專利名稱：具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒及其制法和用途的制作方法
具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒及其制法和用途
背景技術(shù)：
氧化鐵等磁性納米微粒作為一種重要的生物材料在生物醫(yī)藥，如磁共振造影劑方面取得了廣泛的應(yīng)用(J Am Chem Soc 2005; 127:5732, J Am Chem Soc 2008; 130:7542.)。目前，氧化鐵納米微粒正作為納米平臺(tái)來構(gòu)建多功能的成像探針(Angew Chem Int Ed2009;48:4174)。其中一項(xiàng)非常重要的工作就是將藥物負(fù)載到造影探針上制備集治療、成像與示蹤為一體的診療探針(Adv Funct Mater 2009; 19:1553)。但只通過氧化鐵帶來的單一的成像模式，不能一次獲得足夠的生物學(xué)信息滿足臨床的需要，因此同一探針的多模態(tài)成像成為目前醫(yī)學(xué)成像的發(fā)展趨勢(shì)，不同模態(tài)的成像技術(shù)可以提供不同信息，如PET/CT技術(shù)，PET圖像提供生物體的功能信息，CT圖像提供生物體的結(jié)構(gòu)信息，將兩種信息結(jié)合就可以確切了解在生物體的某個(gè)位置的功能狀態(tài)。單模態(tài)成像只能觀測(cè)一個(gè)方面，而多模態(tài)成像則可以同時(shí)觀測(cè)生物體內(nèi)的兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的組織信息，這對(duì)研究生物體內(nèi)不同系統(tǒng)之間的相互作用至關(guān)重要。多模態(tài)成像使得實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察生物有機(jī)體內(nèi)的生物反應(yīng)變化過程成為現(xiàn)實(shí)，使得人們可以直觀地從基因表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞功能的多層面、多視角、觀察研究有機(jī)個(gè)體發(fā)育、遺傳進(jìn)化、重大疾病發(fā)生、環(huán)境對(duì)生命個(gè)體影響等生命現(xiàn)象的發(fā)生、發(fā)展過程，對(duì)闡釋生命活動(dòng)的基本規(guī)律，揭示疾病發(fā)生機(jī)理，建立疾病預(yù)警系統(tǒng)，提高醫(yī)療診治水平，探詢發(fā)現(xiàn)新藥物具有重大作用。因此對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)將PET成像、熒光成像和磁共振成像幾種不同功能的成像技術(shù)結(jié)合在一個(gè)探針中，從而實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。PET (Positron Emission Tomography正電子發(fā)射斷層成像術(shù))是一種核醫(yī)學(xué)三維成像技術(shù)，具有高分辨率，被證明是一種直接的，高靈敏度的技術(shù)，它可以用來定量地考察被標(biāo)記物的體內(nèi)行為。突光成像(Optical Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與突光(fluorescence)兩種技術(shù)。這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi)，己廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。磁共振成像(MRI)，利用人體組織中氫原子核(質(zhì)子)在磁場(chǎng)中受到射頻脈沖的激勵(lì)而發(fā)生核磁共振現(xiàn)象，產(chǎn)生磁共振信號(hào)，經(jīng)過電子計(jì)算機(jī)處理，重建出人體某一層面的圖像的成像技術(shù)。磁共振成像(MRI)與PET和熒光成像相比，能提供更好的空間分辨率，因此能很好的描述出微粒的體內(nèi)分布，而MRI的靈敏度比PET和熒光成像差，而PET成像的信噪比最高，熒光成像的信噪比雖然不及PET成像高，但其靈敏度非常好。由于熒光成像既可以使用小動(dòng)物成像儀成像，也可以通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡來觀察，因此熒光成像成為了構(gòu)建體外成像和活體成像的橋梁。氧化鐵納米微粒，無毒，生物可降解，廉價(jià)而被作為制備診療探針的原料，但診療探針的研究進(jìn)展還非常有限。為了達(dá)到預(yù)期的效果，診療探針必須具有合適的循環(huán)時(shí)間，良好的病灶聚集能力和高的血管溢出率。然而，普通氧化鐵納米微粒表面不易連接藥物分子(Small 2006; 2:785)。到目前為止，氧化鐵納米微粒負(fù)載藥物是通過供價(jià)聯(lián)接(JAm Chem Soc 2004; 126:7206, Small 2006; 2:785)，藥物的負(fù)載率較低，釋放效果也比較差。一種解決辦法是將氧化鐵納米微粒載入具有藥物負(fù)載功能的載體中，和藥物一起載入載體中(Angew Chem Int Ed 2008; 47:5362),而這一體系的藥物負(fù)載率較低,預(yù)期的臨床循環(huán)情況也未知。此外，雖然蛋白基藥物載體，如血清白蛋白(HSA)長期被用于藥物載體(J Clin Oncol 2005; 23:7794.),也用來包裹氧化鐵用作造影材料(Angew Chem Int Ed2009;48:4174)，研究表明血清白蛋白可以延長藥物分子的循環(huán)時(shí)間，以及腫瘤富集效率。血清白蛋白藥物復(fù)合物通常是通過將藥物溶解在極性溶劑中然后加入血清白蛋白的水溶液中而制得(Expert Opin Pharmacother 2006; 7:1041)。這對(duì)于通過共沉淀法或者高溫分解法制得的氧化鐵納米微粒來說并不適合。因?yàn)橥ㄟ^水相共沉淀法制得的氧化鐵納米微粒表面的親水性較強(qiáng)，而通過熱分解法制得的氧化鐵納米微粒表面的疏水性太強(qiáng)，都不利于與血清白蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明首先制備了表面經(jīng)過檸檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮修飾的具有中等極性的氧化鐵納米微粒，然后通過模板聚合法(Adv Mater,2004，16:933)使表面修飾的氧化鐵納米微粒與大分子-單體對(duì)共聚合，在水相，無有機(jī)溶劑的條件下，通過非共價(jià)鍵合力很方便的將氧化鐵納米微粒負(fù)載入大分子載體中。然后在大分子表面標(biāo)記近紅外熒光染料(Cy5. 5染料，NIR-797，ICG熒光染料等)(Mol Imaging2009;8:65.)和核素分子(64Cu-DOTA螯合劑，99mTc-DTPA等)，進(jìn)一步負(fù)載藥物(如抗腫瘤藥物，光動(dòng)力治療藥物)，并注入異種移植有腫瘤的小鼠模型中。實(shí)現(xiàn)近紅外/PET/磁共振多模態(tài)成像并檢測(cè)載藥納米微粒的體內(nèi)輸運(yùn)過程。這項(xiàng)發(fā)明可成為集藥物傳輸、示蹤和成像的納米平臺(tái)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案
一種具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，它是由大分子單體和丙烯酸的共聚物包裹的氧化鐵等磁流體的復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記有近紅外熒光染料和核素分子后進(jìn)行交聯(lián)，最后進(jìn)行載藥的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，所述的大分子單體是殼聚糖、明膠、纖維素或酪蛋白。
上述的載藥納米粒，所述的氧化鐵磁流體是檸檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化鐵納米微粒，流體動(dòng)力學(xué)半徑為5 20nm。上述的載藥納米粒，所述的殼聚糖是脫乙酰度為80-95%的數(shù)均分子量為I -20萬的殼聚糖。上述的載藥納米粒，所述的熒光染料是Cy5. 5-NHS染料或異硫氰酸NIR-797染料。上述的載藥納米粒，所述的標(biāo)記有核素分子是標(biāo)記有99mTc或64Cu。上述的載藥納米粒，所述的載藥是載有順鉬或阿霉素等抗腫瘤藥物。.
一種制備上述載藥納米粒的方法，它包括如下步驟
步驟I.表面修飾的氧化鐵納米微粒(磁流體):通過共沉淀法、水熱法或熱分解法制備的檸檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化鐵納米微粒，流體動(dòng)力學(xué)半徑5 20nm，得到產(chǎn)物；
步驟2.大分子-單體對(duì)與表面修飾的氧化鐵納米微粒共聚合制備包裹有氧化鐵的復(fù)合納米微粒(Angew Chem Int Ed, 2004, 43:6369):將大分子單體(殼聚糖，明膠,纖維素，酪蛋白等)溶于含有一定量的聚丙烯酸水溶液中，當(dāng)體系變?yōu)榫嗲页吻逋该骱?，在超聲條件下加入計(jì)量的步驟 I制備的磁流體，于氮?dú)鈿夥障律郎刂?0-90°C，然后加入計(jì)算量的K2S2O8溶液(1%)引發(fā)丙烯酸的聚合，反應(yīng)結(jié)束后，得到帶有淺藍(lán)色乳光的溶液，經(jīng)過濾后在截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去剩余的單體和引發(fā)劑；
步驟3.復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記近紅外熒光分子
方法一由步驟2制得的納米微粒分散在硼酸鹽緩沖溶液中(50 mM, pH 8.5)通過PD-IO column色譜柱，熒光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，與Cy5. 5-NHS的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)30分鐘；
方法二 由步驟2制得的納米微粒分散在硼酸鹽緩沖溶液中(50 mM, pH 8.5)通過PD-IO column色譜柱，然后將異硫氰酸NIR-797溶于二甲亞砜(DMSO)中，使其濃度為10mg/mL，取O. I mL染料溶液緩慢滴入2 mL調(diào)整過pH值的納米微球溶液中，在37°C避光反應(yīng)攪拌2 h，然后將溶液通過ro-10 column色譜柱純化納米微球；
步驟4.復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記核素分子
方法一將二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 二酐(合成方法見(Chem. Eur. J. 2004,10:3252.))溶于DMSO中，使其濃度為20 mg/mL, DTPA與表面修飾的氧化鐵納米微粒摩爾比為5:1，避光反應(yīng)過夜，然后將上述溶液通過ro-10色譜柱，并分散在PBS緩沖溶液中(pH 7. 4)，納米微球的放射性核素標(biāo)記的方法如下將氯化錫和99mTcCM 加入到標(biāo)記了 DTPA的納米微球的PBS溶液中(O. I mol/L，pH=7. 4)，在室溫下攪拌30 min，然后，將99mTc-DTPA-納米粒子通過O. 2 μ m注濾頭過濾，來純化得到的99mTc標(biāo)記的載藥納米微球；方法二 將偶聯(lián)劑DOTA-NHS (D0TA 1,4,7, 10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸，合成方法見(Cancer Res 2006; 66:9673))溶解在DMSO中，DOTA與表面修飾的氧化鐵納米微粒摩爾比為5:1，避光反應(yīng)過夜，然后將上述溶液通過ro-10色譜柱，并分散在PBS緩沖溶液中(pH 7. 4)，將64CuCl2 (2 mCi)鹽酸溶液加入到標(biāo)記了 DOTA的納米微球的PBS溶液中(O. Imol/L, pH=7. 4),在室溫下攪拌30 min,然后，將64Cu-DOTA-納米粒子通過0. 2 μ m注濾頭過濾，來純化得到的64Cu標(biāo)記的載藥納米微球(64CuTv2= 12. 7 hours, Er= 655 keV (17%);Er= 573 keV (39%)))；
步驟5.標(biāo)記有核素分子和近紅外熒光分子的復(fù)合納米微粒的藥物負(fù)載在雙標(biāo)記的復(fù)合納米微球溶液中加入計(jì)算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)(Angew Chem Int Ed 2003, 42: 1516·),在室溫的條件下攪拌10 h后，將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，然后將計(jì)算量的順鉬加入到交聯(lián)后的復(fù)合納米微球溶液中，使藥物濃度為I mg/mL,并將其放入37°C搖床中攪拌2天,然后根據(jù)kataoka課題組的方法來除去沒有負(fù)載上的游離的順鉬(Langmuir 1999，15，377.)，得到本發(fā)明的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒。本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明由于同時(shí)具有近紅外熒光分子、核素分子并負(fù)載磁性納米粒子，因此可以將熒光成像、PET成相和磁共振成像結(jié)合起來，有機(jī)的達(dá)到同步的多模式成像，同時(shí)獲得多模態(tài)的信息。2、本發(fā)明在結(jié)構(gòu)中的大分子具有氨基，羥基，羧基官能團(tuán)，不僅可以嫁接熒光分子，核素分子，還能與藥物分子產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合，有助于藥物的負(fù)載和控制釋放。3、本發(fā)明在溫和的條件下反應(yīng)，幾乎不使用溶劑，復(fù)合微粒的生物相容性好。4、本發(fā)明所采用的納米載體，尺寸和表面性質(zhì)易于調(diào)控，可使得成像材料具有合適的體內(nèi)循環(huán)半衰期和合適的視窗時(shí)間。5、本發(fā)明與單模態(tài)成像相比，多模態(tài)成像可以同時(shí)使用核素、光學(xué)標(biāo)記和磁共振成像的探針同時(shí)探測(cè)生物體的不同分子，對(duì)在體研究生物體內(nèi)的分子一分子相互作用具有重要意義，也可以使用核素和光學(xué)標(biāo)記的探針同時(shí)探測(cè)生物體的同一分子，從不同側(cè)面研究生物體的同一種分子，充分發(fā)揮PET成像和熒光學(xué)成像的優(yōu)勢(shì)。6、本發(fā)明的藥物載體中雖然已經(jīng)負(fù)載了納米氧化鐵，但藥物的負(fù)載量反而增加了，可能與載體內(nèi)部的比表面積增加有關(guān)。7、本發(fā)明可成為集藥物傳輸、示蹤和成像的納米平臺(tái)，所涉及的磁性納米材料、大分子、小分子單體、熒光染料和核素分子并不局限于本發(fā)明實(shí)例中所提到的具體物質(zhì)，凡符合本發(fā)明思想的均屬于本發(fā)明范疇。



圖I、具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒合成過程示意圖。圖2、具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的負(fù)載順鉬藥物納米粒在37°C時(shí)，PBS溶液(pH=7. 4)中的體外釋放曲線。圖3、A為不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤部位的近紅外熒光強(qiáng)度曲線出為靜注后72小時(shí)不同組織器官的近紅外熒光照片。圖4、通過尾靜脈注射多模態(tài)成像復(fù)合載藥納米微球后，在不同時(shí)間點(diǎn)納米微球在荷瘤小鼠的不同組織器官中的分布，其中圖4A為實(shí)施例I制備的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒；圖4B為實(shí)施例I制備的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒；圖4C為實(shí)施例I制備的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明屬于集多模態(tài)成像技術(shù)與藥物輸運(yùn)為一體的復(fù)合載藥納米微粒的制備，它包括PET成像，熒光成像和磁共振成像三種不同功能的成像探針，并可以負(fù)載藥物實(shí)施體內(nèi)的輸運(yùn)和控制釋放。多模態(tài)成像載藥納米微粒的合成過程如圖I所示。以下通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例I.具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒的制備
稱取精制后I萬或20萬數(shù)均分子量、脫乙酰度為80%或95%的殼聚糖O. 25克，溶解在50 ml含有計(jì)算量的丙烯酸的水溶液中。其中殼聚糖中的氨基和丙烯酸中羧基的比例為1:1。對(duì)于不同分子量的殼聚糖，丙烯酸的量略微作了一些調(diào)整。常溫條件下攪拌，直至殼聚糖完全溶解。大概需要15分鐘。向體系中加入O. Ig磁流體，維持整個(gè)體系的體積為50 ml，裝上冷凝裝置，接通冷凝水?？焖偕郎氐?0°C，加入少量的引發(fā)劑過硫酸鉀，保持在70°C反應(yīng)。反應(yīng)過程中觀察體系顏色的變化。當(dāng)體系顏色變?yōu)槿榘咨?，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，以確保體系中的丙烯酸反應(yīng)完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交聯(lián)2小時(shí)。所得的乳液通過磁分離得到包裹有磁性納米微粒的復(fù)合微球。將上述磁性納米微球分散在硼酸鹽緩沖溶液中(50 mM, pH 8. 5)通過Η)_10column色譜柱；熒光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，與Cy5. 5-NHS的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)30分鐘。得到標(biāo)記有熒光染料Cy5. 5的復(fù)合納米微球，然后繼續(xù)通過磁分離去除未反應(yīng)的 Cy5. 5-NHS ο將二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐溶于DMSO中，使其濃度為20 mg/mL。取O. 2 mL的DTPA 二酐溶液緩慢滴入2 mL的PBS，pH=8的標(biāo)記有Cy5. 5-NHS的殼聚糖-聚丙烯酸/氧化鐵復(fù)合納米微球溶液中，在室溫下攪拌24 h。經(jīng)過濾后將溶液放入截留分子量為12kDa的透析袋中用PBS溶液透析2天以除去沒有連接到納米微球上的DTPA。將氯化錫和99mTc04加入到標(biāo)記了 DTPA的納米微球的PBS溶液中(O. I mol/L, pH=7. 4)，在室溫下攪拌30 min。然后，經(jīng)過超濾的方法(截留分子量為100 kDa)來純化得到的99mTc標(biāo)記的載藥納米微球。然后將上述溶液通過ro-10色譜柱除去未反應(yīng)的99mTc04 。
將雙標(biāo)記的磁性復(fù)合納米微球溶液中加入計(jì)算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。在室溫的條件下攪拌10h后，將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。然后將計(jì)算量的順鉬加入到交聯(lián)后的復(fù)合納米微球溶液中，使藥物濃度為I mg/mL。并將其放入37°C搖床中攪拌2天。然后除去沒有負(fù)載上的游離的順鉬。得到具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的殼聚糖-聚丙烯酸-氧化鐵載藥納米微粒MIDLNl，基本理化參數(shù)見表I，采用I萬或20萬數(shù)均分子量和脫乙酰度為80%或95%的殼聚糖制得的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的殼聚糖-聚丙烯酸-氧化鐵載藥納米微粒的理化性質(zhì)沒有本質(zhì)的區(qū)別。實(shí)施例2.具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒的制備
將O. 8 g明膠溶于含有O. 2 g丙烯酸的水溶液中，當(dāng)體系變?yōu)榫嗲页吻逋该骱螅蟾判枰?5分鐘。向體系中加入O. Ig磁流體，維持整個(gè)體系的體積為50 ml，裝上冷凝裝置，接通冷凝水。于氮?dú)鈿夥障律郎刂?0°C，加入少量的引發(fā)劑過硫酸鉀，保持在80°C反應(yīng)。反應(yīng)過程中觀察體系顏色的變化。當(dāng)體系顏色變?yōu)槿榘咨?，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，以確保體系中的丙烯酸反應(yīng)完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交聯(lián)2小時(shí)。所得的乳液通過磁分離得到包裹有磁性納米微粒的復(fù)合微球。將上述磁性納米微球分散在硼酸鹽緩沖溶液中(50 mM, pH 8. 5)通過Η)_10column色譜柱；熒光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，與Cy5. 5-NHS的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)30分鐘，得到標(biāo)記有熒光染料Cy5. 5的復(fù)合納米微球，然后繼續(xù)通過磁分離去除未反應(yīng)的 Cy5. 5-NHS ο將二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐溶于DMSO中，使其濃度為20 mg/mL。取O. 2 mL的DTPA 二酐溶液緩慢滴入2 mLPBS,pH=8的標(biāo)記有Cy5. 5-NHS的殼聚糖-聚丙烯酸/氧化鐵復(fù)合納米微球納米微球溶液中，在室溫下攪拌24 h。經(jīng)過濾后將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用PBS溶液透析2天以除去沒有連接到納米微球上的DTPA。將氯化錫和99mTc04 加入到標(biāo)記了 DTPA的納米微球的PBS溶液中(O. I mol/L, pH=7. 4)，在室溫下攪拌20 min。然后，經(jīng)過超濾的方法(截留分子量為100 kDa)來純化得到的99mTc標(biāo)記的載藥納米微球。然后將上述溶液通過ro-10色譜柱除去未反應(yīng)的99mTc04 。
將雙標(biāo)記的磁性復(fù)合納米微球溶液中加入計(jì)算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。在室溫的條件下攪拌10h后，將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。然后將計(jì)算量的順鉬加入到交聯(lián)后的復(fù)合納米微球溶液中，使藥物濃度為I mg/mL。并將其放入37 °C搖床中攪拌2天。然后根據(jù)kataoka課題組的方法來除去沒有負(fù)載上的游離的順鉬。得到具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的明膠-聚丙烯酸-氧化鐵載藥納米微粒MIDLN2，基本理化參數(shù)見表I。實(shí)施例3.具核素成像 、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒的制備
將I g酪蛋白溶于含有0.2 g丙烯酸的水溶液中，當(dāng)體系變?yōu)榫嗲页吻逋该骱螅蟾判枰?0分鐘。向體系中加入O. Ig磁流體，維持整個(gè)體系的體積為50 ml，裝上冷凝裝置，接通冷凝水。于氮?dú)鈿夥障律郎刂?0°C，加入少量的引發(fā)劑過硫酸鉀，保持在90°C反應(yīng)。反應(yīng)過程中觀察體系顏色的變化。當(dāng)體系顏色變?yōu)槿榘咨螅^續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，以確保體系中的丙烯酸反應(yīng)完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交聯(lián)2小時(shí)。所得的乳液通過磁分離得到包裹有磁性納米微粒的復(fù)合微球。將上述磁性納米微球分散在硼酸鹽緩沖溶液中(50 mM, pH 8. 5)通過Η)_10column色譜柱。然后將異硫氰酸NIR-797溶于二甲亞砜(DMSO)中，使其濃度為10 mg/mL。取O. I mL染料溶液緩慢滴入2 mL調(diào)整過pH值的納米微球溶液中，在37°C避光反應(yīng)攪拌2ho然后將溶液通過ro-10 column色譜柱純化納米微球。。將偶聯(lián)劑DOTA-NHS (D0TA: 1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸，合成方法見(Cancer Res 2006;66:9673 - 81.))溶解在DMSO中，DOTA與表面修飾的氧化鐵納米微粒摩爾比為5:1，避光反應(yīng)過夜。然后將上述溶液通過ro-10色譜柱，并分散在PBS緩沖溶液中(pH 7.4)。將64CuCl2 (2 mCi)鹽酸溶液加入到標(biāo)記了 DOTA的納米微球的PBS溶液中(O. I mol/L，pH=7. 4)，在室溫下攪拌30 min。然后，將64Cu-DOTA-納米粒子通過O. 2 μ m注濾頭過濾，來純化得到的64Cu標(biāo)記的載藥納米微球(64CuTv2= 12.7 hours, Er= 655 keV(17%); Er= 573 keV (39%))
將雙標(biāo)記的磁性復(fù)合納米微球溶液中加入計(jì)算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。在室溫的條件下攪拌10 h后，將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。然后將計(jì)算量的順鉬加入到交聯(lián)后的復(fù)合納米微球溶液中，使藥物濃度為I mg/mL。并將其放入37 °C搖床中攪拌2天。同樣根據(jù)kataoka課題組的方法來除去沒有負(fù)載上的游離的順鉬。得到具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的酪蛋白-聚丙烯酸-氧化鐵載藥納米微粒MIDLN3，基本理化參數(shù)見表I。表權(quán)利要求
1.一種具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，粒徑為80-250nm，其特征是它是由大分子單體和丙烯酸的共聚物包裹的氧化鐵磁流體的復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記有近紅外熒光染料和核素分子后進(jìn)行交聯(lián)，最后進(jìn)行載藥的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，所述的大分子單體是殼聚糖、明膠、纖維素或酪蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載藥納米粒，其特征是所述的氧化鐵磁流體是檸檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化鐵納米微粒，流體動(dòng)力學(xué)半徑為5 20nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載藥納米粒，其特征是所述的殼聚糖是脫乙酰度為80-95%的數(shù)均分子量為1-20萬的殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載藥納米粒，其特征是所述的熒光染料是Cy5.5-NHS染料或異硫氰酸NIR-797染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載藥納米粒，其特征是所述的標(biāo)記有核素分子是標(biāo)記有99mTc 或 64Cu。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載藥納米粒，其特征是所述的載藥是載有順鉬藥物。
7.一種制備權(quán)利要求I所述載藥納米粒的方法，其特征是它包括如下步驟 步驟I.表面修飾的氧化鐵納米微粒的磁流體通過共沉淀法、水熱法或熱分解法制備的檸檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化鐵納米微粒，流體動(dòng)力學(xué)半徑5 20nm，得到產(chǎn)物； 步驟2.大分子-單體對(duì)與表面修飾的氧化鐵納米微粒共聚合制備包裹有氧化鐵的復(fù)合納米微粒將大分子單體殼聚糖、明膠、纖維素或酪蛋白溶于含有聚丙烯酸水溶液中，當(dāng)體系變?yōu)榫嗲页吻逋该骱?，在超聲條件下加入計(jì)量的步驟I制備的磁流體，于氮?dú)鈿夥障律郎刂?0-90°C，然后加入1%的K2S2O8溶液引發(fā)丙烯酸的聚合，反應(yīng)結(jié)束后，得到帶有淺藍(lán)色乳光的溶液，經(jīng)過濾后在截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去剩余的單體和引發(fā)劑； 步驟3.復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記近紅外熒光分子 方法一由步驟2制得的納米微粒分散在濃度為50 mM、pH 8. 5的硼酸鹽緩沖溶液中，通過TO- Ο column色譜柱，熒光染料Cy5. 5-NHS溶解在二甲亞砜中，與Cy5. 5-NHS的摩爾比為5:1，避光反應(yīng)30分鐘； 方法二 由步驟2制得的納米微粒分散在濃度為50 mM、pH 8. 5的硼酸鹽緩沖溶液中，通過ro-10 column色譜柱，然后將異硫氰酸NIR-797溶于二甲亞砜中，使其濃度為10 mg/mL,取O. I mL染料溶液緩慢滴入2 mL調(diào)整過pH值(8. 5)的納米微球溶液中，在37°C避光反應(yīng)攪拌2 h，然后將溶液通過ro-10 column色譜柱純化納米微球； 步驟4.復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記核素分子 方法一將二乙烯三胺五乙酸二酐(DTPA)溶于DMSO中，使其濃度為20 mg/mL，二乙烯三胺五乙酸二酐與表面修飾的氧化鐵納米微粒摩爾比為5:1，避光反應(yīng)過夜，然后將上述溶液通過ro-10色譜柱，并分散在pH= 7. 4的PBS緩沖溶液中，納米微球的放射性核素標(biāo)記的方法如下將氯化錫和99mTcCM 加入到標(biāo)記了二乙烯三胺五乙酸二酐的納米微球的濃度為O. I mol/L、pH=7. 4的PBS溶液中，在室溫下攪拌30 min，然后，將99mTc-DTPA-納米粒子通過O. 2 μ m注濾頭過濾，來純化得到的99mTc標(biāo)記的載藥納米微球； 方法二 將偶聯(lián)劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA-NHS)溶解在DMSO中，DOTA與表面修飾的氧化鐵納米微粒摩爾比為5:1，避光反應(yīng)過夜，然后將上述溶液通過ro-io色譜柱，并分散在PH 7. 4的PBS緩沖溶液中，將64CuCl2 (2 mCi)鹽酸溶液加入到標(biāo)記了DOTA的納米微球的濃度為O. I mol/L、pH=7. 4的PBS溶液中，在室溫下攪拌30 min，然后，將64Cu-DOTA-納米粒子通過O. 2 μ m注濾頭過濾,來純化得到的64Cu標(biāo)記的載藥納米微球； 步驟5.標(biāo)記有核素分子和近紅外熒光分子的復(fù)合納米微粒的藥物負(fù)載在雙標(biāo)記的復(fù)合納米微球溶液中加入計(jì)算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，在室溫的條件下攪拌10 h后，將溶液放入截留分子量為12 kDa的透析袋中用蒸餾水透析24 h以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，然后將計(jì)算量的順鉬加入到交聯(lián)后的復(fù)合納米微球溶液中，使藥物濃度為I mg/mL，并將其放入37°C搖床中攪拌2天，然后根據(jù)kataoka課題組的方法來除去沒有負(fù)載上的游離的順鉬，得到具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒。
8.權(quán)利要求I所述的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，粒徑為80-250nm，它是由大分子單體和丙烯酸的共聚物包裹的氧化鐵磁流體的復(fù)合納米微粒表面標(biāo)記有近紅外熒光染料和核素分子，然后進(jìn)行交聯(lián)，最后進(jìn)行載藥的具核素成像、熒光成像與磁共振成像功能的載藥納米粒，所述的大分子單體是殼聚糖、明膠、纖維素或酪蛋白。本發(fā)明與單模態(tài)成像相比，多模態(tài)成像可以同時(shí)使用核素、光學(xué)標(biāo)記和磁共振成像的探針同時(shí)探測(cè)生物體的不同分子，對(duì)在體研究生物體內(nèi)的分子一分子相互作用具有重要意義，也可以使用核素和光學(xué)標(biāo)記的探針同時(shí)探測(cè)生物體的同一分子，從不同側(cè)面研究生物體的同一種分子，充分發(fā)揮磁共振成像、PET成像和熒光成像的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號(hào)A61K49/14GK102921022SQ20121048424
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者丁寅, 陳洪淵, 徐靜 申請(qǐng)人:南京大學(xué)