專利名稱：干涉片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干涉片段及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明涉及干涉片段及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及干涉片段及其在抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的用途、抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高的惡性腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤死亡順位中居第三位，全球每年HCC死亡病例數(shù)高達(dá)600，000。而現(xiàn)階段的研究表明，通過分子生物技術(shù)手段抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，將是未來肝癌治療的主要方向之一。然而，目前通過分子生物技術(shù)手段抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的研究仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠用于抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的干涉片段。需要說明的是，本發(fā)明是基于申請人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:近年來的研究表明，與肝癌密不可分的腫瘤微環(huán)境在肝癌的進(jìn)展過程中起著重要作用。肝癌腫瘤微環(huán)境由多種基質(zhì)細(xì)胞組成，包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellatecell, HSC)、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等，它們能夠分泌大量的生長因子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬降解酶等，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等。其中MSC是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，由于其具有很強(qiáng)的多向分化能力、參與免疫調(diào)節(jié)和免疫抑`制、能夠分泌多種活性因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤微環(huán)境中的重要作用逐漸被人們所認(rèn)識，MSC與腫瘤細(xì)胞的相互作用已成為研究腫瘤微環(huán)境和腫瘤關(guān)系的重要模型之一。血液系統(tǒng)腫瘤MSC與腫瘤細(xì)胞的相互作用已經(jīng)很深入，然而在實(shí)體瘤中，分離和培養(yǎng)腫瘤組織MSC的難度比較大，使得實(shí)體瘤組織MSC的報(bào)道很少。而有關(guān)腫瘤細(xì)胞與MSC相互作用的研究，人們主要利用建系的永生化的MSC或正常的人骨髓BM-MSC來研究MSC與腫瘤的相互作用，但不同研究者發(fā)現(xiàn)骨髓MSC對腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的效應(yīng)有些矛盾，促進(jìn)、抑制、無效應(yīng)的研究均有報(bào)道。由于骨髓MSC主要定位于骨髓腔，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下與肝癌細(xì)胞并不接觸，盡管在腫瘤病理及損傷中，一小部分骨髓MSC能夠遷移到腫瘤部位及損傷部位，但數(shù)量非常有限。而腫瘤組織中的定位于血管周部位的MSC與腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)相互作用、共同發(fā)育，在腫瘤細(xì)胞的刺激下，MSC反過來能夠分泌更多的促腫瘤發(fā)生發(fā)展的活性因子來刺激腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移。相比正常的骨髓MSC，腫瘤組織MSC與腫瘤細(xì)胞的相互作用可能是更好的反映腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的模型，因此明確腫瘤組織MSC與腫瘤的相互關(guān)系和分子機(jī)制，可預(yù)期為腫瘤的微環(huán)境干預(yù)提供新的思路和靶點(diǎn)的選擇。然而到目前為止，實(shí)體瘤組織中的MSC研究(包括肝癌)仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于血液系統(tǒng)腫瘤MSC的研究。并且，截至目前，尚無從肝癌組織分離MSC的報(bào)道，肝癌MSC與肝癌細(xì)胞的相互作用關(guān)系仍然未知。
在以上的背景下，發(fā)明人從肝癌組織及癌旁組織中成功分離并擴(kuò)增MSC，通過增殖狀態(tài)，表型分析，具有向脂肪、成骨細(xì)胞分化能力等方面確定其符合MSC的基本特征。接著，發(fā)明人通過肝癌MSC與腫瘤細(xì)胞共移植(皮下成瘤、肝內(nèi)注射)，發(fā)現(xiàn)肝癌MSC能夠顯著促進(jìn)腫瘤體內(nèi)增殖及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，發(fā)明人利用Agilent人全基因組表達(dá)譜芯片對肝癌組織MSC與肝癌旁組織MSC進(jìn)行基因表達(dá)分析(委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織MSC高表達(dá)S100A4，而S100A4高表達(dá)能夠顯著促進(jìn)肝癌的增殖及轉(zhuǎn)移。綜上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，S100A4能夠促進(jìn)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移。由此，發(fā)明人提出了一種能夠通過干涉S100A4的表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的干涉片段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種干涉片段。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該干涉片段的正義鏈和反義鏈分別具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，即其正義鏈為:CGUGCUUGAUGC UGAGCAACSEQ ID NO:1 )，反義鏈為 UUG CUCAGCAUCAAG CACGCSEQIDN0:2)0 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明的干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后，能夠顯著地下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，進(jìn)而能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，從而能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了上述干涉片段在抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的干涉片段下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。由此，能夠有效地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的干涉片段在抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的用途。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方 法包括:將前述本發(fā)明的干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法，能夠顯著地下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，進(jìn)而能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，從而能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法中，將干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞。由此，干涉片段能夠有效地下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，進(jìn)而能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，從而能夠顯著地抑制肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法中，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞的方法也不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞，是通過直接轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行的。由此，能夠有效提高干涉片段的轉(zhuǎn)化效率，從而能夠有效提高抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的效果。需要說明的是，本發(fā)明的干涉片段及其在抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的用途，以及抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法，是本申請的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和優(yōu)化的工作而完成的。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的肝癌原發(fā)灶組織MSC與同一病人癌旁組織MSC的表型特征研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A:肝癌MSC與癌旁組織MSC的代表性形態(tài)(X40)，B:在特異的成骨誘導(dǎo)體系培養(yǎng)不同時(shí)間后，肝癌MSC的早期及晚期成骨鑒定結(jié)果，C:在脂肪誘導(dǎo)體系特異誘導(dǎo)后，肝癌MSC經(jīng)誘導(dǎo)形成的脂肪滴的油紅O特異染色結(jié)果；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的肝癌組織MSC對肝癌細(xì)胞系HepG2體內(nèi)增殖的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的肝癌組織MSC對肝癌細(xì)胞MHCC97L的體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的肝癌MSC中S100A4表達(dá)情況研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A:肝癌組織MSC與癌旁MSC基因表達(dá)譜芯片的比較結(jié)果，B:三例病人的肝癌MSC及其癌旁組織MSC的Western blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C:顯示了構(gòu)建獲得S100A4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系穩(wěn)定株；圖5顯示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的肝癌細(xì)胞系高表達(dá)S100A4對肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用的·實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A:S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B:S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞體外侵襲能力影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C:S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的干涉S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A:干涉肝癌MSC的S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞系Huh7侵襲能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B:通過CCK8生長曲線研究干涉肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)對肝癌細(xì)胞系Huh7增殖能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C:干涉肝癌細(xì)胞S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞系Huh7和97L侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1肝癌組織MSC分泌的S100A4能夠促進(jìn)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移一、分離并鑒定肝癌組織MSC將手術(shù)取得的肝癌組織，經(jīng)眼科剪破碎，膠原酶消化成單細(xì)胞懸液后，接種于a -MEM+10%FBS+lng/ml bFGF的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中。貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后，即可以見到少量呈成纖維狀的貼壁細(xì)胞，換液后細(xì)胞生長狀態(tài)良好。大約9-10天進(jìn)行傳代，記為Pl，肝癌組織來源的MSC形態(tài)均一，呈漩渦狀生長(圖ΙΑ)。P5代的肝癌MSC與同一病人的癌旁組織MSC經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志，肝癌MSC表型均一，即不表達(dá)⑶45 (造血細(xì)胞陽性)、⑶14 (巨噬細(xì)胞標(biāo)記)，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記(⑶31和⑶144)，不表達(dá)HLA-DR，而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記 CD90、CD29、CD73、CD105 和 CD166。肝癌MSC和癌旁MSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)后，具有很強(qiáng)的成骨分化能力，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切图伴L絲狀突起。成骨誘導(dǎo)2-3周后，早期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志堿性磷酸酶染色強(qiáng)陽性(圖1B,上圖);誘導(dǎo)至4 5周，Von kossa染色檢測細(xì)胞外基質(zhì)鈣化物的沉積，特異染成強(qiáng)烈黑色(圖1B，下圖)。其中，需要說明的是，上述成骨誘導(dǎo)體系采用添加了 10%體積的胎牛血清(Hyclone公司)、10_7M地塞米松(Sigma公司)、50μΜ維生素C(Sigma公司)和IOmM β -磷酸甘油(Sigma公司)的高糖DMEM (Hyc I one公司)
培養(yǎng)基。肝癌MSC和癌旁MSC經(jīng)脂肪誘導(dǎo)體系培養(yǎng)后，經(jīng)倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞由成纖維細(xì)胞樣逐漸收縮變短，成為立方形或三角形，連續(xù)誘導(dǎo)至14d，倒置顯微鏡下可見有微小脂滴形成，油紅O染色呈特異性紅色(圖1C)，但脂肪分化能力明顯比骨髓MSC弱，這也與肝癌MSC具有很強(qiáng)的成骨分化能力相對應(yīng)，因?yàn)镸SC向成骨和脂肪分化的能力處于一個(gè)平衡狀態(tài)。其中，圖1的A、B、C顯示了肝癌原發(fā)灶組織MSC與同一病人癌旁組織MSC的表型特征，其中，A:顯示了肝癌MSC與癌旁組織MSC的代表性形態(tài)，呈典型的成纖維狀，增殖良好，X40 ；B:顯示了在特異的成骨誘導(dǎo)體系培養(yǎng)不同時(shí)間后，肝癌MSC的早期及晚期成骨鑒定結(jié)果，即在特異的成骨誘導(dǎo)體系培養(yǎng)3周后，肝癌MSC的早期成骨鑒定為堿性磷酸酶(ALP)染色強(qiáng)陽性；在誘導(dǎo)4-5周后，晚期成骨的標(biāo)志細(xì)胞外基質(zhì)中鈣的沉積經(jīng)Von kossa染色強(qiáng)陽性；C:在脂肪誘導(dǎo)體系特異誘導(dǎo)后，肝癌MSC經(jīng)誘導(dǎo)形成的脂肪滴的油紅O特異染色結(jié)果，即在脂肪誘導(dǎo)體系特異誘導(dǎo)后，肝癌MSC出現(xiàn)許多小的脂滴，MSC經(jīng)誘導(dǎo)形成的脂肪滴被油紅O特異染成紅色。其中，需要說明的是，上述脂肪誘導(dǎo)體系采用添加了 10體積％的胎牛血清(Hyclone 公司)、10 6M 地塞米松(Sigma 公司)、0.5mM IBMX(Sigma 公司)、60 μ M 消炎痛(Sigma公司)和5 μ g/ml胰島素(Sigma公司)的高糖DMEM(Hyclone公司)培養(yǎng)基。二、肝癌組織MSC促進(jìn)肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖將腫瘤細(xì)胞 與肝癌MSC注射到雄性裸鼠皮下，左側(cè)為肝癌細(xì)胞單獨(dú)注射組，右側(cè)為肝癌MSC與肝癌細(xì)胞共移植組(MSC:腫瘤細(xì)胞=1:2)，考察肝癌MSC作為腫瘤微環(huán)境對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的作用。腫瘤細(xì)胞接種量為!fepG2為5 X IO6,肝癌組織MSC為2.5 X IO6,常規(guī)飼養(yǎng)一個(gè)月左右，期間定期觀察并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，處死裸鼠后，稱量腫瘤重量，將所得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，肝癌MSC能夠顯著的促進(jìn)！fepG2的體內(nèi)增殖(圖2)。圖2顯示了肝癌組織MSC對肝癌細(xì)胞系IfepG2體內(nèi)增殖的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖2所示，其中，HepG2表示H印G2單獨(dú)注射組，H印G2+LC-MSC表示肝癌MSC與H印G2共注射組，例如，左上圖中各裸鼠背部左側(cè)為HepG2單獨(dú)注射組，右側(cè)為肝癌MSC與HepG2共注射組。結(jié)果顯示肝癌MSC能夠顯著促進(jìn)!fepG2的體內(nèi)增殖。三、肝癌MSC促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移為了進(jìn)一步檢測肝癌MSC對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)明人利用裸鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，考察肝癌MSC與MHCC97L共移植對MHCC97L體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌MSC能夠顯著促進(jìn)MHCC97L肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖3A)和肺轉(zhuǎn)移(圖3B)。其中，圖3顯示了肝癌組織MSC對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖3所示，其中97L表示MHCC97L單獨(dú)注射組，MHCC97L+LC-MSC表示肝癌MSC與MHCC97L共注射組。上述結(jié)果表明，肝癌MSC能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖3A)和肺轉(zhuǎn)移(圖3B)。
四、肝癌MSC高表達(dá)S100A4基因芯片分析顯示來源于同一病人的肝癌MSC與癌旁組織MSC相比較，肝癌MSC中高表達(dá)S100A4 (圖4A);進(jìn)一步Western blot證實(shí)三對肝癌MSC均比來源于同一病人的癌旁組織MSC高表達(dá)S100A4 (圖4B);并構(gòu)建獲得了在肝癌細(xì)胞系中S100A4高表達(dá)的穩(wěn)定株(圖4C)。其中，圖4顯示了肝癌MSC中S100A4表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A:肝癌組織MSC與癌旁MSC基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果，結(jié)果表明肝癌MSC高表達(dá)S100A4，B:進(jìn)一步通過western blot證實(shí)肝癌MSC高表達(dá)S100A4, C:構(gòu)建得到了 S100A4高表達(dá)的穩(wěn)定株P(guān)LC和Huh7，其中，Con表示對照。五、外源高表達(dá)S100A4能夠促進(jìn)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移S100A4在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中外源高表達(dá)能夠顯著增加腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下形成的腫瘤重量(圖5A)，S100A4高表達(dá)顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞(SK-Hepl和SMMC-7721)的體外侵襲能力(圖5B)，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，S100A4高表達(dá)顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力(圖5C)。其中，圖5顯示肝癌細(xì)胞系高表達(dá)S100A4對肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。其中，A顯示了 S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果表明外源高表達(dá)S100A4促進(jìn)SMMC-7721的體內(nèi)成瘤。B顯示了 S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞體外侵襲能力影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果表明S100A4高表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲。C顯示了 S100A4高表達(dá)對肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果表明S100A4高表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。綜上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，S100A4能夠促進(jìn)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移。實(shí)施例2利用干涉片段抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移基于實(shí)施例1中所獲得的結(jié)論，發(fā)明人設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種針對S100A4的RNA干涉片段(委托Sigma Aldrich 公司合成)，其正義鏈為:C⑶GCU UGA UGC UGA GCAA (SEQIDN0:1)，反義鏈為:UUG CUCAGCAUCAAG CACGCSEQ IDNO:2)。然后，以正義鏈為:UUC UCC GAA C⑶⑶C ACG UTTCSEQ ID NO:3，其中最后兩位脫氧核糖核苷酸TT起到修飾和保護(hù)的作用)，反義鏈為:ACG UGA CAC GUU CGGAGAATTCSEQ IDNO:4，其中最后兩位脫氧核糖核苷酸TT起到修飾和保護(hù)的作用)的RNA片段作為對照，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將該干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞，干涉S100A4的表達(dá)，并通過觀察干涉前后肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的變化情況，判斷干涉S100A4的表達(dá)是否能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。具體步驟如下:2.1干涉片段轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞2.1.1準(zhǔn)備細(xì)胞:用含有10體積％的胎牛血清的HD-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系。選擇生長狀態(tài)良好，密度為8(Γ90%的細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染前5小時(shí)更換成不含任何抗生素的含有10%胎牛血清的HD-DMEM培養(yǎng)基，備用。2.1.2 制備 DNA-Lipofectamine 2000 復(fù)合物①取300微升無血清Opt1-MEM培養(yǎng)基于1.5毫升EP管中，并加入IOOpm的上述干涉片段，輕輕混勻稀釋，并于室溫下進(jìn)行孵育5min，以便獲得稀釋的質(zhì)粒。②同時(shí)，另取一支1.5毫升EP管，加入300微升上述無血清Opt1-ΜΕΜ培養(yǎng)基，取5微升Lipofectamine 2000 (使用前要混勻)與Opt1-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻稀釋，室溫下放置5分鐘(注意:從開始到第③步應(yīng)盡量控制在25分鐘以內(nèi))，以便獲得稀釋的Lipofectamine 2000。③迅速將步驟①獲得的稀釋的質(zhì)粒和步驟②獲得的稀釋的Lipofectamine 2000混合，輕輕混勻并于室溫下孵育20分鐘，然后再于室溫下穩(wěn)定6小時(shí)，以便獲得DNA-脂質(zhì)體Lipofectamine 2000復(fù)合物,其中該復(fù)合物可呈云霧狀,但不妨礙轉(zhuǎn)染。2.1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)化將步驟2.1.1中培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出，并利用無血清培養(yǎng)液將肝癌細(xì)胞洗滌2次，再向其中依次添加1.5ml Opt1-MEM培養(yǎng)基，以及600微升上述獲得的DNA-脂質(zhì)體Lipofectamine 2000復(fù)合物，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4 6小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的HD-DMEM培養(yǎng)基。進(jìn)而獲得干涉S100A4表達(dá)的肝癌細(xì)胞。2、增殖及轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步，檢測上述獲得的干涉S100A4表達(dá)的肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移情況，具體如下:2.1CCK8檢測干涉S100A4的的肝癌細(xì)胞增殖情況將上述獲得的干涉S100A4的肝癌細(xì)胞(以轉(zhuǎn)入對照片段的肝癌細(xì)胞為對照)以3000個(gè)/200微升/孔的密度接種于96孔板中，每組均含6個(gè)復(fù)孔，選取24小時(shí)和48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行CCK8檢測。檢測前每孔加100 μ L培養(yǎng)基和10 μ L CCK-8，于37°C 5%C02條件下培養(yǎng)2h后，利用酶聯(lián)儀檢測各孔中液體于450nm波長下的吸光度值。結(jié)果見圖6(B)。2.2侵襲轉(zhuǎn)移以轉(zhuǎn)入對照片段的肝癌細(xì)胞為對照，將上述獲得的干涉S100A4表達(dá)的肝癌細(xì)胞進(jìn)行侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):(I)制備侵襲小室:將Matrigel膠從_20°C取出后置于4°C融化，并用無血清培養(yǎng)基將其稀釋(按照1:5 1:8的比例進(jìn)行稀釋)后，取400 μ I鋪于Transwell膜上，然后將Transwell小室置于6孔板中，于37°C孵箱放置3h使Matrigel膠凝固。其中，放入37°C孵箱前的操作均于冰上進(jìn)行。(2)接種細(xì)胞:將轉(zhuǎn)染S100A4的干涉片段或者對照片段的腫瘤細(xì)胞消化離心后，用無血清培養(yǎng)基重懸。在Transwell小室內(nèi)加入Iml腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為3X105 6X IO5 (依腫瘤細(xì)胞侵襲能力選擇合適的細(xì)胞數(shù))。并在Transwell小室下腔中加入3ml含1.5%胎牛血清的培養(yǎng)基。(3)培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)24 48h (依腫瘤細(xì)胞侵襲能力而定)。(4)固定及染色:取出Transwell小室,PBS清洗,用棉簽擦去Transwell上層的細(xì)胞，用1%結(jié)晶紫-甲醛溶液進(jìn)行固定并染色20 30min，吸去染色液，然后用自來水緩慢洗去殘留染色液，空氣干燥。(5)鏡檢:將經(jīng)過固定及染色的Transwell小室于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照,每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果見圖6。圖6顯示了干涉S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，A:干涉肝癌MSC的S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞系Huh7中肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示干涉肝癌MSC中S100A4的表達(dá)后，肝癌MSC促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的能力受到顯著抑制；B:通過CCK8生長曲線研究顯示干涉肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，對肝癌細(xì)胞系Huh7中肝癌細(xì)胞增殖能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由結(jié)果可知在肝癌細(xì)胞系中干涉S100A4的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降；C:干涉肝癌細(xì)胞S100A4表達(dá)對肝癌細(xì)胞系Huh7和97L中肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由結(jié)果可知在肝癌細(xì)胞中干涉S100A4的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞系Huh7和97L的侵襲能力顯著被抑制。綜上，結(jié)果證明，利用本發(fā)明的干涉片段能夠有效干涉S100A4的表達(dá)，從而能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合 適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING <110>中W人R解放軍軍事潑學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所 ■120>十■涉片段及其應(yīng)用
130>PIDC120480
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
,210>1
<211>19
‘212〉RNA
<213>Artit i
<220>
<:223>r涉片段TP:義鏈
-400 >1
cgugcuugau gcugagcaa19
<210>2
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<213>Artificial
<2W>
^223>—R歩片段反義鏈
<棚>2
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<212>RNA
、213>Artificial
220> <223>對照RNA片段iH義鏈 <400>3
uucuccgaac- gugucacgut t21
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<2i2>RNA
' 213>Artificial
<220> <223〉對照RNA片段反義鏈 <400>4
acgugacarg mirggagaat t2權(quán)利要求
1.一種干涉片段，其正義鏈和反義鏈分別具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的干涉片段在抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于， 利用所述干涉片段下調(diào)所述肝癌細(xì)胞中所述S100A4的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。
4.一種抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，包括: 將權(quán)利要求1所述的干涉片段轉(zhuǎn)入所述肝癌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將所述干涉片段直接轉(zhuǎn)入所述肝癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用脂質(zhì)體系統(tǒng)將所述干涉片段轉(zhuǎn)入所述肝癌細(xì)胞，是通過直接轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了干涉片段及其應(yīng)用。其中，該干涉片段的正義鏈和反義鏈分別具有SEQ IDNO1~2所示的核苷酸序列。利用本發(fā)明的干涉片段轉(zhuǎn)化肝癌細(xì)胞，能夠顯著地下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A4的表達(dá)，從而能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。
文檔編號A61P35/04GK103074341SQ20121048034
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者裴雪濤, 岳 文, 閻新龍, 賈雅麗, 姚海雷, 陳琳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所