專利名稱：一種鴨坦布蘇病毒e蛋白基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于家禽基因工程疫苗技術領域，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白基因及其應用。
背景技術：
鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一種可引起鴨產(chǎn)蛋下降、生長遲緩和死亡的新發(fā)病毒。該病死亡率在5%-10%之間，是自2010年起至今危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的疾病之一。根據(jù)國家水禽產(chǎn)業(yè)技術體系2010年11月份的調(diào)查，該病造成的經(jīng)濟損失已超過50億。目前，沒有有效的措施來預防該病的發(fā)生。因此，研制一種安全有效的“鴨坦布蘇病毒病”疫苗對我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒編碼結(jié)構蛋白(C、PrM和E)和非結(jié)構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。其中，E蛋白在病毒受體結(jié)合、侵入和融合方面起到了關鍵的作用，是病毒的主要結(jié)構蛋白，具有較好的免疫原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原，也成為了宿主抗感染免疫的重要保護性抗原。通過基因工程制備的E蛋白亞單位疫苗，成本較低且蛋白質(zhì)量穩(wěn)定，并且可以激發(fā)機體的免疫應答。因此，篩選當前鴨坦布蘇病毒流行毒株的E蛋白基因進行疫苗研發(fā)，無疑具有重要的現(xiàn)實意義和市場開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白基因及其應用，即一種新的鴨坦布蘇病毒E蛋白基因，及其作為疫苗的應用。本發(fā)明一個方面提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白，所述蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO :1。本發(fā)明另一個方面涉及編碼上述蛋白的核苷酸，其序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明再一個方面涉及鴨坦布蘇病毒E蛋白在制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗中的應用。本發(fā)明獲得的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種20日齡鴨坦布蘇病毒陰性麻鴨，接種14日后取血測DTMUV抗體，免疫組DTMUV抗體全部為陽性，有效率達到100%，而對照組未檢測到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進一步制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗可以引起麻鴨的免疫應答。
具體實施例方式本發(fā)明從DTMUV的病料中分離得到了新的鴨坦布蘇病毒E基因，基因表達獲得重組蛋白具有很好的抗原性，可以防御新型的鴨坦布蘇病毒，從而促成了本發(fā)明。下面結(jié)合具體實施方式
來進一步描述本發(fā)明，但本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術方案的情況下可以對本發(fā)明的技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
一、鴨坦布蘇病毒E基因的擴增將臨床分離的DTMUV的病料處理后接種SPF雞胚盲傳三代后，PCR擴增鴨坦布蘇病毒E基因全長，引物序 列如下E-F: 5' AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA' 3 (EcoR I)E-R: 5' ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG '3 (Xho I)PCR 反應體系如下5X PrimeSTARE Buffer 10 u L ；dNTP Mixture (2. 5 mM)4 u L ；PrimeSTARE HS DNA Polymerase 0.5 U L ;模板0.5 iiL;引物 I y L/l u L ；ddH2033 u L0按以下參數(shù)在PCR儀上進行反應98 °C預變性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min進行25個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行測序后將E蛋白基因序列(SEQ ID NO :2)在NCBI上Blast比對，同源性最高為97%，表明擴增的樣品為新的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。同時，對同一 DTMUV的病料感染的不同SPF雞胚，按照上述記載的條件進行擴增，擴增出的基因測序結(jié)果都一致，證明沒有在擴增過程中產(chǎn)生堿基的錯誤。將E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)5'端和3'端分別加上EcoR I和Xho I酶切位點，送基因公司進行全基因合成。二、基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得一、構建 pET-28a(+)_E 表達載體I. PCR 擴增 E 片段(I)設計引物根據(jù)E基因序列利用Primer 5. 0軟件設計基因擴增引物，引物上下游分別引入限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Xho I作用位點(下劃線)，設計引物如下E-F: 5' AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA' 3 (EcoR I)E-R: 5' ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ’ ' 3 (Xho I)上游引物設計在序列前加了 ATG，并加了 EcoR I酶切位點和一個保護堿基A ;下游引物中加了終止密碼子，填加Xho I酶切位點和一個保護堿基A ;使用了 pET-28a(+)載體上的N端的6個His氨基酸標簽。根據(jù)基因公司合成的E基因序列(SEQ ID NO 2)為模板擴增目的基因。PCR 反應體系如下5 X PrimeSTARE Buffer 10 u L ；dNTP Mixture (2. 5 mM)4 uL ；PrimeSTARE HS DNA Polymerase 0. 5 u L ;模板 0. 5 ii L ;引物 I y L/l u L ；ddH2033 u L0按以下參數(shù)在PCR儀上進行反應98 °C預變性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min進行25個循環(huán)。反應完畢后取5 y L反應產(chǎn)物，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR效果。(2) PCR產(chǎn)物回收灌制可上樣50 的I %瓊脂糖凝膠，將PCR擴增產(chǎn)物分別加入電泳上樣孔中，指示劑遷移至適當位置時停止電泳，在365 nm紫外光下切下含目的片段的凝膠，移入I. 5 mLEP管中，稱取重量后，參照天根生物技術公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)說明書進行。
2、E基因片段連接到pET_28a(+)載體上并轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞(I)E基因與pET_28a(+)載體質(zhì)粒分別利用EcoR I和Xho I酶進行雙酶切。酶切體系如下EcoR I 2 u L ,Xho I 2 UL, IOXH Buffer 5 u L, DNA模板 10 u L,加水至 50 u L。(2)酶切后目的片段的回收雙酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖回收膠，將上述酶切反應體系中各加入5 V- L IOXLoading buffer,80 V電泳待指示劑遷移至距凝膠前沿I. 5 cm時停止電泳，分別切割符合理論值的目的片段的瓊脂糖凝膠，使用天根生物技術公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)回收所需片段。(3)連接反應根據(jù)載體片段與插入片段摩爾數(shù)比為I: 2 10的原則，設計連接 體系如下pET-28a(+)酶切后片段I UL ;酶切后E基因5 u L ；T4 DNA Iigase I uL；IOX ligation buffer I u L ；dd H2O 2 U L，16°C連接過夜。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)細胞取E. coli DH5 a感受態(tài)菌液各100UL，加入連接反應產(chǎn)物10 UL，用手指輕輕彈幾下后放冰水浴30 min。42 °C水浴熱刺激90 S，迅速放置冰水浴廣2 min，每管各加300 u L LB培養(yǎng)液(無抗性)，37 1搖床培養(yǎng)45min。混勻上述菌液，取適量菌液(200 y L)均勻涂布于含Kan+抗性的LB平板，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置平皿，37 1孵箱培養(yǎng)過夜。(5)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定Kan+ LB平板有菌落生長，挑取分隔良好的菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基(Kan+抗性)中，37 1搖床培養(yǎng)過夜。吸取I UL菌液，作為菌液PCR模板鑒定陽性克隆。陽性克隆的測序由華大基因公司完成，將測序后的序列與合成E基因序列進行核酸序列的Blast分析，建完成質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-E。3、pET-28a(+)_E 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(I) pET_28a(+)-E質(zhì)粒的提取,采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Takara公司)，參照說明書操作。(2)pET-28a(+)_E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞中(步驟同轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞)。(3)挑5個單菌落在Kan+ LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過全菌PCR鑒定陽性克隆。挑一株陽性克隆命名為BL21-pET-28a(+) -E菌株。三、工程菌BL21-pET-28a(+)_E表達目的蛋白E-HisI、IPTG 誘導 BL21-pET-28a(+)_E 菌株表達重組工程菌BL21-pET_28a (+) -E經(jīng)IPTG誘導后，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色觀察目的蛋白表達，并通過Western印跡鑒定為融合His標簽的E蛋白。收集誘導表達的重組菌按照1:9(w/v)的比例混勻于PBS緩沖液中，于超聲波細胞破碎儀冰浴超聲破菌至菌液不再粘稠，將裂解液進行差速離心700g離心20min，棄沉淀，上清離心12000g離心20min,分別收集超聲上清和沉淀,用同體積的緩沖液重懸沉淀,制備樣品進行SDS-PAGE和Western印跡分析。結(jié)果表明目的蛋白的表達形式主要是包涵體。2、目的蛋白的純化(I)包涵體的洗滌沉淀分別以包涵體洗滌液重懸，4°C攪拌洗滌40min。12000rpm離心20min，棄上清，重復洗漆一次。上述沉淀以包涵體洗漆液II重懸，4°C攪拌20min。12000rpm離心20min,棄上清,重復洗漆一次。(2)包涵體的溶解上述沉淀與包涵體溶解液以1:9 (w/v)的比例重懸，4°C攪拌溶解過夜。12000g離心20min,上清即為重組蛋白包涵體溶液 。(3)目的蛋白的純化采用鎳離子親和層析柱，柱床體積(CV)為I mL。去離子水流沖上樣A、B管及親和層析柱，至基線平穩(wěn)；分別以緩沖液Al、緩沖液BI流沖上樣A、B管道，然后以緩沖液Al平衡親和層析柱至基線平穩(wěn)。以超聲上清上樣，親和層析緩沖液Al沖洗親和層析柱，收集穿過峰；待穿過峰消失回復至基線，以親和層析緩沖液BI梯度洗脫解離，收集洗脫峰，即為純化后蛋白樣品。(4)蛋白稀釋復性將ImL純化后的蛋白(含30%甘油)，緩慢滴入IOOmL復性液中(IOMm TrisCl, 0. 5MNaCl，pH8. 0 ；30 % 甘油；1 mM GSH ；0. I mM GSSG ；0. 5 M Arg),4 °C孵育 48 h，4 °C, 12000g離心30 min,即為復性好的復性蛋白稀釋液。(5)蛋白濃度測定利用BSA試劑盒測定，根據(jù)說明書操作。結(jié)論構建含有pET-28a(+)_E表達載體的BL21 (DE3)工程菌，獲得純化后的融合His標簽的E蛋白。四、多克隆血清的制備(I)動物選擇新西蘭大耳白兔兩只。( 2 )接種途徑皮下注射。(3)接種部位脊背，左右腳足墊，左右腹股溝。(4)佐劑使用弗氏完全佐劑(CFA)，弗氏不完全佐劑(IFA)為Sigma公司產(chǎn)品。(5)接種策略I)每只大耳白兔抗原免疫用量1.0 mg。取2. 5 mg E蛋白加弗氏完全佐劑2. 5 mL,順時針方向研磨直至形成“油包水”樣乳劑。2)固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分別在脊背，左右腳足墊，左右腹股溝皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。3)每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液。4)第五周起于兔耳緣靜脈取血，用瓊脂糖雙擴法檢測特異性抗體的效價。5)抗血清分離心臟放血，室溫下待血清完全分離，離心后分裝血清，_70°C凍存?zhèn)溆?。雙向免疫擴散結(jié)果顯示，在抗E蛋白抗血清稀釋度為1:32時，出現(xiàn)明顯沉淀線，兔抗E蛋白多克隆抗體效價分別為1:32。結(jié)論E蛋白可以使新西蘭大耳白兔產(chǎn)生多克隆血清。Western印跡檢測血清特異性選取BL21 (DE3)菌為陰性對照，同時以純化后的E-His為陽性對照進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，實施例3中制備的兔抗血清以1:5000稀釋為一抗，1:5000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG為二抗，檢測兔抗E-His血清的免疫反應性。結(jié)果表明純化的E-His蛋白可以與兔抗E-His血清能夠發(fā)生明顯的免疫反應，而BL21 (DE3)在相應分子量位置未見反應條帶出現(xiàn)，表明具有良好免疫反應性。五、重組蛋白制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗的動物試驗將制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種20日齡DTMUV陰性麻鴨30只，另取10只作為對照。接種14日后取血測DTMUV抗體，免疫組DTMUV抗體全部為陽 性，有效率達到100%，對照組未檢測到抗體；結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好。用該重組蛋白進一步制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗可以引起幼鴨的免疫應答，能夠有效的預防鴨坦布蘇病毒病。
權利要求
1.一種鴨坦布蘇病毒E蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.一種核苷酸，所述的核苷酸用于編碼權利要求I所述的蛋白。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其序列為SEQID NO :2。
4.權利要求I所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白在制備基因工程亞單位疫苗中的應用。
5.一種基因工程亞單位疫苗，其特征在于，是用權利要求I所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白作為抗原制備的。
6.權利要求5所述的疫苗用于防治鴨坦布蘇病毒病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明獲得的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種20日齡鴨坦布蘇病毒陰性麻鴨，接種14日后取血測DTMUV抗體，免疫組DTMUV抗體全部為陽性，有效率達到100%，而對照組未檢測到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進一步制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗可以引起麻鴨的免疫應答。
文檔編號A61P31/20GK102977194SQ20121047731
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權日2012年11月22日
發(fā)明者魏波, 凌紅麗, 徐麗麗, 蔣貽海, 于春梅 申請人:青島寶依特生物制藥有限公司, 青島康地恩藥業(yè)股份有限公司