jié)晶，會促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集，因此，其加入對蛋白質(zhì)變性會產(chǎn)生很大的風(fēng)險(xiǎn)。研究顯示，人血白蛋白和甘露醇或聚乙二醇的加入，放置后會降低活性蛋白的活性和純度。
[0006]鑒于目前蛋白溶液型制劑，特別是用于具有燒傷、創(chuàng)面愈合、潰爛等部位的外用溶液劑存在的困難和和不足，本發(fā)明人進(jìn)行了潛心的研究，意外地發(fā)現(xiàn)以鈣鎂鉀鹽的形式廣泛存在于植物種子內(nèi)的植酸類物質(zhì)，對維持蛋白溶液劑的穩(wěn)定環(huán)境，實(shí)現(xiàn)蛋白溶液劑的低溫保存具有重要作用，植酸類物質(zhì)也存在于動物有核紅細(xì)胞內(nèi)，可促進(jìn)氧合血紅蛋白中氧的釋放，改善血紅細(xì)胞功能，延長血紅細(xì)胞的生存，本身所具有的藥理活性可以和活性蛋白起到協(xié)同作用，特別是對在涉及用于燒傷等創(chuàng)面愈合的活性蛋白如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子具有協(xié)同作用。天然植酸也極好抗氧化性能，在蛋白溶液劑中避免了為維持蛋白活性穩(wěn)定而加入其他的抗氧劑等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種含有生物蛋白的外用溶液及其制備方法，該外用溶液中不含防腐劑和抑菌劑，保證了帶有傷口的創(chuàng)面和潰爛創(chuàng)面使用的安全性，同時(shí)避免了現(xiàn)有技術(shù)中使用肝素類物質(zhì)和人血白蛋白作為保護(hù)劑所產(chǎn)生的副作用和缺陷，實(shí)現(xiàn)了蛋白溶液不經(jīng)凍干的低溫保存。無菌薄膜過濾、最佳PH調(diào)節(jié)等制備方法步驟簡單，重現(xiàn)性好、適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。外用溶液劑無菌灌裝于噴霧瓶中，方便患者使用，防止對瓶內(nèi)剩余藥液產(chǎn)生污染。
[0008]結(jié)合已有的研究成果，本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種含有生物蛋白的外用溶液，按重量體積比(g/100ml)計(jì)算，含有生物蛋白的量為5-50mg/100mL、緩沖體系為0.5_2g/100mL、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑，余量為注射用水。
[0009]其中，所含的生物蛋白為成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、超氧化物歧化酶、卵磷脂化超氧化物歧化酶、層粘連蛋白、人類補(bǔ)體因子H、脂朊脂酶、雙調(diào)蛋白中的任意一種，其中優(yōu)選為成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、卵磷脂化超氧化物歧化酶。
[0010]其中，所述成纖維細(xì)胞生長因子為酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
[0011]其中，所含的緩沖體系選自檸檬酸/檸檬酸鈉體系或磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉體系或磷酸鹽緩沖體系或檸檬酸/磷酸二氫鈉體系或檸檬酸/磷酸氫二鈉體系。[0012]其中，所含的穩(wěn)定劑為5-30mg/100mL表面活性劑和10-50mg/100mL選自低分子右旋糖酐或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉或乙二胺四乙酸鈉鈣中任意一種的組合物。
[0013]其中，表面活性劑選自吐溫80、氨基酸型、脂肪酸山梨坦、十二烷基磺酸鈉中的任
意一種。
[0014]其中，所含的保護(hù)劑為Ι-lOg/lOOmL甘油與5-50mg/100mL選自蔗糖八硫酸酯鈉、
葡聚糖硫酸酯、植酸、質(zhì)酸鈉、 植酸鈣、植酸鎂、植酸鉀、卵黃高磷蛋白、多聚磷酸銨、肌醇六硫酸酯中的任意一種的組合物。
[0015]其中，制備生物蛋白外用溶液的方法，步驟如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0016]本發(fā)明的技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果包括:
(1)克服了活性蛋白制劑需要冷凍干燥工藝才能穩(wěn)定保存的缺陷，實(shí)現(xiàn)了活性蛋白以溶液狀態(tài)低溫保存；
(2)克服了現(xiàn)有技術(shù)中重組成纖維細(xì)胞生長因子外用溶液采用肝素鈉為保護(hù)劑所產(chǎn)生的副作用；
(3)克服了現(xiàn)有技術(shù)中采用血液來源的人血白蛋白為活性蛋白溶液保護(hù)劑所產(chǎn)生的批次間重復(fù)性差、有過敏風(fēng)險(xiǎn)的缺陷；
(4)不含任何防腐劑、抑菌劑，對燒傷創(chuàng)面、潰爛創(chuàng)面使用安全；
(5)制備方法簡單，保證了無菌操作的工藝，灌裝于噴霧瓶中，使用方便，用后不污染剩余藥液；
(6)以天然來源的植酸類物質(zhì)為蛋白保護(hù)劑，有利于活性蛋白穩(wěn)定環(huán)境的維持，而且植酸本身就是對人體有益的營養(yǎng)品，植酸在人體內(nèi)水解產(chǎn)物為肌醇和磷脂，前者具有抗衰老作用，后者是人體細(xì)胞重要組成部分；
(7)植酸類物質(zhì)對絕大多數(shù)金屬離子有極強(qiáng)絡(luò)合能力，絡(luò)合力與EDTA相似，但比EDTA的應(yīng)用范圍更廣，可吸附各種容器或灌裝瓶由于長期放置析出的離子等，保證溶液環(huán)境的穩(wěn)定性
(8)每個植酸分子可提供六對氫原子使自由基的電子形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而代替被保鮮物分子作為供氧分子，可作為天然的抗氧劑避免活性蛋白氧化失活，避免添加更多的輔料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制得外用溶液中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的純度液相色譜圖。
[0018]圖2為比較例I中以人血白蛋白為保護(hù)劑的外用溶液中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的純度液相色譜圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0019]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將其理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下實(shí)施例。凡基于本發(fā)明的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的范圍。顯然，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明的基 本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換和變更。
[0020]實(shí)施例1:rh_bFGF外用溶液的制備處方:
梓檬酸2.9g
檸檬酸鈉10.7g Tween80 0.1g 右旋糖酐0.185g 甘油IOg 植酸0.05g
注射用水加至IL重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子IOOmg共制400支。
[0021]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0022]純度檢查:采用液相色譜法進(jìn)行活性蛋白純度的檢測。
檢測方法:
檢測波長:215nm流速1.0柱溫:40°C色譜柱:C_18進(jìn)樣體積:200 μ I 流動相A:水-0.1%三氟乙酸流動相B:乙腈-0.08%三氟乙酸 洗脫梯度:
時(shí)間Β%
0.110
520
3050
4070
4510
60 10 活性檢查:該方法來源于2010年版中國藥典第三部附錄。
[0023]試驗(yàn)原理:適當(dāng)濃度的bFGF對BALB/c 3T3細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用，MTT在活細(xì)胞的線粒體中可以定量地被還原為MTT Formazan (甲瓚),通過比色法測定MTT Formazan的量可以直接表示BALB/c 3T3細(xì)胞的生長狀態(tài)，按50%最大效應(yīng)點(diǎn)的稀釋倍數(shù)可以折算為待檢品中的效價(jià)，測定結(jié)果用活性測定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。
[0024]試驗(yàn)方法:
第一天:(1)鋪板:消化和收集BALB/c3T3細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基I (20%BCS DMEM培養(yǎng)基)配成
8.0 XioVml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。
[0025]第二天:
(2)饑餓:取上一步制備的細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去各孔上清，加入完全培養(yǎng)基2(0.4% BCSDMEM培養(yǎng)基)，每孔100 μ I。37°C,5%C02條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。
[0026]第三天:
(3)制備樣品溶液:取樣品根據(jù)其蛋白濃度，用完全培養(yǎng)基2預(yù)稀釋一定倍數(shù)至蛋白濃度為I μ g/ml左右， 然后在96孔板中按4倍進(jìn)行梯度稀釋，每個稀釋度做2-3個復(fù)孔。
[0027](4)加樣:取第2步制備的細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去各孔上清，將稀釋好的樣品加入到各孔中，每孔加100 μ I。37°C，5%C02條件下培養(yǎng)64-72小時(shí)。
[0028]第六天:
(5)加入MTT溶液并培養(yǎng):每孔加入20 μ I 10'1'溶液(5.011^/1111)，371:，5%0)2條件下培養(yǎng)4-5小時(shí)。
[0029](6)加入裂解液并測定結(jié)果:吸去各孔上清液，加入裂解液(DMSO) 100 μ 1，溶解混勻后，用酶標(biāo)儀測定570/630nm吸光度。
[0030]結(jié)果計(jì)算:采用四參數(shù)法對結(jié)果進(jìn)行擬合，分別計(jì)算各樣品的半效稀釋倍數(shù)，然后分別計(jì)算樣品IC50等。
[0031]實(shí)施例2:
aFGF外用溶液的制備處方:
磷酸二氫鈉2.5g 磷酸氫二鈉2.5g 十二烷基磺酸鈉0.05g EDTA 0.1g 甘油20g 植酸鉀0.1g 注射用水加至IL aFGF IOOmg 共制 400 支。
[0032]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0033]純度檢查和活性檢查的方法同實(shí)施例1。
[0034]實(shí)施例3:
bFGF外用溶液的制備處方:
梓檬酸3g檸檬酸鈉7g
Tween80 0.1g
EDTA-2Na 0.215g
甘油50g
植酸0.15g
注射用水加至IL
bFGF 50mg 共制 400 支。
[0035]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0036]純度檢查和活性檢查的方法同實(shí)施例1。
[0037]實(shí)施例4:
表皮生長因子(EGF)外用溶液的制備處方:
梓檬酸8g 磷酸二氫鈉7g 半胱氨酸0.3g EDTA-2Na 0.3g 甘油100g 植酸鈉0.2g 注射用水加至IL
表皮生長因子300mg共制400支。
[0038]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0039]純度檢查和活性檢查的方法同實(shí)施例1。
[0040]實(shí)施例5:
bFGF外用溶液的制備 處方:
檸檬酸4g 磷酸氫二鈉16g 脂肪酸山梨坦0.2g EDTA 0.42g甘油80g
卵黃高磷蛋白0.3g
注射用水加至IL bFGF 400mg共制400支。
[0041]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生 物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0042]純度檢查和活性檢查的方法同實(shí)施例1。
[0043]實(shí)施例6:
aFGF外用溶液的制備處方:
磷酸二氫鈉8g 磷酸氫二鈉9g 精氨酸0.3g EDTANaCa 0.5g 甘油30g
葡聚糖磷酸酯0.5g 注射用水加至IL aFGF 500mg 共制 400 支。
[0044]具體制備方法如下:
(1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ；
(2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ；
(3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻；
(4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓?br> (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
[0045]純度檢查和活性檢查的方法同實(shí)施例1。
[0046]比較例
根據(jù)中國專利申請201110342458.1的處方，以人血白蛋白為保護(hù)劑制備的外用溶液。采用液相色譜法和活性法進(jìn)行檢測。
[0047]試驗(yàn)例:加速實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性比較 25 °C下避光放置60天結(jié)果
實(shí)施例純度活性
實(shí)施例196.5 %9.86X105U/mg
實(shí)施例 297.1 %9.69X105U/mg
實(shí)施例 398.4 %1.09X106U/mg
實(shí)施例 496.6 %9.60X 105U/mg實(shí)施例 5 96.0 %9.12X105U/mg
實(shí)施例 6 96.2 %9.03X105U/mg
比較例 77.2 %5.06X104U/mg 試驗(yàn)例:長期實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性比較 4°C下避光放置360天結(jié)果
實(shí)施例純度活性
實(shí)施例1 97.1 %1.01X106U/mg
實(shí)施例 2 97.7 %9.72X 105U/mg
實(shí)施例 3 97.8 %1.04X106U/mg
實(shí)施例 4 96.6 %9.34X105U/mg
實(shí)施例 5 96.8 %9.14X105U/mg
實(shí)施例 6 96.3 %8.89X105U/mg
比較例 76.4 %9.02X103U/mg從加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)來看，比較例純度和活性下降明顯，不適合長期保存，而實(shí)施例基本都能保持絕大部分的純度和活性，說明本專利涉及的處方構(gòu)成能夠有效地保持活性成分的穩(wěn)定。
[0048]
創(chuàng)傷模型有效性試驗(yàn)
1、動物模型選取:
選三只25kg的中華小型豬進(jìn)行動物試驗(yàn)，分別麻醉后在每一只背部造成直徑3cm深11°燒傷創(chuàng)面8個，以不含活性成分的生理鹽水做陰性對照，以比較例為陽性對照。
[0049]2、給藥方式:
清創(chuàng)后，陽性對照組的創(chuàng)面直接噴比較例溶液。其余各組按雙盲法進(jìn)行，以三次平行試驗(yàn)的方式，分別將例I至例6中所得的外用溶液在離創(chuàng)面5cm之處噴5次，以潔凈紗布覆蓋。以后每天以同樣的方法噴藥一次，共用藥13天。
[0050]3、創(chuàng)面愈合指標(biāo):
在每次換藥時(shí)測量創(chuàng)面直徑，直徑越小表明促愈合效果越好。
[0051]4、結(jié)果:
各樣品平均創(chuàng)面直徑(cm)
天數(shù)實(shí)施例比較例陰性對照
I23456
O 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.03.03.0
2 2.6 2.8 2.7 2.8 2.7 2.72.83.0
4 2.3 2.5 2.1 2.5 2.4 2.42.52.9
6 1.7 1.5 1.3 1.6 1.8 1.42.42.5
9 1.1 1.3 0.9 1.2 1.5 1.12.02.2
13 0.6 0.4 0.1 0.6 0.8 0.51.12.1
從結(jié)果可以看出， 實(shí)施例都優(yōu)于比較例，說明本專利涉及的處方構(gòu)成不會影響藥效，可以促進(jìn)蛋白更加穩(wěn)定地發(fā)揮生理活性作用，無任何刺激和致敏作用。
【權(quán)利要求】
1.一種含有生物蛋白的外用溶液，其特征在于按重量體積比(g/iooml)計(jì)算，含有生物蛋白的量為5-50mg/100mL、緩沖體系為0.5_2g/100mL、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑，余量為注射用水。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于所含的生物蛋白為成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、超氧化物歧化酶、卵磷脂化超氧化物歧化酶、層粘連蛋白、人類補(bǔ)體因子H、脂朊脂酶、雙調(diào)蛋白中的任意一種，其中優(yōu)選為成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、卵磷脂化超氧化物歧化酶。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于所述成纖維細(xì)胞生長因子為酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于所含的緩沖體系選自檸檬酸/檸檬酸鈉體系或磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉體系或檸檬酸/磷酸二氫鈉體系或檸檬酸/磷酸氫二鈉體系。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于所含的穩(wěn)定劑為5-30mg/100mL表面活性劑和10-50mg/100mL選自低分子右旋糖酐或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉或乙二胺四乙酸鈉鈣中任意一種的組合物。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于，其中表面活性劑選自吐溫80、氨基酸型、脂肪酸山梨坦、十二烷基磺酸鈉中的任意一種。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物蛋白外用溶液，其特征在于所含的保護(hù)劑為1-lOg/lOOmL甘油與5-50mg/100mL選自鹿糖八硫酸酯鈉、葡聚糖硫酸酯、植酸、質(zhì)酸鈉、植酸鈣、植酸鎂、植酸鉀、卵黃高磷蛋白、多聚磷酸銨、肌醇六硫酸酯中的任意一種的組合物。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1制備生物蛋白外用溶液的方法，步驟如下: (1)在局部百級的潔凈區(qū)內(nèi)將處方量`的緩沖體系、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑溶解于100ml注射用水中，用0.5-2mol/L鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值到4_6 ； (2)用0.22um濾膜過濾除菌，收集濾液,添加注射用水至IL ； (3)添加處方量的無菌生物蛋白混勻； (4)按每瓶2.5ml裝量無菌灌裝至噴霧瓶中，填充無菌氮?dú)猓? (5 )使用塑料袋在萬級潔凈區(qū)內(nèi)完成包裝，保存于2-8 V。
【文檔編號】A61K38/18GK103720642SQ201210391695
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】趙建多, 齊連權(quán), 文繼川, 邱慧, 尤冬超, 周麗瑩, 肖萱, 劉玉靜 申請人:北京泰德制藥股份有限公司