活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法
【專利摘要】活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法。提供了一種制造活菌凍干粉的方法，所述方法包括如下步驟：（a）將菌種在種子培養(yǎng)基中接種，得到接種產(chǎn)物；（b）將步驟（a）所得接種產(chǎn)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵期間通過加入堿維持發(fā)酵液pH不變，得到發(fā)酵產(chǎn)物；（c）混合發(fā)酵產(chǎn)物與保護劑凍干得到凍干菌粉；所述菌種選自長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和/或糞鏈球菌。
【專利說明】活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法，更具體涉及包含長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌是人和動物體內(nèi)常見的正常菌群重要成員，集中粘附在下腸道粘膜，對機體發(fā)揮有益作用，能抑制外籍病原菌的入侵，其代謝產(chǎn)物提供宿主必須的維生素，參與和協(xié)助營養(yǎng)的消化和吸收。上述細菌能激發(fā)機體的免疫功能。減少腸源性毒性的吸收。由于消化系統(tǒng)疾病或大量使用抗生素及隨著年齡的增長，體內(nèi)雙岐桿菌逐漸減少。為保持上述有益菌的正常水平，人們開始研究含有這些有益菌的制劑。
[0003]中國專利CN101244090公開了一種雙岐三聯(lián)活菌制劑及其制備方法。該文獻報道改進雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的種子液培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基來提高雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌穩(wěn)定性的方法。但是發(fā)酵液活菌數(shù)及菌體活性不是不是令人很滿意。
[0004]因此，需要一種具有較高活菌量、菌體活性強的發(fā)酵液來制備活菌凍干粉以及三聯(lián)活菌制劑的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提高長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及糞腸球菌的發(fā)酵液活菌數(shù)；提高菌的活性、提高凍干時存活率。
[0006]本發(fā)明所涉及的種液及發(fā)酵培養(yǎng)基使種子活性增強，發(fā)酵過程調(diào)節(jié)pH使發(fā)酵液菌體維持最佳生長狀態(tài)，活菌量提高，能達到50-900億個/mL的高密度培養(yǎng)(CN101244090所公開的為1-100億個/ml)，完全能夠滿足生產(chǎn)需求；本文所提供的發(fā)酵菌體產(chǎn)物生長狀態(tài)好，活性強，在原有的凍干保護劑及凍干工藝情況下，能提高凍干制劑的活菌量及凍干存活率，延長其保存時間，提高凍干粉的穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明一方面提供了一種制造活菌凍干粉的方法，所述方法包括如下步驟:
[0008](a)將菌種在種子培養(yǎng)基中接種，得到接種產(chǎn)物；
[0009](b)將步驟(a)所得接種產(chǎn)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵期間通過加入堿維持發(fā)酵液PH不變，得到發(fā)酵產(chǎn)物；
[0010](C)混合發(fā)酵產(chǎn)物與保護劑凍干得到凍干菌粉；
[0011]所述菌種選自長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和/或糞鏈球菌。
[0012]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水或其組合。
[0013]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述堿以堿的水溶液形式使用。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述發(fā)酵液的pH值維持在4.5-8.0的范圍內(nèi)。
[0015]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述發(fā)酵液的pH值維持在6.0-7.0范圍內(nèi)。
[0016]本發(fā)明另一方面提供了一種制造三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0017](i)根據(jù)本發(fā)明所述的方法分別制備長型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉；以及
[0018](ii)混合上述長型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉得到三聯(lián)活菌制劑。
[0019]本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明所述的方法制備的活菌凍干粉。
[0020]本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明所述的方法制備的三聯(lián)活菌制劑。
【具體實施方式】
[0021 ] 在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，百分數(shù)(％ )或者份都指相對于組合物的重量百分數(shù)或者重量份。
[0022]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，所涉及的各組分或其優(yōu)選組分可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0023]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有實施方式以及優(yōu)選實施方式可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0024]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有技術(shù)特征以及優(yōu)選特征可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0025]在本發(fā)明中，如果沒有相反的說明，組合物中各組分的含量之和為100%。
[0026]在本發(fā)明中，如果沒有相反的說明，組合物中各組分的份數(shù)之和可以為100重量份。
[0027]在本發(fā)明中，除非有其他說明，數(shù)值范圍“a_b”表示a到b之間的任意實數(shù)組合的縮略表示，其中a和b都是實數(shù)。例如數(shù)值范圍“0-5”表示本文中已經(jīng)全部列出了 “0-5”之間的全部實數(shù)，“0-5”只是這些數(shù)值組合的縮略表示。
[0028]在本發(fā)明中，除非有其他說明，整數(shù)數(shù)值范圍“a_b”表示a到b之間的任意整數(shù)組合的縮略表示，其中a和b都是整數(shù)。例如整數(shù)數(shù)值范圍“1-N”表示1、2……N，其中N是整數(shù)。
[0029]在本發(fā)明中，除非有其他說明，“其組合”表示所述各元件的多組分混合物，例如兩種、三種、四種以及直到最大可能的多組分混合物。
[0030]如果沒有特別指出，本說明書所用的術(shù)語“一種”指“至少一種”。
[0031]如果沒有特別指出，本發(fā)明所述的百分數(shù)(包括重量百分數(shù))的基準都是所述組合物的總重量。
[0032]本文所公開的“范圍”以下限和上限的形式。可以分別為一個或多個下限，和一個或多個上限。給定范圍是通過選定一個下限和一個上限進行限定的。選定的下限和上限限定了特別范圍的邊界。所有可以這種方式進行限定的范圍是包含和可組合的，即任何下限可以與任何上限組合形成一個范圍。例如，針對特定參數(shù)列出了 60 - 120和80 - 110的范圍，理解為60 - 110和80 - 120的范圍也是預(yù)料到的。此外，如果列出的最小范圍值I和2，和如果列出了最大范圍值3，4和5，則下面的范圍可全部預(yù)料到:1 一 3、I 一 4、I 一 5、2 — 3、2 — 4、和 2 — 5。
[0033]在本文中，除非另有說明，各組分的比例或者重量都指干重。
[0034]在本文中，除非另有說明，各反應(yīng)都在常溫常壓下進行。
[0035]在本文中，除非另有說明，各個反應(yīng)步驟可以順序進行，也可以不按順序進行。例如，各個反應(yīng)步驟之間可以包含其他步驟，而且反應(yīng)步驟之間也可以調(diào)換順序。優(yōu)選地，本文中的反應(yīng)方法是順序進行的。
[0036]在本文中，除非另有說明，“不變”表示變化在± 10 %以內(nèi)，較好在± 5 %以內(nèi)，更好在土 2 以內(nèi)，最后在土 I 。
[0037]凍干粉及三聯(lián)活菌制劑的制備方法
[0038]本發(fā)明一方面提供了一種制造活菌凍干粉的方法，所述方法包括如下步驟:
[0039](a)將菌種在種子培養(yǎng)基中接種，得到接種產(chǎn)物；
[0040](b)將步驟(a)所得接種產(chǎn)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵期間通過加入堿維持發(fā)酵液PH不變，得到發(fā)酵產(chǎn)物；
[0041](c)混合發(fā)酵產(chǎn)物與保護劑凍干得到凍干菌粉；
[0042]所述菌種選自長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和/或糞鏈球菌。
[0043]在上述步驟(a)中，所述接種菌種的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道怎樣對所述菌種進行接種。具體的接種方法可參見CNl 119145C。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述接種方法包括火焰接種法，即用鑷子夾住乙醇棉花，點燃后，在種子罐接種頭上下燃燒，火焰消毒。然后旋開種子罐接種頭蓋，在火焰下快速將裝有種子接種瓶的橡皮管插入接種頭上。緩慢打開接種口閥門，將種子倒入罐內(nèi)。
[0044]在上述步驟(b)中，發(fā)酵接種產(chǎn)物的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技`術(shù)可知道怎樣對接種產(chǎn)物進行發(fā)酵。具體的發(fā)酵方法可參見CNl 119145C。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述發(fā)酵方法包括液態(tài)培養(yǎng)方法(即所用培養(yǎng)基是一種或多種水溶液如:蛋白胨水、營養(yǎng)肉湯等)、固態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是含有固態(tài)物如:瓊脂、明膠等的培養(yǎng)基，呈凝固狀或者半凝固狀)。
[0045]在上述步驟(b)中，本發(fā)明所述的堿是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接推導(dǎo)出哪些堿可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水或其組合。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述堿可以堿的水溶液形式使用。
[0046]在上述步驟(b)中，所述發(fā)酵液維持的最佳pH值優(yōu)選在4.5-8.0的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述發(fā)酵液的最佳pH值在5.5-7.5范圍內(nèi)，最好為6.0-7.0。
[0047]在上述步驟(c )中，所述凍干方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以知道進行凍干的具體方法。具體的凍干方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述凍干方法包括低溫冷凍干燥法，所述冷凍干燥是指通過升華從凍結(jié)的生物產(chǎn)品中去掉水份或其他溶劑的過程。升華指的是溶劑，比如水，像干冰一樣，不經(jīng)過液態(tài)，從固態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)的過程。
[0048]本發(fā)明所述的長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，它已經(jīng)公開在已授權(quán)的US6368591中，其中長型雙歧桿菌的保藏號為CCTCCM98003，嗜酸乳桿菌的保藏號為CCTCC M98004，糞鏈球菌的保藏號為CCTCCM98005。
[0049]長型雙歧桿菌為厭氧性細菌，革蘭氏染色陽性，著色不均勻，無芽孢，無莢膜，無鞭毛，菌體呈直形或彎曲狀，可出現(xiàn)“Y”或“V”型的分叉狀，棒狀等多多形態(tài)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述長型雙歧桿菌為長型雙歧桿菌(6 -1) (CCTCCM98003)。
[0050]嗜酸乳桿菌為兼性厭氧菌，革蘭氏染色陽性、無芽孢，無莢膜，無鞭毛，兩端圓的短桿球桿狀，單個或成雙排列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌YIT2004 (CCTCC M98004)。
[0051]糞鏈球菌為兼性厭氧菌，革蘭氏染色陽性、無芽孢，無莢膜，無鞭毛，卵圓形，多成雙排列，也呈短鏈。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述糞鏈球菌為糞鏈球菌YIT0027(CCTCCΜ98005)。
[0052]種子培養(yǎng)基
[0053]在本發(fā)明中的上述方法中，所述種子培養(yǎng)基是常規(guī)的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述種子培養(yǎng)基具體可參見CN101244090A中所述的種子培養(yǎng)基(包括第一種子培養(yǎng)基和第二種子培養(yǎng)基)。CN101244090A所公開的內(nèi)容以全文引用的方式插入本文中。
[0054]第一種子培養(yǎng)基
[0055]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，用于長型雙歧桿菌的種子培養(yǎng)基優(yōu)選稱為第一種子培養(yǎng)基。所述第一種子培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接得到哪些種子培養(yǎng)基可用于接種長型雙歧桿菌。具體的第一種子培養(yǎng)基可參見《長雙歧桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化》(《食品工業(yè)科技》2004年第04期)。
[0056]但是，為了得到更加穩(wěn)定的長型雙歧桿菌，優(yōu)選使用特定的種子培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述第一種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量％的礦物鹽和84.00-97.65重量％的溶劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述第一種子培養(yǎng)基包含如下組分:
【權(quán)利要求】
1.一種制造活菌凍干粉的方法，所述方法包括如下步驟: (a)將菌種在種子培養(yǎng)基中接種，得到接種產(chǎn)物； (b)將步驟(a)所得接種產(chǎn)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵期間通過加入堿維持發(fā)酵液PH不變，得到發(fā)酵產(chǎn)物； (c)混合發(fā)酵產(chǎn)物與保護劑凍干得到凍干菌粉； 所述菌種選自長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和/或糞鏈球菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水或其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述堿以堿的水溶液形式使用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液的pH值維持在4.5-8.0的范圍內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液的pH值維持在6.0-7.0范圍內(nèi)。
6.一種制造三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法包括以下步驟: (i)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法分別制備長型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉；以及 (?)混合上述長型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉得到三聯(lián)活菌制劑。
7.用權(quán)利要求1所述的方法制備的活菌凍干粉。
8.用權(quán)利要求6所述的方法制備的三聯(lián)活菌制劑。
【文檔編號】A61K9/19GK103830278SQ201210477296
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月21日
【發(fā)明者】汪忠慧, 張軍東, 王樹海, 于鴻晶, 王莎莎 申請人:上海信誼藥廠有限公司