專利名稱：miRNA-361及其反義核苷酸的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs的新藥用途，具體涉及一種miRNA-361及其反義核苷酸的用途，尤其涉及一種miRNA-361及其反義核苷酸在制備用于診斷、防治心臟疾病的藥物中的用途，屬于心臟疾病的診斷、預(yù)防和治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國(guó)， 隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過(guò)癌癥成為第一大致死原因。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部2004年底公布的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，我國(guó)18 歲及以上居民高血壓患病率為18. 8%，估計(jì)全國(guó)患病人數(shù)I. 6億多，由此造成的心肌肥厚、 心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相關(guān)心臟疾病的病人達(dá)幾千萬(wàn)。目前關(guān)于心臟疾病發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，心臟疾病的預(yù)防、診斷和治療尚不能達(dá)到讓人滿意的效果，急需開發(fā)新的技術(shù)、方法用于心臟病的診斷、防治。
miRNA是新近研究發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，許多研究表明miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 單一的miRNA可以同時(shí)作用于多個(gè)祀基因的mRNA的表達(dá),這樣藥物作用于一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)參與心臟發(fā)病基因的表達(dá)，影響多個(gè)信號(hào)通路，從整體上達(dá)到治療疾病的目的。由于miRNA在心臟病理狀態(tài)下表達(dá)水平不同，因此可以通過(guò)檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)診斷疾病。
細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、由基因控制及一系列酶參與的過(guò)程，對(duì)正常胚胎發(fā)育，維持細(xì)胞群體及惡性病變過(guò)程中均起重要作用，在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下， 如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。由于成熟的心肌細(xì)胞不能分裂增殖，心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡必然會(huì)使心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這一點(diǎn)可能是一些心臟疾病發(fā)病的機(jī)理。
目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)靶蛋白的表達(dá)參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生， 這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。尋找心臟中特異表達(dá)的、參與心肌細(xì)胞凋亡的 miRNA,闡明其作用機(jī)理，對(duì)于開發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、治療具有及其重要的意義和應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是確定或發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的心臟特異性性表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步確定其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵作用，將其應(yīng)用到這些心臟疾病的診斷、防治中。
除非特別指明，本文中的“miR-361”均指“miRNA-361”，其序列為下述SEQ ID NO: I 所示的核苷酸序列
5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
除非特別指明，本文中的“I/R”均指“心肌缺血/再灌注”。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一方面，本發(fā)明提供了一種單鏈非編碼miRNA-361反義核苷酸在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361反義核苷酸的序列為下述SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’。
優(yōu)選地，所述miRNA-361反義核苷酸的核苷酸序列在每個(gè)堿基均進(jìn)行了 2’ -甲氧基修飾。
優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
還一方面，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防或治療心臟疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含有效劑量的上述本發(fā)明所述的miRNA-361反義核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料。
優(yōu)選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或直接心肌注射。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種單鏈非編碼miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物組合物中的用途，其中，以所述miRNA-361核苷酸序列作為靶點(diǎn)或檢測(cè)對(duì)象，所述miRNA-361核苷酸的序列為下述SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列 5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’。優(yōu)選地，所述的心臟疾病包括心肌梗死、心肌缺血損傷、 心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
本發(fā)明還提供了一種診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含有效劑量的本發(fā)明上述所述的miRNA-361核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料。
優(yōu)選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。
本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-361在心肌缺血損傷及缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中miRNA-361表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)轉(zhuǎn)染和注射miRNA-361反義核苷酸抑制miRNA-361 的表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞凋亡及心肌缺血損傷，心肌梗死面積減少。
以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miRNA-361反義核苷酸通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用，miRNA-361反義核苷酸對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值。而升高miRNA-361 的表達(dá)則可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，心肌缺血損傷會(huì)更加嚴(yán)重。
具體的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miRNA-361 反義核苷酸(5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’ ) 通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用。在心肌細(xì)胞缺氧或心肌缺血損傷過(guò)程中， miRNA-361表達(dá)顯著上調(diào)，miRNA-361的上調(diào)可能誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。miRNA-361 在缺血再灌注動(dòng)物模型的心肌組織中表達(dá)上調(diào)；抑制小鼠的內(nèi)源性的miRNA-361，可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，使心肌梗死面積減少，心功能顯著改善。將miRNA-361反義核苷4酸與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成藥物，導(dǎo)入心臟或體內(nèi)，對(duì)許多心臟疾病將具有預(yù)防及治療作用。 可以考慮將miRNA-361反義核苷酸與殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等組合形成藥物分子，通過(guò)口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或直接心肌注射的方式，用于防治心臟疾病、改善心臟功能、阻止心肌纖維化及心肌重構(gòu)的發(fā)生。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中
圖I示出了實(shí)施例I中心肌缺血損傷及低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中 miRNA-361表達(dá)水平的變化，其中A示出了原代心肌細(xì)胞缺氧處理miRNA-361表達(dá)水平， 其中，縱坐標(biāo)表示以未處理的原代心肌細(xì)胞為基準(zhǔn)，在缺血處理過(guò)程中原代心肌細(xì)胞中 miRNA-361的表達(dá)水平；B示出了小鼠心肌缺血miRNA-361表達(dá)水平；
圖2示出了實(shí)施例2中抑制內(nèi)源性的miRNA-361對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抵抗作用，其中，A示出了原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-361反義核苷酸抑制內(nèi)源性的miRNA-361的表達(dá)情況示出了 miRNA-361反義核苷酸對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響；
圖3示出了實(shí)施例3中miRNA-361反義核苷酸對(duì)心肌缺血損傷的抵抗作用，其中， A和B分別示出了小鼠心肌注射miRNA-361反義核苷酸后實(shí)施心肌缺血再灌注手術(shù)，檢測(cè) miRNA-361反義核苷酸對(duì)心肌梗死面積及心肌凋亡的影響；
圖4示出了實(shí)施例4中小鼠靜脈注射miRNA-361 antagomir抑制內(nèi)源性 miRNA-361后缺血再灌注后24小時(shí)與對(duì)照組相比的心功能狀況，其中的A、B和C分別示出了對(duì)左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)和短軸截短率(FS)的指標(biāo)檢測(cè)情況；
在以上附圖中，為簡(jiǎn)便起見，361反義核苷酸表示miRNA-361反義核苷酸。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。
除非特別指明，以下實(shí)施例中采用的小鼠和大鼠乳鼠購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)，其中，小鼠品系為C57小鼠，大鼠品系為Wistar大鼠。
除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域中所用的常規(guī)方法。
除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級(jí)試劑，且可從正規(guī)渠道商購(gòu)獲得。
實(shí)施例I心肌細(xì)胞缺氧及心肌缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中miRNA-361表達(dá)情況檢測(cè)
在該實(shí)施例中，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，用以進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建，制備大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的具體步驟參見文獻(xiàn): W. -Q. Tan,Kun Wang, et al.，F(xiàn)oxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
利用大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞建立心肌缺氧模型，具體為，在低氧培養(yǎng)箱中(氧濃度低于1%)對(duì)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)模為IOcm培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞量約為IX IO6個(gè)，培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)0、1、2、3、4小時(shí)。隨培養(yǎng)時(shí)間的不同來(lái)提取RNA，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-361的表達(dá)水平，其具體操作參見文獻(xiàn)W. -Q. Tan, Kunffang, et al. , Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
具體為，PCR擴(kuò)增 miRNA-361 編碼序列(GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACT TATTATTTGAAAAGTCCCCCAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC, SEQ ID NO:3)及其上下游兩端各將近200個(gè)bp的序列，擴(kuò)增片段約562bp,具體為(ΤΓ「(ΚΠΤ 'Α('Α(;Α(Κ ΤΤ(;(' T TAGGCCTATTGCCTCAGTACTTCAGGGCAAGAATGAGGCTAACAGGTGAGTCATGTTACCATCTACCAGAC TGCCAGAACTGGGCCTAAATAATAGTCACCTCCCTGTGTTCAGATGTGCGTCATTTCTCTCAGTCTGGAG CCCTTTACTTTTCTCACACAACATAGAGATGCAGCAGTAGCAGAGGCTTCACTATGATTCTTTCTTGGGA CTCG GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACTTATTATTTGAAAAGTCCCC CAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC CCTCTCCTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTTGGAAATCAGTTTC ATCTGAAGCTTCTGCATAAACAGGCACATTCATTAGCATCTTATCCTGCATAGTTGAGCTTGCATTATTTACTCTCT GCGTTATCTTCATTAATTCTTTCTAATGCTGAAACACCTGAAATCAGTGTCTGCCGGTCACCAAAGGATCTCTATTA GACTTTGGAAGCAAACAAAGCAGCAAAGACTTCATA AAC TI GA (77 GAA GiK 'TAGCiT (SEQ IDNO: 4，其中加黑并帶下劃線標(biāo)記為miRNA-361的編碼序列；其余的為它的上下游序列，斜體帶下劃線標(biāo)記的為上下游引物序列，
PCR 體系 50ul，PCR 條件如下95。C 3min 一個(gè)循環(huán)；95。C 30sec，56。C30sec, 72。C Imin共28個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min，PCR引物設(shè)計(jì)如下
上游引物5，-CCTTGGTTTACAGAGCTTTGC-3’(SEQID NO:5);
下游引物5，-ACCTAGCCTTCAAGTCAAGTT-3’(SEQID N0:6)。
檢測(cè)到的miRNA-361表達(dá)水平如圖IA所示，在低氧處理4h_8h的區(qū)間內(nèi)， miRNA-361的表達(dá)顯著上調(diào)。
本實(shí)施例采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈建立心肌缺血模型結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈的操作步驟參見文獻(xiàn)Kun Wang, Bo Long, et al. , miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fisi. Nature Communications. 2012April 17;781 (3) :256-265。在 0-120分鐘的區(qū)間內(nèi)分別自心臟缺血區(qū)(危險(xiǎn)區(qū))組織及非缺血區(qū)心肌(遠(yuǎn)端區(qū))組織提取總RNA，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-361的表達(dá)水平(檢測(cè)方法及條件同上)， 其中，以自非缺血區(qū)心肌(遠(yuǎn)端區(qū))組織提取的RNA為對(duì)照組。結(jié)果如圖IB所示，表明缺血 30min-120min的心肌缺血組織中的miRNA-361表達(dá)水平較之非缺血組織及非缺血模型組表現(xiàn)出顯著的上升。
實(shí)施例2miRNA_361反義核苷酸抑制心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)中使用實(shí)施例I中原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為模型。對(duì)心肌細(xì)胞(細(xì)胞量約為 I X IO6)進(jìn)行miRNA-361反義核苷酸轉(zhuǎn)染處理(通過(guò)脂質(zhì)體lipfectin2000按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，購(gòu)自Invitrogen公司),轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,在低氧培養(yǎng)箱(氧濃度低于1%) 中對(duì)該細(xì)胞培養(yǎng)處理3小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，以未經(jīng)miRNA-361反義核苷酸轉(zhuǎn)染的原代心肌細(xì)胞為陰性對(duì)照，利用臺(tái)盼蘭染色方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，表明抑制內(nèi)源性miRNA-361可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例3miRNA_361反義核苷酸抑制心肌缺血損傷實(shí)驗(yàn)
小鼠經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射miRNA-361反義核苷酸可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷。以C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照如下方法注射miRNA-361反義核苷酸和它的陰性對(duì)照 (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，(SEQ IDN0:7)，并且每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2’-甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成，)(NC):小鼠稱重并麻醉，仰臥位固定，剪毛并用碘酒消毒手術(shù)區(qū)。 頸部正中切開氣管并插管，連動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣，在胸骨左緣處及心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約3cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟。稀釋miRNA-361反義核苷酸于PBS中，終體積為200 μ 1，終濃度為30mg。利用26號(hào)導(dǎo)管從心尖進(jìn)入動(dòng)脈根部，注射miRNA-361反義核苷酸時(shí)同時(shí)夾閉主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈，持續(xù)夾閉20秒(每只小鼠注射量為30mg/kg/天)。監(jiān)測(cè)5min，待心臟恢復(fù)竇律后，清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔。等小鼠清醒后，脫離呼吸機(jī)，放回籠中。心電圖監(jiān)測(cè)整個(gè)手術(shù)過(guò)程。
注射miRNA-361反義核苷酸3天后進(jìn)行心臟缺血再灌注手術(shù)，具體操作如下小鼠麻醉后，背位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上，并進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)。頸部正中切開氣管并插管，連動(dòng)物人工呼吸機(jī)，于第四肋間開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方2_處進(jìn)針，進(jìn)針深度O. 5_ ;以 6/0帶針縫合線穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓椎旁出針；待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定IOmin后，予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。以I、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持續(xù)O. 5hr以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。缺血45min之后，松開結(jié)扎線開始再灌注。以ST段下降為標(biāo)志。 清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔。再灌注24小時(shí)后用Evansblue/TTC 雙染測(cè)定心肌梗死面積。同時(shí)，以每只小鼠的注射量為30mg/kg/天的miRNA-361反義核苷酸陰性對(duì)照(5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2’ -甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成)的I/R組作為陰性對(duì)照組(NC)。
結(jié)果如圖3A所示，注射miRNA-361反義核苷酸的小鼠I/R組心肌梗死面積比野生小鼠I/R組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0. 01)。
心梗面積按如下方法計(jì)算左心室面積(left ventricle, LV)、危險(xiǎn)區(qū)總面積 (area at risk, AAR)和梗死區(qū)面積(infarct area, INF)之間的關(guān)系為(請(qǐng)發(fā)明人改變描述方式，避免使用顏色作表述)危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV，%)=(危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室面積)X 100%,心梗面積(INF/AAR, %)=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)X 100%。同時(shí)又檢測(cè)了注射miRNA-361反義核苷酸對(duì)I/R所誘導(dǎo)的凋亡的影響，用TUNEL試劑盒(購(gòu)自Sigma公司)，按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3B所示，miRNA-361反義核苷酸能減小I/ R所誘導(dǎo)的凋亡。
實(shí)驗(yàn)例4抑制內(nèi)源性的miRNA-361能降低缺血再灌注所致心功能失調(diào)。
此實(shí)驗(yàn)所用的miRNA-361的抑制劑均為經(jīng)過(guò)修飾的miRNA-361反義核苷酸，修飾方式為對(duì)miRNA-361反義核苷酸的每個(gè)堿基都進(jìn)行了 2,-甲氧基修飾用以增加miRNA-361 反義核苷酸在體內(nèi)的穩(wěn)定性。反義核苷酸的修飾及合成都是由上海吉瑪公司完成的。
將實(shí)驗(yàn)小鼠分成4組，每組6只小鼠。向各組別小鼠注射miRNA-361的抑制劑(注射量為30mg/kg/天)，用以抑制內(nèi)源性的miRNA-361，3天后進(jìn)行心臟缺血再灌注手術(shù)，以每只小鼠的注射量為30mg/kg/天的miRNA-361反義核苷酸陰性對(duì)照(的I/R組作為陰性對(duì)照組(NC) (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2’-甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成)，再灌注一周后進(jìn)行超聲心動(dòng)的功能檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)、和短軸截短率(FS)，結(jié)果如圖4所示，miRNA-361的抑制劑能夠減小缺血再灌注引起的心臟功能的損傷。
權(quán)利要求
1.一種單鏈非編碼miRNA-361反義核苷酸在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361反義核苷酸的序列為下述SEQID NO: 2所示的核苷酸序列5，-⑶ACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述miRNA-361反義核苷酸的核苷酸序列在每個(gè)堿基均進(jìn)行了 2’ -甲氧基修飾。
3.按照權(quán)利要求I或2所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
4.一種預(yù)防或治療心臟疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效劑量的權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)中所述的miRNA-361反義核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料，優(yōu)選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種，還優(yōu)選地，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或直接心肌注射。
5.根據(jù)權(quán)利要3或4所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病的藥物中的用途。
6.一種單鏈非編碼miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，所述miRNA-361核苷酸的序列為下述SEQID NO: I所示的核苷酸序列5， -UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
7.按照權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
8.一種用于診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效劑量的權(quán)利要求6或7中所述的miRNA-361核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物組合物在用于制備診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種miRNA-361及其反義核苷酸的用途，具體為所述miRNA-361反義核苷酸序列在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預(yù)后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。本發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明miRNA-361反義核苷酸在心肌缺血損傷及心肌細(xì)胞凋亡中的變化及其心肌保護(hù)作用。本發(fā)明所述的miRNA-361反義核苷酸具有抑制心肌缺血損傷及抑制心肌細(xì)胞凋亡的功能。miRNA-361反義核苷酸可以作為一種新型的藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)于由心肌缺血引起的心肌纖維化、冠心病及心衰等心臟疾病的預(yù)防及治療在臨床上具有重要意義。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102921021SQ20121048700
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者李培峰, 王昆 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所