專利名稱：隱孔菌的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及隱孔菌的新用途，特別涉及隱孔菌在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍(lán)耳病)(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的豬的傳染性疾病。各種年齡的豬均易感染該病毒，其主要癥狀是妊娠母豬感染后引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱胎，感染仔豬可發(fā)生呼吸障礙和高病死率。該病于1987年在美國首次報(bào)道，上世紀(jì)九十年代中期傳入我國。目前，該病發(fā)生于世界上幾乎所有養(yǎng)豬國家，為我國和世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年在我國爆發(fā)了由PRRSV變異株引起的高致病豬繁殖與呼吸綜合征，其特點(diǎn)為急性高致死，仔豬發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率高達(dá)50%，母豬流產(chǎn)率達(dá)35%以上，而且母豬和育肥豬死亡率高達(dá)30%。此次爆發(fā)高致病豬繁殖與呼吸綜合征給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的病毒性傳染病。PRRSV屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15. 4kb，病毒在細(xì)胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體組裝成熟，并以出芽形式釋放聚集在細(xì)胞內(nèi)囊泡中，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，完成病毒復(fù)制周期。
目前，預(yù)防和控制PRRS病毒感染和傳播主要靠疫苗，然而卻不成功。針對(duì)PRRS病毒的疫苗包括弱毒疫苗和滅活苗已經(jīng)應(yīng)用多年，然而和疫苗株幾乎一致的毒株引起的繁殖與呼吸綜合征仍然發(fā)生。非典型或急性繁殖與呼吸綜合征在免疫豬群爆發(fā)，以及2006年在我國爆發(fā)的高致病繁殖與呼吸綜合征更是對(duì)目前所用疫苗的保護(hù)性和安全性提出質(zhì)疑。因此，開發(fā)特異、高效的抗PRRS病毒藥物對(duì)預(yù)防和控制繁殖與呼吸綜合征具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
隱孔菌(Cryptoporus volvatus (Peck) Shear是一種生于松林樹干上的野生大型真菌，也有記載生于衰老的冷杉、云杉的樹干或枯立木上，我國的云南、廣東、廣西、海南等多個(gè)省份都有分布。隱孔菌子實(shí)體較小，無柄或偶爾有柄，一般側(cè)生于基物上，木栓質(zhì)，扁球形或近球形，I. 5-3. 5cmX 2-4. 5cm,厚l_3cm,蓋表面光滑，淺土黃色或深蛋殼色，老后淡紅褐色。邊緣純滑而厚，與菌幕相連。菌幕白色至污白色，且與菌蓋色調(diào)明顯不同，厚約1_。 菌管層由菌幕所包蓋，初期完全封閉，后逐漸在靠近基部出現(xiàn)一個(gè)圓形或近圓形的孔口，偶有兩個(gè)，孔徑2-4. 5mm。菌肉純白至污白色,軟木栓質(zhì),厚2_8mm。菌管同菌肉色,長2_5mm, 管口圓形至近多角形，管口面淺粉灰色或帶褐色，每毫米3-5個(gè)，壁厚，口緣完整。孢子光滑、無色、長橢圓形，10-13 μ mX 4-6 μ m。云南麗江民間曾作為小兒斷奶時(shí)的口含物，或水煎服治療氣管炎和哮喘。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供隱孔菌的新用途。
本發(fā)明所提供的隱孔菌的新用途是下述I) _4)中的至少一種
I)隱孔菌在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用；
2)隱孔菌在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用；
3)隱孔菌提取物在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)；
4)隱孔菌提取物在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品 (如藥物)中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
上述I) -4)中，所述隱孔菌可為子實(shí)體和/或菌絲體和/或孢子。所述隱孔菌子實(shí)體可為新鮮的子實(shí)體也可為干燥的子實(shí)體。
上述2)和4)中，所述寄主細(xì)胞可為豬細(xì)胞、CL2621細(xì)胞或MARC44細(xì)胞，所述豬細(xì)胞具體可為豬肺泡巨噬細(xì)胞。
上述3)和4)中，所述隱孔菌提取物可按照如下方法獲得將隱孔菌子實(shí)體粉碎后用水浸提，收集水溶性物質(zhì)得到所述隱孔菌提取物。
上述隱孔菌提取物的制備方法中，所述隱孔菌子實(shí)體可粉碎至50-80目。
上述隱孔菌提取物的制備方法中，所述用水浸提可為在4_65°C (如4_10°C、 50-65。。、4。。或 50°C)用水浸提 10-14 小時(shí)。
上述隱孔菌提取物的制備方法中，可采用離心分離所述水溶性物質(zhì)。所述離心采用的離心力可為8000-10000g，離心時(shí)間可為10-20分鐘(如10-15分鐘或15-20分鐘)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明用隱孔菌制備的隱孔菌提取物能夠顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬肺泡巨噬細(xì)胞和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)中復(fù)制，可以使病毒數(shù)量減少至原來的萬分之一，隱孔菌提取物對(duì)仔豬沒有明顯的毒副作用，能夠減輕PRRSV高致病毒株感染仔豬引起的高熱，降低仔豬血清病毒滴度，提高感染仔豬的存活率。


圖I為MTT法測(cè)定0-0. 7mg/L的隱孔菌提取物溶液對(duì)PAMs的細(xì)胞毒性結(jié)果。
圖2為間接免疫熒光測(cè)定0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液抑制PRRSV CH-Ia株在MARC-145細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制結(jié)果。
Marc-145細(xì)胞感染PRRSV CH-Ia株(MOI=O. I) 2小時(shí)后，換含有或不含有隱孔菌提取物的培養(yǎng)液，24小時(shí)后進(jìn)行間接免疫熒光，檢測(cè)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
圖3為0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液抑制PRRSV CH-Ia株毒株在MARC-145 細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
Marc-145細(xì)胞感染PRRSV CH-la (MOI=O. I) 2小時(shí)后，換含有或不含有隱孔菌提取物的培養(yǎng)液，24小時(shí)后收集上清測(cè)病毒滴度。
圖4為間接免疫熒光測(cè)定0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液抑制PRRSV高致病毒株JXwn06在PAMs細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制結(jié)果。
HPV表示PRRSV高致病毒株JXwn06。
PAMs細(xì)胞感染PRRSV高致病毒株JXwn06 (MOI=O. 1)2小時(shí)后，換含有或不含有隱孔菌提取物的培養(yǎng)液，24小時(shí)后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
圖5為0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液抑制PRRSV VR2332株和PRRSV高致病毒株JXwn06在PAMs細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
PAMs 分別感染 PRRSV VR2332 株和 PRRSV 高致病毒株 JXwn06(M0I=0. I )，2h 后，換含有或不含有隱孔菌提取物的培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)24h后收上清測(cè)病毒滴度。
圖6為隱孔菌提取物降低PRRSV高致病毒株JXwn06引起的高熱癥狀。
圖7為隱孔菌提取物降低PRRSV高致病毒株JXwn06感染仔豬的血清病毒滴度。
圖8為隱孔菌提取物提高PRRSV高致病毒株JXwn06感染仔豬的存活率。
圖9為用0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液預(yù)處理Marc-145細(xì)胞，不抑制PRRSV 感染。
圖10為用0-0. 6mg/L的隱孔菌提取物培養(yǎng)液與病毒共孵育，對(duì)病毒活性沒有明顯抑制作用。
圖11為隱孔菌提取物抑制PRRSV RNA的合成。
圖12為隱孔菌提取物對(duì)PRRSV RNA依賴的RNA聚合酶活性的影響。
圖13為隱孔菌提取物抑制PRRSV蛋白的合成。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中的隱孔菌(Cryptoporusvolvatus (Peck) Shear) (Kohmei KADOWAKI. Behavioral observation of two fungivorous beetles (Coleoptera:Tenebri onidae)on wood-decaying bracket fungus Cryptoporus volvatusens_. Entomological Science (2010) 13, 159-161)采自中國云南，公眾可從野外采集，也可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得， 以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
下述實(shí)施例中的PRRSV 高致病毒株 JXwn06 (Lei Zhou, et al. The30-Amino-Acid Deletion in the Nsp2of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Emerging in China Is Not Related to Its Virulence. JOURNAL OF VIROLOGY, May2009, p. 5156 - 5167)、PRRSV CH-la 株(謝麗基，等.廣西高致病性 PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位預(yù)測(cè).動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展。2008，29(1) :1_4)及PRRSV VR2332株(謝麗基等.廣西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位預(yù)測(cè).動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展。2008，29⑴1_4);在符合國家生物安全的有關(guān)規(guī)定的情況下公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例I、用隱孔菌制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑
一、隱孔菌提取物的制備
用蒸餾水浸泡隱孔菌干子實(shí)體，水與隱孔菌干子實(shí)體的重量比為6:1，4°C浸泡 2-4小時(shí)，勻漿器充分?jǐn)囁橹?0目，4°C浸提10小時(shí)，8000g離心20分鐘，收集上清液，凍干， 得到隱孔菌提取物。該隱孔菌干子實(shí)體是將新鮮的隱孔菌子實(shí)體在常溫下干燥得到的。
下述步驟二的實(shí)驗(yàn)中所用的隱孔菌提取物，均用生理鹽水溶解并通過0. 22微米的過濾器過濾除菌后使用。
二、隱孔菌提取物抑制豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒在豬肺泡巨噬細(xì)胞和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)中復(fù)制
實(shí)驗(yàn)證明，步驟I的隱孔菌水提取物能夠顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒在豬肺泡巨噬細(xì)胞和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)中復(fù)制，滴度可以低104，即病毒數(shù)量減少至原來的萬分之一，表明該提取物具有很強(qiáng)的抑制PRRS病毒的能力。具體的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
I、實(shí)驗(yàn)方法
I. I豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離和病毒液的制備
將8周齡的無特定病原(SPF)的仔豬放血，無菌摘取其肺臟，先用O. 9%的無菌生理鹽水洗滌外表面，然后將PH7. 2的Hanks平衡鹽溶液(HBSS) 30. Oml從氣管灌入肺臟，輕輕按摩肺表面，Ilmin后回收灌洗液，如此反復(fù)進(jìn)行，直至灌洗液清亮為止。將回收的支氣管肺泡灌洗液300g離心lOmin，收集的細(xì)胞即為豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)。用RPMI1640洗滌兩次后加入適量RPMI1640 (10%胎牛血清FBS)培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶中于37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后棄去上清及非黏附細(xì)胞繼續(xù)用RPMI1640 (10%FBS)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
PRRSV高致病毒株JXwn06從發(fā)病豬場(chǎng)分離得到，在豬肺泡巨噬細(xì)胞上繁殖。將豬肺泡巨噬細(xì)胞接種到75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，吸去上清液，接入稀釋好的病毒液3ml (病毒感染復(fù)數(shù)MOI=O. 5，即感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值為O. 5) ;37°C吸附 60min，期間每隔15min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以使病毒液與細(xì)胞充分接觸；60min后，補(bǔ)加培養(yǎng)液，置于37°C培養(yǎng)；36h后在_80°C和室溫之間凍融細(xì)胞三次，以裂解細(xì)胞；將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，4°C、5000g離心lOmin，上清液即為病毒液，將上清液分裝至I. 5ml EP 管，保存于_80°C備用。
I. 2細(xì)胞被病毒半數(shù)感染量(TCID5tl)的測(cè)定
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種豬肺泡巨噬細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;在I.5ml EP管中用細(xì)胞培養(yǎng)液將病毒液作連續(xù)10倍的梯度稀釋，從ICT1至10_7 ;將稀釋好的病毒液接種到豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種8孔，每孔接種ΙΟΟμ I ;設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照8孔；接毒后第四天，觀察并記錄每個(gè)稀釋度病毒陽性孔的數(shù)量，計(jì)算病毒TCID5tl。得到病毒的TCID5tl可用于計(jì)算病毒的感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι)，即感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。
I. 3間接免疫熒光(IFA)法檢測(cè)病毒間接免疫熒光法以熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體，抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體與已結(jié)合的抗體發(fā)生作用，從而推知抗原或抗體的存在。
用甲醇丙酮(1:1)固定液4°C固定細(xì)胞IOmin ;PBS洗兩次，5%羊血清37°C封閉 30min ;吸去上清，加抗 PRRS 病毒 N 蛋白的一抗 SD0W17 (1:10, OOORural Technologies), 4°C過夜；PBS洗3次，每次5min，加綠色熒光FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗(1:2000, Jackson Immuno Research)，，37°C避光Ih ；PBS洗3次，每次5min ;熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，綠色熒光表示在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒。
I. 4噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定隱孔菌提取物的細(xì)胞毒性
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
將豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)分別用 RPMI1640 (10%胎牛血清FBS)或DMEM (10%胎牛血清FBS)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種到 96孔板，37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h。用培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為O. I、O. 2、O. 3、O. 4、O. 5、O. 6和O. 7mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以等體積的生理鹽水做對(duì)照。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等體積的上述濃度的隱孔菌提取物培養(yǎng)液或生理鹽水， 每一濃度的隱孔菌提取物培養(yǎng)液8孔,生理鹽水8孔；37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)48h,每孔加入MTT溶液(5mg/ml，用pH=7. 4的PBS配制)20 μ I，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加150μ1 DMSO (二甲基亞砜)，37°C孵育lOmin，使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀在 550nm波長處測(cè)吸光度，以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率
實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率=OD (實(shí)驗(yàn)組)/0D (對(duì)照組)％。
I. 5隱孔菌提取物抑制PRRSV不同毒株在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)上的復(fù)制
將PAMs 和 MARC-145 分別用 RPMI1640 培養(yǎng)液(10% 胎牛血清 FBS )或 DMEM (10% 胎牛血清FBS)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種到96孔板，37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h。分別接種 PRRSV CH-Ia 株(MOI=O. I)、PRRSV 高致病毒株 JXwn06 (MOI=O. I)及 PRRSV CH-Ia 株 (MOI=O. I )，病毒感染后2小時(shí)棄掉上清液，分別加入等體積的含有0、0. 2,0. 4,0. 6mg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液(用新鮮RPMI1640培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為O. 2、0. 4和O. 6mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以加入等體積的新鮮 RPMI1640培養(yǎng)液(Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液)作為對(duì)照)，每一濃度的隱孔菌提取物培養(yǎng)液8孔，37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h，收集上清測(cè)定病毒TCID50，檢測(cè)上清中病毒的下降水平；同時(shí)固定細(xì)胞，做間接免疫熒光，檢測(cè)提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的抑制水平。
I. 6數(shù)據(jù)分析
所有數(shù)據(jù)都是獨(dú)立重復(fù)三次得到的平均值，用雙尾T-test (成對(duì))分析差異顯著性，P 彡 O. 05 被認(rèn)為差異顯著，O. OKP 彡 O. 05(*)，0. OOKP 彡 O. 01(**)，P 彡 O. 001(***)。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果表明隱孔菌提取物的濃度在O. 1-0. 7mg/ml的范圍內(nèi)對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞 (PAMs)和非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞(MARC-145)都沒有毒性(圖I);隱孔菌提取物的濃度在O.2-0. 6mg/ml范圍內(nèi)顯著抑制PRRSV CH-Ia株在MARC-145中的復(fù)制(圖2，圖3)，其中，加入O. 6mg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV CH-Ia株對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度為1031±°_ 15TCID5(l/ml，是加入Omg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV CH-Ia株對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度(為107_c^ci ci5TCID5cZml)的萬分之一。豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)分別感染PRRSV VR2332株和PRRSV高致病毒株JXwn06后， 隱孔菌提取物能顯著抑制PRRSV的復(fù)制(圖4，圖5)。其中，加入O. 6mg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的PAMs細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV高致病毒株JXwn06對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度為 104 56±°_°8TCID5(l/ml，是加入Omg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的PAMs細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV高致病毒株JXwn06對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度(為107 5±°_°2TCID5(l/ml)的千分之一；加入0.6mg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的PAMs細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV VR2332株對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度為102 5±°_°4TCID5(l/ml，是加入Omg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液的PAMs細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PRRSV VR2332株對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的滴度(為105 5±°_°3TCID5(l/ml)的千分之一。
實(shí)施例2、用隱孔菌制備豬繁殖與呼吸綜合征藥物
一、隱孔菌提取物的制備
用蒸餾水浸泡隱孔菌干子實(shí)體，水與隱孔菌干子實(shí)體的重量比為7:1，4°C浸泡 2-4小時(shí)，勻漿器充分?jǐn)囁橹?0目，50°C浸提10小時(shí)，8000g離心10分鐘，收集上清液，凍干，得到隱孔菌提取物。該隱孔菌干子實(shí)體是將新鮮的隱孔菌子實(shí)體在常溫下干燥得到的。 用生理鹽水溶解隱孔菌提取物并通過O. 22微米的過濾器過濾除菌，得到隱孔菌提取物注射液。
二、隱孔菌提取物在豬體內(nèi)抑制PRRS病毒的繁殖
I、實(shí)驗(yàn)方法
將10頭體重為6_8kg的4周齡SPF豬隨機(jī)分為2組(每組5頭)，分別為對(duì)照組(只感染PRRS病毒不給隱孔菌提取物)、給藥組(感染PRRS病毒，同時(shí)給予隱孔菌提取物)。用 Iml (TCID50=105) PRRSV高致病毒株JXwn06滴鼻感染SPF豬，給藥組的每頭豬腹腔和肌肉注射上述隱孔菌提取物注射液各5ml( 12mg/ml )，連續(xù)7天，每天兩次，對(duì)照組的每頭豬注射等體積的生理鹽水。在感染前和感染后第3、7、10、16和45天采血,收集血清,用real-time PCR方法對(duì)PRRS病毒做定量檢測(cè)；每天測(cè)體溫，觀察記錄臨床癥狀。對(duì)發(fā)病死亡豬只隨時(shí)進(jìn)行尸體剖檢，在第42天對(duì)所有存活豬進(jìn)行尸體剖檢。
I. I豬前腔靜脈采血及分離血清的步驟如下
對(duì)小豬采用仰臥保定法，一人抓握兩后肢，盡量向后牽引；另一人用手將下頜骨下壓，使頭部貼地，并使兩前肢與體中線基本垂直。此時(shí)，兩側(cè)第一對(duì)肋骨與胸骨結(jié)合處的前側(cè)方呈兩個(gè)明顯的凹窩。用碘酒和酒精棉球消毒皮膚后，手持真空采血器配套用針 (O. 7X25mm)向右側(cè)凹窩處由上而下，稍偏向中央及胸腔方向刺入，見有回血，即將真空采血器配套用針的另一端插入真空采血管，開始采血，每頭小豬采4-5ml血。采血完畢，左手拿酒精棉球緊壓針孔處，右手迅速拔出采血針管，稍壓片刻止血后，解除保定。
將采血管置于37°C 2h，然后4°C過夜，血清即可析出，將析出的血清收集至1.5mlEP管中，4000g、4°C離心lOmin，棄掉沉淀，將血清保存于_80°C，用于檢測(cè)病毒RNA。
I. 2Real-Time PCR法定量血清中的病毒滴度
用OMEGA Viral RNA Kit公司生產(chǎn)的試劑盒提取血清中的病毒RNA。按試劑盒說明書的要求進(jìn)行操作。將560 μ I QVL裂解液，5. 6μ I carrier RNA和10 μ 12-巰基乙醇加入到1.5ml EP管中。取140 μ I血清加入到含有裂解液的EP管中。室溫孵育5_10min。向樣品中加入560 μ I無水乙醇，震蕩混勻30s。將試劑盒中的HiBincfRNA吸附柱裝入2ml 的收集管中，取上步的混合液650 μ I加入吸附柱中，10，OOOg離心30s，棄去收集管中的液體，將吸附柱插入新的收集管中，重復(fù)上一步驟直至將所有的混合液都轉(zhuǎn)移至吸附柱。向吸附柱中加入500 μ I RWA洗液，10，OOOg離心30s，棄去收集管中的液體，將吸附柱插入新的收集管中。向吸附柱中加入500 μ I RWB洗液，10，OOOg離心30s，棄去收集管中的液體，將吸附柱插入收集管中，12，OOOg離心3min。將吸附柱置于新的I. 5ml EP管中，向吸附柱的8中央加入50 μ I DEPC處理的Η20。室溫孵育5min，10, OOOg離心Imin洗脫吸附柱上吸附的 RNAJf RNA保存于-80°C用于定量。
取2 μ I RNA 做 RT-PCR。于 250 μ I PCR 管中加入 2 μ I RNA 與 I μ I Random Primer (10 μ m, TaKaRa),混勻；70°C 5min,迅速置冰上冷卻2min ;向上述混合物中加入以下組分M_MLV5XReaction Buffer5 μ I, dNTP (2. 5mM each) 5 μ I, Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor25units, M-MLV RT (Promega) 200units,最后加 DEPC 水補(bǔ)齊體積到25 μ I ;輕輕混勻，37°C 60min ;將PCR管轉(zhuǎn)移至70 V，15min ;置于冰上冷卻，cDNA產(chǎn)物保存于-20°C。
Real-Time PCR使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)反應(yīng)體系。SYBR Premix Ex TaqTM(2X )10 μ 1，PCR 引物 0RF7F(AATAACAACGGCAAGCAGCA)、 0RF7R (GCACAGTATGATGCGTCGGC) (IOym)各 0.8yl，R0X Reference Dye II (50X ) O. 4 μ I，cDNA 模板 2 μ I，無菌雙蒸水 6 μ I，總體積 20 μ I。在 ABI7900Real-Time PCR System上反應(yīng)，采取兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s (40個(gè)循環(huán))。 用SDS2. 2. 2for7900軟件分析處理數(shù)據(jù)。用已知拷貝數(shù)的PRRSV 0RF7的質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品(將序列I所示的PRRSV0RF7DNA片段與pcDNA3. I載體(Invitrogen，目錄號(hào)K480001)連接得到的重組質(zhì)粒作為PRRSV 0RF7的標(biāo)準(zhǔn)品)，10倍梯度稀釋后做Real-Time PCR,以Ct值對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒RNA定量。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱孔菌提取物對(duì)仔豬沒有明顯的毒副作用，能夠減輕PRRSV高致病毒株感染仔豬引起的高熱(圖6)，降低仔豬血清病毒滴度(圖7)，提高感染仔豬的存活率 (圖8)。其中，給藥組在攻毒后第10天的血清病毒滴度是對(duì)照組的五分之一，給藥組在攻毒后第45天的血清中已經(jīng)檢測(cè)不到病毒滴度，而對(duì)照組在在攻毒后第12天已全部死亡，給藥組在攻毒后第16天的存活率是80%，給藥組在攻毒后第45天的存活率是60%。
實(shí)施例3、隱孔菌提取物抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的機(jī)制
一、隱孔菌提取物的制備
用蒸餾水浸泡隱孔菌干子實(shí)體，水與隱孔菌干子實(shí)體的重量比為6:1，4°C浸泡 2-4小時(shí)，勻漿器充分?jǐn)囁橹?0目，4°C浸提10小時(shí)，8000g離心15分鐘，收集上清液，凍干， 得到隱孔菌提取物。該隱孔菌干子實(shí)體是將新鮮的隱孔菌子實(shí)體在常溫下干燥得到的。下述步驟二的實(shí)驗(yàn)中所用的隱孔菌提取物，均用生理鹽水溶解并通過O. 22微米的過濾器過濾除菌后使用。
二、隱孔菌提取物抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的機(jī)制
I、試驗(yàn)方法
I. I、隱孔菌提取物預(yù)處理Marc-145 (非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞)對(duì)PRRSV感染的影響
將Marc-145用DMEM培養(yǎng)液(10%FBS)吹散，配成細(xì)胞懸液，接種到96孔板，37°C、 5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h。除去培養(yǎng)液，換含有不同濃度隱孔菌提取物的新鮮培養(yǎng)液，37°C、 5%C02環(huán)境下孵育2h，除去含隱孔菌提取物的培養(yǎng)液，感染PRRSV CH-Ia株(MOI=O. I)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收細(xì)胞培養(yǎng)上清按照實(shí)施例I的方法測(cè)定病毒滴度。
其中，含有不同濃度隱孔菌提取物的新鮮培養(yǎng)液是含有0、0. 2,0. 42,0. 6mg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液(用新鮮DMEM培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為O. 2,0. 4,0. 6mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以等體積的新鮮DMEM培養(yǎng)液 (Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液)做對(duì)照)。
I. 2、測(cè)定隱孔菌提取物對(duì)PRRSV的直接殺傷作用
將含有0、0. 2,0. 4,0. 6mg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液與等量的PRRSV (105TCID50)在37°C共孵育Ih和3h，孵育完成后按照實(shí)施例I的方法測(cè)定病毒滴度。
I. 3、測(cè)定隱孔菌提取物抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中RNA的合成
抑制PRRSV 在 Marc-145 中 RNA 的合成將 Marc-145 用 DMEM 培養(yǎng)液(10%FBS) 吹散，配成細(xì)胞懸液，接種到六孔板，37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h。接種PRRSV CH-Ia株 (MOI=O. 01)，病毒感染后24h棄掉上清，分別加入含有0、0. 2,0. 5mg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液(用新鮮DMEM培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為 O. 2和O. 5mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以加入等體積的新鮮DMEM培養(yǎng)液(Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液)作為對(duì)照)，分別于換液后6、12、24、48、72h收細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA做Real-Time PCR0用已知拷貝數(shù)的PRRSV 0RF7的質(zhì)粒(同實(shí)施例2)做標(biāo)準(zhǔn)品，10倍梯度稀釋后做Real-TimePCR，以Ct值對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒RNA定量。
其中，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄以及Real-Time PCR方法如下每5-10 X IO6個(gè)細(xì)胞加Iml Trizol (invitrogen),反復(fù)用移液器吹打混勻，室溫靜置5min ;在上述EP管中，加入O. 2ml 氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，室溫靜置IOmin ;4°C、12000g離心15min ;取上層水相置于新的EP管中，加入O. 5ml異丙醇，室溫靜置IOmin ；4°C、12000g離心IOmin ； 小心棄上清，加lml75%乙醇進(jìn)行洗滌，4°C、7500g離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，最后加入201 DEPC水溶解RNA,用NanodroplOOO (Thermo scientific)定量 RNA0
取500ng RNA 做 RT-PCR。于 2501 PCR 管中加入 500ng RNA 與 I μ I Random Primer (10 μ M，TaKaRa)，混勻；70°C 5min，迅速置冰上冷卻2min ;向上述混合物中加入以下組分M-MLV5XReaction Buffer5 μ I, dNTP (2. 5mM each) 5 μ I, Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor25units, M-MLV RT (Promega) 200units,最后加 DEPC 水補(bǔ)齊體積到25μ I ;輕輕混勻，37°C 60min ;將PCR管轉(zhuǎn)移至70°C，15min ;置于冰上冷卻，cDNA 產(chǎn)物保存于-20 0C。Real-Time PCR 使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)反應(yīng)體系。SYBR(S)Premix Ex TaqTM (2X ) 10 μ 1，PCR 引物 0RF7F (AATAACAACGGCAAGCAGCA),0RF7R (GCACAGTATGATGCGTCGGC) (10 μ m)各 0. 8 μ 1，ROX Reference Dye II (50X ) 0· 4 μ I, cDNA 模板 2 μ I,無菌雙蒸水 6 μ I,總體積 20 μ I。在 ABI7900Real-Time PCR System上反應(yīng)，采取兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95°C 30s ；95°C 5s、 60°C 30s (40個(gè)循環(huán))。用SDS2. 2. 2for7900軟件分析處理數(shù)據(jù)。
I. 4、測(cè)定隱孔菌提取物對(duì)PRRSV RNA依賴的RNA聚合酶活性的影響
PRRSV RNA依賴的RNA聚合酶(按照下述文獻(xiàn)中的方法制備De Novo Initiation of RNA Synthesis by the Arterivirus RNA-Dependent RNA Polymerase. JOURNAL OF VIROLOGY, Aug. 2007, p. 8384 - 8395)，在體外反應(yīng)體系中，RNA依賴的RNA聚合酶能夠以poly (U) 18為模板，以ATP為底物，從5，到3，合成poly (A) 18，用濾紙結(jié)合實(shí)驗(yàn)(filter-binding assays)來吸附poly (A) 18,反應(yīng)RNA聚合酶活性。離子交換纖維素層析紙DE81-紙(DE81-filer)，帶有二乙氨乙基功能團(tuán)的弱堿性陰離子交換劑，能夠結(jié)合放射性同位素標(biāo)記的RNA鏈，將反應(yīng)液通過濾紙后，通過檢測(cè)濾紙上的同位素信號(hào)定量濾紙上吸附的RNA鏈的量,從而反應(yīng)RNA聚合酶的活性。
在I. 5ml EP管中配置下列反應(yīng)液5x反應(yīng)緩沖液(250mM HEPES (pH8. O), 50mM KCl, 5mM DTT, IOmM MnCl2,4mM MgCl2) 10 μ I1PRRSV RNA 依賴的 RNA 聚合酶 nsp92yM, polyU(18)400nM, [32Ρ]ΑΤΡ0. 5-2. 5 μ Ci, ATPlOO μ Μ, RRI50unit，不同體積的隱孔菌提取物生理鹽水溶液，使隱孔菌提取物終濃度分別為0、0. 01,0. 05,0. lmg/ml ;用DEPC H2O補(bǔ)齊體積至50 μ I。30度反應(yīng)60min，加入等體積的50mM EDTA終止反應(yīng)。將50 μ I反應(yīng)液滴在DE-81 (whatman)濾膜上，干燥。用O. 3M甲酸銨(PH8. O)洗三次，每次2min，干燥。加入液體閃爍計(jì)數(shù)反應(yīng)液，用儀器計(jì)數(shù)counts per minute。以不加隱孔菌提取物時(shí) RNA聚合酶的活性為100%，分析隱孔菌提取物對(duì)PRRSV RNA依賴的RNA聚合酶活性的影響。
I. 5、測(cè)定隱孔菌提取物抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成
抑制PRRSV在MarC-145細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成將Marc-145細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液 (10%FBS)吹散，配成細(xì)胞懸液，接種到六孔板，37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)24h。接種PRRSV CH-Ia株(MOI=O. 5)，病毒感染后2h棄掉上清，分別加入含有0、0. 2,0. 6mg/ml隱孔菌提取物的新鮮培養(yǎng)液(用新鮮DMEM培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，得到隱孔菌提取物終濃度分別為 O. 2和O. 6mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液，以等體積的新鮮DMEM培養(yǎng)液(Omg/ml隱孔菌提取物的新鮮DMEM培養(yǎng)液)做對(duì)照)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗一遍。在6孔板中，每孔細(xì)胞加入200 μ I含ImM蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液(博邁德)，用移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。充分裂解后，14，OOOg離心5min，取上清，即為裂解細(xì)胞得到的總蛋白，做Western-blot。ffestern-blot即Western免疫印跡,是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。
對(duì)總蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天)定量。取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)BSA，用PBS稀釋至終濃度為0. 5mg/ml ;根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加I體積BCA試劑B (50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻；將標(biāo)準(zhǔn)品按O, I, 2，4，8，12，16，20 μ I 加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20 μ I ;加2 μ I樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS 到20 μ I ;各孔加入200 μ I BCA工作液，37°C放置30min ;測(cè)定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離15 μ g蛋白樣品，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓 120V,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即停止電泳；然后將蛋白樣品在4°C從凝膠轉(zhuǎn)移到 PVDF膜(Millipore)，電流40mA，2h ;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，用5%脫脂奶粉(溶于I XPBST)在37°C封閉Ih ;用5%脫脂奶粉稀釋一抗anti-PRRSV N proteinSD0W17 (1:5,000 ；Rural Technologies)或者 anti—actin (1:5,000 ；cloneAC-15 ；Sigma, St.Louis, MO)，4°C孵育過夜，用IX PBST洗3次，每次5min ;用5%脫脂奶粉稀釋二抗HRP-兔抗鼠二抗(1:10，000，康為世紀(jì))，37°C孵育lh，lX PBST洗3次，每次5min ;最后用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(康為世紀(jì))顯影。
其中，β-actin ( β _肌動(dòng)蛋白)是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白質(zhì)成分，也是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分，具有收縮功能，分布廣泛，在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物，本實(shí)驗(yàn)也用β -actin作為對(duì)照。
I. 6、數(shù)據(jù)分析
所有數(shù)據(jù)都是獨(dú)立重復(fù)三次得到的平均值，用雙尾T-test (成對(duì))分析差異顯著性，P 彡 O. 05 被認(rèn)為差異顯著，O. OKP 彡 O. 05(*)，0. OOKP 彡 O. 01(**)，P 彡 O. 001(***)。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
所有濃度(O. 2-0. 6mg/ml)隱孔菌提取物培養(yǎng)液預(yù)處理Marc-145 (非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞)，不抑制PRRSV的感染(圖9)。隱孔菌提取物直接處理PRRSV，孵育lh，所有濃度(O. 2-0. 6mg/ml)隱孔菌提取物培養(yǎng)液處理對(duì)病毒都沒有殺傷作用；孵育3h，濃度為 O. 2mg/ml的處理對(duì)病毒沒有殺傷作用，O. 4mg/ml和O. 6mg/ml的處理對(duì)病毒有輕微的殺傷作用(圖10)。在PRRSV感染細(xì)胞后24h加入隱孔菌提取物，病毒RNA的合成會(huì)受到抑制,0. 5mg/ml的隱孔菌提取物培養(yǎng)液在加入后6h即能明顯抑制病毒RNA的合成,在加入后 48h,提取物對(duì)于病毒RNA的抑制作用最明顯，到72h時(shí)，對(duì)照組的細(xì)胞會(huì)因?yàn)椴《镜母腥径劳觯詫?duì)照組細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的量也會(huì)下降(圖11)。隱孔菌提取物在較低濃度就能明顯抑制PRRSV RNA依賴的RNA聚合酶的活性，當(dāng)濃度為O. O lmg/ml時(shí)，PRRSV RNA依賴的 RNA聚合酶的活性下降至60% (圖12)。隱孔菌提取物能夠抑制PRRSV在細(xì)胞內(nèi)合成蛋白， 病毒感染細(xì)胞后2h加入隱孔菌提取物，24h后檢測(cè)病毒N蛋白的表達(dá)水平，與對(duì)照相比，隱孔菌提取物能夠劑量依賴性的抑制病毒N蛋白的合成，O. 6mg/ml隱孔菌提取物培養(yǎng)液已經(jīng)檢測(cè)不到病毒N蛋白的表達(dá)(圖13)。
權(quán)利要求
1.隱孔菌提取物在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
2.隱孔菌提取物在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
3.隱孔菌在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用。
4.隱孔菌在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了隱孔菌的新用途。本發(fā)明所提供的隱孔菌的新用途是下述1)-4)中的至少一種1)隱孔菌在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用；2)隱孔菌在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用；3)隱孔菌提取物在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制劑中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)；4)隱孔菌提取物在制備抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在寄主細(xì)胞中復(fù)制的產(chǎn)品(如藥物)中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是從隱孔菌子實(shí)體中提取的水溶性物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K36/06GK102920745SQ20121046045
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者王賀祥, 封文海, 張薇薇, 高麗, 朱孟娟, 馬增強(qiáng), 杜芳, 張哲 , 張瑞, 劉慶洪 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)