專利名稱：一株鴨出血性卵巢炎病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒。該病毒分離自一種新的鴨病。屬動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自2010年4月初以來，我國(guó)浙江、江蘇、山東、福建、河北、北京等省份的種鴨、
蛋鴨發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率急速下降、甚至停產(chǎn)及不同程度死亡為特征的疫病，俗稱種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降、卵巢出血癥，引起此病的病毒最初命名為鴨黃病毒(Duck flavivirusvirus, DFV),現(xiàn)基本統(tǒng)一命名為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus，DH0V)。各品種蛋鴨、種鴨等均有發(fā)生，但主要見于開產(chǎn)蛋鴨。產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間(4(T60d)的產(chǎn)蛋率低下，恢復(fù)后所產(chǎn)種蛋的受精率和孵化率出現(xiàn)下降。發(fā)病鴨采食量顯著下降，拉綠色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滯，體重減輕。少量病鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)、震顫，行走困難和姿勢(shì)異常。主要病變?yōu)槌鲅月殉惭?、間質(zhì)性肝炎和非化膿性腦炎。該病近期成為危害中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病之一。產(chǎn)蛋率高的鴨群患病后4 5(1從產(chǎn)蛋高峰或高產(chǎn)蛋率迅速下降至209Γ30%，嚴(yán)重的于發(fā)病后7d左右停產(chǎn)；剛開產(chǎn)種(蛋)鴨產(chǎn)蛋率上升緩慢或減蛋，長(zhǎng)時(shí)間低產(chǎn)蛋率或無產(chǎn)蛋高峰出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率幾乎100%，病死率為09Γ12%。國(guó)內(nèi)外研究資料，黃病毒一般能在鼠腦、C6/36、BHK-21、Vero等組織或細(xì)胞上進(jìn)行增殖，近年來，也有人接種9到10日齡雞胚或鴨胚尿囊液進(jìn)行病毒分離增殖?？紤]到細(xì)胞來源穩(wěn)定、質(zhì)量可控、無外源病毒污染，我們選定SPF源雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)作為分離這種病毒的唯一細(xì)胞系。眾所周知，CEF細(xì)胞來源于SPF雞胚，其供體背景清楚(不含任何病源)、制備工藝成熟、方法簡(jiǎn)單、對(duì)禽源病毒較為敏感。同時(shí)，SPF級(jí)鴨胚來源有限，而用SPF雞胚制備的CEF繁殖病毒，其每胚產(chǎn)量是SPF雞胚的10倍左右，且效價(jià)較高，在雞胚成纖維細(xì)胞繁殖的效價(jià)明顯高于雞胚和鴨胚上的效價(jià)。因此，我們選用CEF細(xì)胞用于這種病毒的分離培養(yǎng)，并取得成功，并對(duì)分離株進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定和E基因測(cè)序分析。由于是新發(fā)傳染病，人們對(duì)鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritisvirus, DHOV)的分離鑒定、生物學(xué)特性及主要抗原基因特征研究尚有較大的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是由病死蛋鴨體內(nèi)分離病原、并對(duì)其分離物進(jìn)行鑒定和利用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是采集病死鴨肝臟、卵巢等病變組織經(jīng)研磨、離心、濾過后進(jìn)行病原分離鑒定，對(duì)所獲得的病毒分離株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)、電鏡觀察、效價(jià)測(cè)定、疑似病原RT-PCR/PCR檢測(cè)及測(cè)序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測(cè)定、血清中和試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)作進(jìn)一步的鑒定。I.本研究通過對(duì)發(fā)病樣品處理，接種原代細(xì)胞CEF和MDCK等哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞，相繼獲得具有同一種CPE表現(xiàn)的病毒分離物，經(jīng)過效價(jià)測(cè)定、電鏡觀察、疑似病原RT-PCR/PCR檢測(cè)及E基因測(cè)序、核酸型鑒定、理化特性鑒定、血凝性測(cè)定、中和試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果表明該分離株為鴨出血性卵巢炎病毒(Duckhemorrhagic hvaritis virus, DH0V),命名為DHOV JN株,屬黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群成員。2.細(xì)胞培養(yǎng)特性DHOV-JN分離株具有較廣的細(xì)胞適應(yīng)譜，不僅能適應(yīng)禽源細(xì)胞(CEF)、組織(SPF雞胚)，也能適應(yīng)1 0(、8皿-21、31\￥61'0等哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞系，也間接說明該病毒的宿主范圍可能較廣，對(duì)此應(yīng)進(jìn)行深入研究?？紤]到細(xì)胞來源可控、無外源污染等因素，本研究選擇SPF源CEF作為分離、傳代、增殖該病毒的細(xì)胞，并取得成功，病毒能較好地適應(yīng)CEF，效價(jià)也較高，達(dá)到105 5TCID5(i/0. lmL。這為進(jìn)行病原鑒定、生物學(xué)特性、疫苗等研究奠定了極好的細(xì)胞平臺(tái)和研究基礎(chǔ)。3.病原學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了電鏡觀察、理化特性、可疑病原檢測(cè)、基因測(cè)序和進(jìn)化分析、病毒核酸型鑒定、血清中和研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒粒子大于60nm、呈六邊形、有囊膜；該病毒對(duì)熱敏感(56°C 15min可滅活)，對(duì)氯仿、乙醚和堿敏感，對(duì)酸、胰酶不敏感；用AIV等8種禽源病毒RT-PCR/PCR和黃病毒RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅能檢出黃病毒核酸陽性，測(cè)定其E基因長(zhǎng) 度為1503bp,構(gòu)建了基于黃病毒E基因的遺傳進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)該分離株屬黃病毒屬恩塔亞病毒群的成員；IUDR代謝試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該分離株的核酸型為RNA ;該分離株不能被禽流感、新城疫、減蛋綜合癥、鴨肝炎、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎、番鴨呼腸孤以及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥等8種常見禽源病毒的陽性血清所中和。4.病毒的致病性為驗(yàn)證DHOV-JN株對(duì)禽類的致病性，我們進(jìn)行了該毒株對(duì)SPF雞胚、SPF小雞、SPF蛋雞、雛鴨以及臨床健康蛋鴨的致病性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHOV-JN株可使9日齡SPF雞胚的發(fā)育顯著推遲，解剖發(fā)現(xiàn)胚體出血、成型雞胚的肝臟腫大、呈現(xiàn)“花斑肝”。DHOV-JN株能致死2日齡SPF小雞，一般3 5天死亡，死亡率為30% 50% ;初期雞只食欲較對(duì)照差，耐過后無影響；死亡雞解剖可見腦膜變軟，腎臟和脾臟稍微腫大。但該病毒對(duì)50日齡的SPF雞沒有顯著的臨床影響。但該病毒對(duì)剛孵出的2日齡雛鴨具有致死性，用DHOV-JN株攻擊2日齡雛鴨，實(shí)驗(yàn)組全部死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟病變嚴(yán)重，多器官出血；對(duì)開產(chǎn)蛋鴨具有較強(qiáng)的致病性，解剖發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降，卵巢組織出現(xiàn)了卵泡液化、卵泡發(fā)育遲緩、出血以及輸卵管萎縮等現(xiàn)象，肝臟發(fā)黃、腫大、質(zhì)地變脆，脾臟腫大等。上述結(jié)果表明，分離自蛋鴨的DHOV-JN株對(duì)雞、鴨都具有極強(qiáng)的致病性，是否對(duì)鵝具有致病性由于時(shí)間關(guān)系本研究為開展試驗(yàn)，但據(jù)黃欣梅(黃欣梅，李銀，趙冬敏，等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27 (2) :354 360.)等的研究，這種病毒對(duì)鵝也具有相似的致病性。這些結(jié)果證實(shí)，這種新分離到的禽黃病毒對(duì)家禽業(yè)具有顯著危害，需要加強(qiáng)流行病學(xué)、病原學(xué)、免疫學(xué)等研究。綜上所述I.該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic hvaritis virus, DHOV)JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏號(hào)為 CGMCCNo. 5907。2.該分離毒株主要特點(diǎn)(I)分離的鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒從一種臨床癥狀稱為鴨出血性卵巢炎的病鴨采集肝臟、卵巢組織，用SPF源CEF分離獲得；
(2)鴨出血性卵巢炎病毒 CGMCC No. 5907 株病毒能在 CEF、MDCK、Vero、BHK_21、ST和Marc-145單層細(xì)胞上進(jìn)行增殖，并能致這些細(xì)胞產(chǎn)生較為一致的CPE ；(3)用 SPF 源 CEF 測(cè)得 CGMCC No. 5907 株病毒效價(jià)為 105_5TCID5(l/0. ImL ；(4) CGMCC No. 5907株病毒接種雞/和鴨能復(fù)制出典型的鴨出血性卵巢炎。3.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒用于制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。4.鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗(yàn)中用作攻毒毒株。
具體實(shí)施例方式I.病毒分離 (I)病料處理本發(fā)明人由某蛋鴨場(chǎng)產(chǎn)蛋下降病鴨中采集，每份病料主要有病死蛋鴨的部分卵巢組織、肝臟等病變組織。無菌操作剪取5. Og組織，加入少量的MEM (含青霉素、鏈霉素1000U/mL)，研磨至糊狀，再加入4倍體積的MEM稀釋成懸濁液，樣品在_80°C和室溫反復(fù)凍融3次,再經(jīng)4°C、12000r/min離心IOmin,收集上清液用O. 22 μ m的一次性濾器濾過除菌，最后分裝_80°C凍存?zhèn)溆谩?2)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)分離用9日齡SPF雞胚(SPF雞胚，SPF蛋雞均購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，無菌條件下去頭、爪、內(nèi)臟以眼科翦剪碎，然后加
O.25%的胰酶進(jìn)行消化，待液體自然渾濁后加MEM培養(yǎng)基終止，再用滅菌的6層紗布過濾后搖勻分裝入普通細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待CEF鋪滿單層后按5%的量接入經(jīng)預(yù)處理、并濾過除菌的組織上清液，繼續(xù)培養(yǎng)觀察至72h，無論有無病變均收獲，然后繼續(xù)盲傳至F5代，直至細(xì)胞病變出現(xiàn)并趨于穩(wěn)定，收獲培養(yǎng)物_80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ∫?80°C保存的病料處理上清液接種CEF，連續(xù)傳7代，經(jīng)觀察傳至F4代開始出現(xiàn)CPE，F(xiàn)5代的50h CEF開始出現(xiàn)CPE，65h時(shí)病變明顯(75%細(xì)胞有病變)，CPE主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、融合，并逐漸拉網(wǎng)，然后脫落崩解。見下

圖1、2。從F5代開始CPE趨于穩(wěn)定。(3)病毒在其他細(xì)胞上的增殖用_80°C凍存的病毒CEF F5代培養(yǎng)物各ImL分別接種已長(zhǎng)滿單層的MDCK (狗腎傳代細(xì)胞)、VeiO (非洲綠猴腎細(xì)胞)、BHK-21 (乳倉鼠腎細(xì)胞)、ST (豬睪丸細(xì)胞)以及Marc-145 (非洲綠猴腎細(xì)胞克隆細(xì)胞株)(以上傳代細(xì)胞均為本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室保藏)，作用I 2h后，置37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)觀察，記錄各種細(xì)胞的CPE情況。傳代增殖方法與用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)方法基本相同。用JN株CEF F5代分離物分別接種MDCK、Vero、BHK_21、ST以及Marc-145單層細(xì)胞，均能產(chǎn)生明顯的CPE，病變表現(xiàn)與病毒致CEF的特點(diǎn)基本一致。2.分離物的鑒定(I)效價(jià)測(cè)定取新制備好的CEF細(xì)胞，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液100 μ L，待細(xì)胞長(zhǎng)成良好單層后。取置于一 80°C保存的JN株CEF F5代分離物進(jìn)行10倍系列稀釋至10_7，取每個(gè)稀釋度的病毒液，分別接種于已生長(zhǎng)良好CEF細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種8孔，每孔100 μ L，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各8孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37°C、5%C02培養(yǎng)3 5d，每天觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變的情況，出現(xiàn)CPE者判為感染，按Reed —Muench法計(jì)算TCID5tl，結(jié)果測(cè)定JN株CEF F5代分離物的效價(jià)(TCID5tl)為105 5/0· ImL0
(2)電鏡觀察取JN株CEF F5代分離物做負(fù)染電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JN株CEF F5代病毒粒子大于60nm、呈六邊形、有囊膜，見圖3。(3)中和試驗(yàn)用固定抗體一稀釋病毒法進(jìn)行。取一 80°C保存的JN株CEF F5代分尚物，根據(jù)病毒含量測(cè)定結(jié)果將待檢病毒液稀釋為100TCID5(i/0. ImL,將病毒稀釋液分別與等體積的AIV、NDV、EDSV、DHV、IBDV、IBV、MDRV以及REV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(均購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)震蕩混合均勻，至37°C作用2h，期間震蕩2 3次。作用結(jié)束后，將中和液接種96孔CEF細(xì)胞板，每孔100 μ L，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37°C、5%C02培養(yǎng)5 7d,每天觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變的情況并詳細(xì)記錄。按Reed — Muench法計(jì)算TCID50,結(jié)果未見任何一份血清被中和，說明JN株不屬于這些常見的禽源病毒，需要進(jìn)一步鑒定。(4)核酸型鑒定用終濃度為50 μ g/mL的5’-碘脫氧尿核苷處理DHOV-JN株CEF F5代培養(yǎng)物后，測(cè)得其TCID50S IO5.3/0· lrnL，未處理對(duì)照組TCID5tl為105 5/0· lmL，說明5’-碘 脫氧尿核苷不能抑制JN分離株在CEF中的增殖，該病毒為RNA病毒。(5)疑似病原RT-PCR/PCR檢測(cè)登錄GenBank，下載51個(gè)具有代表性的黃病毒全基因序列，經(jīng)DNAstar軟件分析其E基因后，利用Primer5. O軟件設(shè)計(jì)了 I對(duì)檢測(cè)引物，F(xiàn)LVTF 5’ -TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’，F(xiàn)VTRl :5’ -TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’，預(yù)期目的片段為549bp ;按照本發(fā)明中初步建立的本病以及其他8種病毒的RT-PCR檢測(cè)方法(見表I)進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測(cè)(圖4)。表I分離毒及8種疑似禽源病毒PCR檢測(cè)條件
權(quán)利要求
1.一株鴨出血性卵巢炎病毒，其特征在于該株病毒為鴨出血性卵巢炎病毒DHOV-JN株，該株病毒已于2012年3月22日將該分離株送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5907。
2.如權(quán)利要求I所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒，其特征在于 (1)鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒從一種臨床癥狀稱為鴨出血性卵巢炎的病鴨采集肝臟、卵巢組織，用SPF源CEF分離獲得； (2)鴨出血性卵巢炎病毒CGMCCNo. 5907株病毒能在CEF、MDCK, Vero, BHK-21、ST和Marc-145單層細(xì)胞上進(jìn)行增殖，并能致這些細(xì)胞產(chǎn)生較為一致的CPE ；(3)用SPF 源 CEF 測(cè)得 CGMCC No. 5907 株病毒效價(jià)為 105·5TCID50/0. ImL ； (4)CGMCC No. 5907株病毒接種雞/和鴨能復(fù)制出典型的鴨出血性卵巢炎。
3.如權(quán)利要求I所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒的應(yīng)用，其特征在于鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒用于制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。
4.如權(quán)利要求3所述的一株鴨出血性卵巢炎病毒的應(yīng)用，其特征在于鴨出血性卵巢炎病毒CGMCC No. 5907株病毒在鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗(yàn)中用作攻毒毒株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株鴨出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis,DHOV)。從臨床發(fā)病蛋鴨的組織病料中用SPF源雞胚成纖維細(xì)分離到一株DHOV-JN，該分離株能在CEF上增殖并能致其產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變，亦能在MDCK、Vero、BHK-21、ST和Marc-145單層細(xì)胞上進(jìn)行增殖并出現(xiàn)較為一致的CPE，用CEF測(cè)得分離株效價(jià)為105.5TCID50/0.1mL；該分離株屬黃病毒科、黃病屬、恩塔亞病毒群的成員；該毒株可以此研究為基礎(chǔ)開發(fā)相應(yīng)的RT-PCR檢測(cè)/診斷方法(試劑)，也可研制用于本病臨床預(yù)防用疫苗等生物制品。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102899295SQ20121042534
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者鄒敏, 吳發(fā)興, 劉 東, 劉新文, 申洪銀, 孫健, 劉蕾, 范根成, 杜元釗 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司