專利名稱：隱孔菌在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及隱孔菌的新用途，特別涉及隱孔菌在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢病毒屬是反轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個(gè)屬，此屬病毒的特征是需要較長的時(shí)間才能培養(yǎng)出來，例如人類免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性貧血(EIA)病病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)都是慢病毒屬，慢病毒屬的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。慢病毒屬可以由宿主細(xì)胞直接感染周圍的細(xì)胞，不必經(jīng)由形成病毒顆粒此一步驟。隱孔菌(Cryptoporus volvatus (Peck) )Shear是一種生于松林樹干上的野生大型真菌，也有記載生于衰老的冷杉、云杉的樹干或枯立木上，我國的云南、廣東、廣西、海南等 多個(gè)省份都有分布。隱孔菌子實(shí)體較小，無柄或偶爾有柄，一般側(cè)生于基物上，木栓質(zhì)，扁球形或近球形，I. 5-3. 5cmX 2-4. 5cm,厚l_3cm,蓋表面光滑，淺土黃色或深蛋殼色，老后淡紅褐色。邊緣純滑而厚，與菌幕相連。菌幕白色至污白色，且與菌蓋色調(diào)明顯不同，厚約1_。菌管層由菌幕所包蓋，初期完全封閉，后逐漸在靠近基部出現(xiàn)一個(gè)圓形或近圓形的孔口，偶有兩個(gè)，孔徑2-4. 5mm。菌肉純白至污白色,軟木栓質(zhì),厚2_8mm。菌管同菌肉色,長2_5mm,管口圓形至近多角形，管口面淺粉灰色或帶褐色，每毫米3-5個(gè)，壁厚，口緣完整。孢子光滑、無色、長橢圓形，10-13 μ mX 4-6 μ m。云南麗江民間曾作為小兒斷奶時(shí)的口含物，或水煎服治療氣管炎和哮喘。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供隱孔菌的新用途。本發(fā)明所提供的隱孔菌的新用途是下述I) -6)中的至少一種I)隱孔菌提取物在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。2)隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中合成RNA的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。3)隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。4)隱孔圃在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用。5)隱孔菌在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中合成RNA的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用。6)隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用。上述I) -6)中，所述隱孔菌可為子實(shí)體和/或菌絲體和/或孢子。所述隱孔菌子實(shí)體可為新鮮的子實(shí)體也可為干燥的子實(shí)體。上述慢病毒可為野生型的慢病毒也可為重組的慢病毒，在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述慢病毒為重組慢病毒，如含有GFP基因的重組慢病毒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，貨號(hào)D03003)o在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述寄主細(xì)胞為Hela細(xì)胞。上述隱孔菌提取物可按照如下方法獲得將隱孔菌子實(shí)體粉碎后用水浸提，收集水溶性物質(zhì)得到所述隱孔菌提取物。上述隱孔菌提取物的制備方法中，所述隱孔菌子實(shí)體可粉碎至50-80目。上述隱孔菌提取物的制備方法中，所述用水浸提可為在4_65°C (如4-10°C、50-65。。、4。?；?50°C)用水浸提 10-14 小時(shí)。上述隱孔菌提取物的制備方法中，可采用離心分離所述水溶性物質(zhì)。所述離心采 用的離心力可為8000-10000g，離心時(shí)間可為10-20分鐘(如10-15分鐘或15-20分鐘)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明用隱孔菌制備的隱孔菌提取物能夠劑量依賴性地抑制含有GFP基因的重組慢病毒在Hela細(xì)胞中合成GFP的RNA和進(jìn)行GFP基因表達(dá)，在隱孔菌提取物濃度為O. 5mg/ml時(shí)能使GFP的RNA表達(dá)量降至不加隱孔菌提取物對(duì)照的二十分之一，從而抑制慢病毒感染寄主細(xì)胞。


圖I為熒光顯微鏡觀察加入0、0. 3和O. 5mg/L的隱孔菌提取物的Hela細(xì)胞中GFP基因的表達(dá)情況。圖中，0、0. 3和O. 5mg/L為隱孔菌提取物培養(yǎng)液的濃度。圖2為加入的隱孔菌提取物的Hela細(xì)胞中GFP的mRNA表達(dá)水平。圖中橫坐標(biāo)為隱孔菌提取物培養(yǎng)液的濃度。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的隱孔菌(Cryptoporusvolvatus (Peck) Shear) (KohmeiKADOWAKI. Behavioral observation of two fungivorous beetles (Coleoptera:Tenebrionidae)on wood-decaying bracket fungus Cryptoporus volvatusens_. EntomologicalScience (2010) 13, 159-161)采自中國云南，公眾可從野外采集，也可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例I、用隱孔菌制備慢病毒抑制劑一、隱孔菌提取物的制備用蒸餾水浸泡隱孔菌干子實(shí)體，水與隱孔菌干子實(shí)體的重量比為6:1，4°C浸泡2-4小時(shí)，勻漿器充分?jǐn)囁橹?0目，4°C浸提10小時(shí)，8000g離心20分鐘，收集上清液，凍干，得到隱孔菌提取物。該隱孔菌干子實(shí)體是將新鮮的隱孔菌子實(shí)體在常溫下干燥得到的。下述步驟二的實(shí)驗(yàn)中所用的隱孔菌提取物，均用生理鹽水溶解并通過0. 22微米的過濾器過濾除菌后使用。二、隱孔菌提取物抑制重組慢病毒體外感染
I、實(shí)驗(yàn)方法I. I隱孔菌提取物抑制重組慢病毒感染細(xì)胞活性的測(cè)定將Hela (人宮頸癌細(xì)胞)細(xì)胞于96孔板中，用RPMI 1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清FBS)于37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24h。接種含有GFP基因的重組慢病毒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，貨號(hào)D03003)顆粒(MOI=O. I)，在病毒感染的同時(shí)分別加入100 μ I含有0、0. 3和O. 5mg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液(用新鮮RPMI1640培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為O. 3和O. 5mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以等體積的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液(Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液)做對(duì)照)，每一濃度的隱孔菌提取物培養(yǎng)液8孔，37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48h,通過在突光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)的方法檢測(cè)隱孔菌提取物抑制重組慢病毒感染Hela細(xì)胞的活性。I. 2、隱孔菌提取物抑制重組慢病毒基因在細(xì)胞內(nèi)RNA合成活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)前一天接種Hela(人宮頸癌細(xì)胞)細(xì)胞于96孔板中，用RPMI 1640培養(yǎng)液 (10%胎牛血清FBS)于37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24h。接種重組慢病毒顆粒(MOI=O. 1)，在病毒感染的同時(shí)分別加入100 μ I含有O、O. 3和O. 5mg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液(用新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為O. 3和O. 5mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以等體積的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液(Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液)做對(duì)照)，每一濃度的隱孔菌提取物培養(yǎng)液8孔，37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA做Real-Time PCR0RNA提取、反轉(zhuǎn)錄以及Real-Time PCR :每孔細(xì)胞加Iml RNA提取試劑Trizol,反復(fù)用移液器吹打混勻，轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管中，室溫靜置5min ;在上述離心管中，加入O. 2ml氯仿，蓋上蓋子，在手中用力震蕩15秒，室溫靜置IOmin ;4°C、12000g離心15min ;取上層水相置于新的I. 5ml離心管中,加入O. 5ml異丙醇，室溫靜置IOmin ；4°C、12000g離心IOmin ；小心棄上清，加Iml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，4°C、7500g離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，最后加入 20 μ I DEPC 水溶解 RNA,用 Nanodrop 1000 (Thermo scientific)定量 RNA。取500ng RNA 做 RT-PCR。于 250 μ I 離心管中加入 500ng RNA 與 I μ I RandomPrimer (10 μ m, TaKaRa),混勻；70°C 5min,迅速置冰上冷卻2min ;向上述混合物中加入以下組分M-MLV 5x Reaction Buffer 5 μ I, dNTP (2. 5mM each) 5 μ 1，重組 RNA 酶抑制劑25單位，M-MLV RT (Promega) 200units,最后加DEPC水補(bǔ)齊體積到25 μ I ;輕輕混勻，37°C60min ;將PCR管轉(zhuǎn)移至70°C，15min ;置于冰上冷卻，cDNA產(chǎn)物保存于_20°C。Real-Time PCR使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)反應(yīng)體系。SYBR Premix Ex TaqTM (2Χ)10μ I, PCR 引物 GFPF(TGCAGTGCTTCAGCCGCTAC)(序列表中的序列 I)、GFPRC CGTTCTTCTGCTTGTCGGCCAT )(序列表中的序列 2 )；GAPDH( forward5，-CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC-3，，reverse5，-GACGCCTGCTTCACCACC(均 10 μ m)各 O. 8 μ 1，ROXReference Dye II (50X ) 0· 4 μ I, cDNA 模板 2 μ I,無菌雙蒸水 6 μ I,總體積 20 μ I。在ABI 7900Real-Time PCR System上反應(yīng)，采取兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95°C 30s ;95°C 5s、60°C 30s (40個(gè)循環(huán))。用SDS2. 2. 2for 7900軟件分析處理數(shù)據(jù)。以細(xì)胞看家基因GAPDH為參照，定量GFP的表達(dá)。3、數(shù)據(jù)分析
所有數(shù)據(jù)都是獨(dú)立重復(fù)三次得到的平均值，用雙尾T-test (成對(duì))分析差異顯著性，P 彡 O. 05 被認(rèn)為差異顯著，O. OKP 彡 O. 05(*)，0· OOKP 彡 O. 01(**)，P 彡 O. 001(***)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明隨著隱孔菌提取物濃度的增高，GFP基因表達(dá)的綠色熒光蛋白量明顯減少，加入O. 5mg/ml的隱孔菌提取物處理中已經(jīng)觀察不到綠色熒光(圖1)，加入O. 5mg/ml的隱孔菌提取物處理中GFP基因表達(dá)量是加入Omg/ml的隱孔菌提取物處理的二十分之一(圖 2)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱孔菌提取物能夠劑量依賴性地抑制重組慢病毒基因在Hela細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)，從而抑制病毒感染細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.隱孔菌提取物在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體 中提取的水溶性物質(zhì)。
2.隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中合成RNA的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述隱孔 菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
3.隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述 隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
4.隱孔菌在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用。
5.隱孔菌在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中合成RNA的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
6.隱孔菌提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了隱孔菌的新用途。本發(fā)明所提供的隱孔菌的新用途是下述1)-3)中的至少一種1)隱孔菌或其提取物在制備慢病毒抑制劑中的應(yīng)用；2)隱孔菌或其提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中合成RNA的產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)隱孔菌或其提取物在制備抑制慢病毒在寄主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K36/06GK102949417SQ20121045503
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者王賀祥, 封文海, 高麗, 張薇薇, 馬增強(qiáng), 朱孟娟, 杜芳, 張瑞, 劉芹, 特日根, 陳曉, 王麗 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)