專利名稱：miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開(kāi)了一種小分子非編碼RNA的用途，尤其涉及一種小分子非編碼RNA即miR-296-3p在制備腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostate cancer, Pca)是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，發(fā)病隨年齡而增長(zhǎng)，其發(fā)病隱匿，生長(zhǎng)緩慢，病因復(fù)雜，給臨床的早期診斷帶來(lái)很大的障礙。前列腺癌容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移，是引起前列腺癌患者死亡的主要原因，也一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。前列腺癌的常用治療手段主要有內(nèi)分泌治療、手術(shù)治療，化療和放療。 比較新的免疫治療和基因治療也有巨大應(yīng)用潛力。近年來(lái)不斷有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA在腫瘤診斷和治療中的重要作用，前列腺癌特異性miRNA的發(fā)現(xiàn)為其診斷和治療打開(kāi)了一個(gè)全新的局面。microRNA是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNAs，結(jié)構(gòu)高度保守，具有表達(dá)時(shí)序性和組織特異性，通過(guò)與靶基因3’非編碼區(qū)(3’ UTR)互補(bǔ)序列特異性結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或者mRNA降解，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[I]。microRNA在惡性腫瘤中表達(dá)譜各異并發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，隨著大規(guī)模、高通量miRNA檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預(yù)后提供了頗具價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為尋找新的腫瘤生物治療靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)[2]。研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中存在miRNA表達(dá)譜差異，它們的表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，而常規(guī)的mRNA標(biāo)志物不具備此特點(diǎn)。Kati PP, Minja JP等[3]檢測(cè)了前列腺組織和細(xì)胞中319種miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)位于染色體缺失區(qū)域的miRNA低表達(dá)，而位于擴(kuò)增區(qū)的miRNA高表達(dá)，它們通過(guò)靶向一些腫瘤相關(guān)基因如RAS、BCL2等最終影響前列腺腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。Annika Schaefer,Monika Jung等[4]采用微陣列技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了 155例前列腺癌病人組織中miRNA的表達(dá)譜，結(jié)合臨床病例數(shù)據(jù)，通過(guò)ROC分析發(fā)現(xiàn)了可以作為診斷標(biāo)志物的miR-205 ;而在Kaplan-Meier分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析之后，發(fā)現(xiàn)了可以作為預(yù)后診斷標(biāo)志物的miR-96。首次報(bào)道與臨床前列腺癌療效和轉(zhuǎn)移相關(guān)的單個(gè)miRNA是miR-221 [5]。Martin Spahn, Susanne Kneitz等在分析了不同類型的臨床標(biāo)本之后發(fā)現(xiàn)98%的前列腺癌組織中都伴隨有miR-221的特征性表達(dá)下調(diào)。根據(jù)Gleason評(píng)分或腫瘤分期和復(fù)發(fā)率，miR-221表達(dá)的進(jìn)行性降低和高危腫瘤以及不良預(yù)后密切相關(guān)。而且miR-221的表達(dá)下調(diào)是前列腺癌特異性的，屬于轉(zhuǎn)移過(guò)程中的頻發(fā)事件。進(jìn)一步的研究表明其可能的作用機(jī)制與c-kit致癌基因有關(guān)。基于前列腺癌中miR表達(dá)譜差異的一系列研究為后續(xù)的功能分析提供了豐富的證據(jù)，也為臨床診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)以及尋找新的高危前列腺癌治療靶標(biāo)開(kāi)辟思路。P69和M12屬于前列腺癌同源細(xì)胞系，P69來(lái)源于SV40T永生化的人非致瘤性前列腺上皮細(xì)胞[6]。隨后通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)和在體篩選，得到了具有局部侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力的M12細(xì)胞。二者的遺傳背景一致，但是致瘤能力和轉(zhuǎn)移潛能差異很大，是研究前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的理想模型。有關(guān)miR-296的研究報(bào)道還比較少，Thomas等報(bào)道m(xù)iR-296能夠直接調(diào)控HGSmRNA有效促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生[7] ；miR-296能夠下調(diào)p21WAF1表達(dá)，改變p53_p21WAF1通路從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[8]?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)所報(bào)道的miR-296多為miR-296_5p，對(duì)miR-296_3p的研究目前僅有6篇報(bào)道[9-14]，其中一篇主要針對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的藥物抵抗性[9]，其他研究主要集中在miR-296-3p與其它miRNA共同調(diào)節(jié)某個(gè)或某些基因的表達(dá)[10]，鮮有miR-296_3p對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移相關(guān)功能的研究。我們的研究聚焦在miR-296-3p對(duì)于前列腺癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移，對(duì)于腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的治療具有重大意義。我們以非轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系P69和高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系M12兩個(gè)細(xì)胞系為主要研究模型進(jìn)行研究。參考文獻(xiàn) I.Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role incancer[J]. Nat Rev Cancer，2006，6(4):259-269。2. Lu Jj Getz G. Microrna expression profiles classify human cancers[J].Nature, 2005，435:834-838。3.Porkka KP, Pfeiffer MJj Waltering KKj et al. Microrna expressionprofilingin prostate cancer[J]. Cancer Res，2007，67(13):6130-5。4. Schaef er A，Jung MjMoll enkopf HJj et al. Diagnostic andprognosticimpIications of microrna profiling in prostate carcinoma[J]. Int JCancer, 2010，126(5) : 1166-76。5. Spahn Mj Kneitz Sj Scholz CJj et al. Expression of microrna-221isprogressively reduced in aggressive prostate cancer and metastasis andpredictsclinical recurrence[J]. Int J Cancer，2010，127(2):394-403。6. Bae VLj Jackson-Cook CKj Maygarden SJj et al. Metastatic sublines ofansv40 large t antigen immortalized human prostate epithelial cell line[J].Prostate, 1998，34(4) : 275-82。7. ThomasWu ** rdinger, BakhosA. Tannous, OkaySaydamj et al. miR-296regulatesgrowth factor receptor overexpressionin angiogenic endothelial cells[J]. CancerCell;2008, 14:382 - 393。8.A-rumYoon,RanGaoj ZeeniaKaul et al MicroRNA-296 is enriched incancercells and downregulates p2IWAFl mRNA expression via interaction with its3’ untranslatedregion[J]· Nucleic Acids Research，2011，1-14。9.MiR_296_3p regulates cell growth and multi-drug resistance ofhumanglioblastoma by targeting ether-a -go-go (EAGl)[J]. European Journal ofCancer(In press)010. A TSH-CREBI-microRNA loop is required for thyroid cell growth[J].Molecular Endocrinology 2011，25 (10):1819-1830。11. MicroRNA signatures associated with immortalization ofEBV-transformedlymphoblastoid cell lines and their clinical traits[J]. CellProliferation 2011，44，59-66。12. Differential genomic imprinting and expression of imprintedmicroRNAsin testes-derived male germ-line stem cells in mouse[J]. Plos One2011，6(7)e22481。13.Expression profile of microRNAs and mRNAs in human placentasfrompregnancies complicated by preeclampsia and preterm labor [J].ReproductiveSciences 2011， 18(1)46-56。14. Improving murine embryonic stem cell differentiation intocardiomyocyteswith neuregulin-1: differential expression of microRNA [J]. American Journal ofPhysiology Cell Physiology 2011 7;301 (I):C21 - C30。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種與前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的小分子非編碼miR-296-3p及其反義寡核苷酸的用途。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了 miR-296_3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明亦提供了 anti-miR-296_3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。miR-296-3p能直接抑制E- I丐粘蛋白表達(dá),其反義寡核苷酸anti-miR-296_3p能有效抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。所述的miRNA及其反義寡核苷酸序列通過(guò)化學(xué)合成獲得或通過(guò)構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)獲得。所述的miRNA及其反義寡核苷酸序列為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或二者的混合，這些序列可以經(jīng)過(guò)任意修飾，如3’或5’端連接DIG 或 biotin 等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明采用全基因組深度測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系P69相比，高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系M12中miR-296-3p高表達(dá)而E-鈣粘蛋白低表達(dá)，Western blot和real-time PCR等方法也驗(yàn)證了上述結(jié)果。miR-296_3p通過(guò)作用于其靶基因E-鈣粘蛋白使其降解從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移侵襲。過(guò)表達(dá)miR-296-3p后，E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞間的粘附減弱，遷移侵襲能力增強(qiáng)。因此，檢測(cè)miRNA-296-3p和E-鈣粘蛋白的表達(dá)，可以對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行診斷和病理分級(jí)，對(duì)其轉(zhuǎn)移和預(yù)后做出評(píng)價(jià)，提出了 miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。圍繞miR-296-3p靶向E-鈣粘蛋白的特點(diǎn)可以設(shè)計(jì)腫瘤轉(zhuǎn)移干預(yù)策略，提出了anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域有重大實(shí)際意義和巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖I為前列腺癌細(xì)胞系P69和M12的遷移能力和形態(tài)學(xué)差異比較A為羅氏x(chóng)CELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞遷移能力時(shí)P69和M12的動(dòng)力學(xué)曲線(P69-紅，M12-綠)；B為光鏡下3D培養(yǎng)基質(zhì)中P69和M12的形態(tài)；C為激光掃描共聚焦顯微鏡觀察3D培養(yǎng)基質(zhì)中P69和M12的形態(tài)(紅-Vimentin，綠-E-cadherin,藍(lán)-DAPI)；D為P69和M12中miR-296_3p和E-鈣粘蛋白的數(shù)字基因測(cè)序結(jié)果；E為計(jì)算機(jī)序列比對(duì)分析顯示miR-296_3p與E-鈣粘蛋白3’ UTR區(qū)的結(jié)合；F為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P69和M12中miR-296_3p的水平；G蛋白免疫印跡檢測(cè)P69和M12中E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平(actin為內(nèi)參)。圖2為miR-296_3p直接靶向E-鈣粘蛋白A為實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中miR-296_3p是否過(guò)表達(dá)；
B為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-296_3p過(guò)表達(dá)之后E-鈣粘蛋白編碼基因⑶HlmRNA水平的變化；C為蛋白免疫印跡分析miR-296_3p過(guò)表達(dá)之后E-鈣粘蛋白表達(dá)水平的變化；D為流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞系P69-Ctrl和P69-miR-296_3p中E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平；E為瓊脂糖凝膠分析M12細(xì)胞中miR-296-3p表達(dá)下調(diào)之后E-鈣粘蛋白編碼基因CDHl mRNA水平的變化；F實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析M12細(xì)胞中miR-296_3p表達(dá)下調(diào)之后E-鈣粘蛋白編碼基因CDHl mRNA水平的變化；G E-鈣粘蛋白3’ UTR結(jié)構(gòu)示意圖(紅色代表miR-296_3p可能的結(jié)合位點(diǎn))；H雙熒光素報(bào)告基因分析Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-296_3p后熒光素酶活性的變化；圖3miR-296_3p通過(guò)下調(diào)E-鈣粘蛋白促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲遷移A、B為RT-CA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miR-296_3p過(guò)表達(dá)及E-鈣粘蛋白回復(fù)之后P69細(xì)胞遷移侵襲能力的變化；C =RT-CA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miR-296_3p過(guò)表達(dá)之后P69細(xì)胞遷移侵襲能力的變化。圖4為anti-miR-296_3p抑制了高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外遷移侵襲活性和克隆形成能力A為RT-CA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miR-296_3p表達(dá)下調(diào)之后M12細(xì)胞遷移能力的變化；B為過(guò)表達(dá)E-鈣粘蛋白后RT-CA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)M12細(xì)胞遷移能力的變化；C為短時(shí)(0h，48h)生物發(fā)光成像分析miR-296-3p表達(dá)下調(diào)之后高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系M12轉(zhuǎn)移能力的變化；D為長(zhǎng)時(shí)(4周)生物發(fā)光成像分析miR-296-3p表達(dá)下調(diào)之后高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系M12轉(zhuǎn)移能力的變化；E裸鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶HE染色分析；F軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-296_3p表達(dá)下調(diào)之后M12錨定非依賴性生長(zhǎng)能力的變化。培養(yǎng)2周后克隆大小的變化；G結(jié)晶紫染色之后定量分析克隆數(shù)目的變化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I. P69和M12的遷移能力和形態(tài)學(xué)差異及miR-296_3p在兩種細(xì)胞中的差異性表達(dá)I.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Migration)(I)組裝 CIM-16 :lower chamber 分兩組，對(duì)照組每孔加入 160ul SFM(serumfreemedium),血清誘導(dǎo)組每孔加入160ul全培基(5%FBS) ；upper chamber每孔加入30_50ulSFM ；(2)平衡CM-16放入37° C培養(yǎng)箱平衡Ih ；
(3)檢測(cè)背景RT_CADP Analyzer 檢測(cè) CM-16 的基礎(chǔ)值； (4)準(zhǔn)備細(xì)胞細(xì)胞饑餓6_8h后，0. 05%Typsin消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為4 XlOVml，備用；(5)種板upper chamber每孔加入IOOul單細(xì)胞懸液,室溫平衡30min ；(6)測(cè)定CM-16放入RT-CA DP Analyzer，啟動(dòng)實(shí)時(shí)測(cè)定程序，15min間隔一次，24h后停止；(7)數(shù)據(jù)分析=RT-CA分析細(xì)胞指數(shù)Cl (cell index)，細(xì)胞陽(yáng)性遷移結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是Cl 彡 0. 2。如圖I-A所示，M12細(xì)胞的實(shí)時(shí)遷移曲線高于P69細(xì)胞，P69細(xì)胞處于基線，遷移不明顯。該結(jié)果說(shuō)明，M12細(xì)胞具有高遷移的特性，P69細(xì)胞具有低遷移特性。2.三維細(xì)胞培養(yǎng)(3 dimensional cell culture, 3D culture)(I)解凍3D基質(zhì)膠，4° C置冰盒內(nèi)過(guò)夜；(2)冰上操作，48孔板每孔加入250ul基質(zhì)膠，37° C孵育30min促進(jìn)膠凝；同時(shí)配制 2%Assay Media (2ml matrix+98ml medium),4° C 保存一周或-20。C 長(zhǎng)期保存；(3)37° C溫育Assay Media作為細(xì)胞稀釋液；(4)單層貼壁細(xì)胞消化后用24ml Assay Media重懸制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整密度至IX 104/ml，48孔板每孔加入500ul細(xì)胞懸液；(5)倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和結(jié)構(gòu)變化，每隔4天換液一次；(6)根據(jù)不同細(xì)胞系的特點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)至預(yù)期的程度時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)，準(zhǔn)備后續(xù)的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)分析。(7)結(jié)果分析倒置熒光顯微鏡拍照保存。如圖1B\C，分別為光鏡下和熒光顯微鏡下3D培養(yǎng)P69和M12細(xì)胞形態(tài)，彩色圖片為熒光免疫組織化學(xué)染色。(紅-Vimentin,綠-E_cadherin，藍(lán)-DAPI)。該結(jié)果說(shuō)明，M12細(xì)胞較P69細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲能力，3D培養(yǎng)P69細(xì)胞呈圓團(tuán)狀生長(zhǎng)，而M12細(xì)胞則呈散亂的星形出芽生長(zhǎng)，向周圍遷移，具有明顯的局部侵襲特性。3.總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR3. I細(xì)胞總RNA的提取(I)Trizol 裂解細(xì)胞lml/O10 皿，室溫靜置 5min ；(2)裂解液轉(zhuǎn)移至I. 5mlEP管，每暈升加入200 ii I氯仿，用力振搖15s,室溫靜置2-3min，然后 12000g 4。C 離心 15min ；(3)小心吸取上層水相(含RNA)至新的I. 5ml EP管，加入500 μ I的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置IOmin, 12000g 4。C離心15min ；(4)去上清，75%乙醇(RNase free水配制)洗滌沉淀，手輕彈管底使白色沉淀漂浮，重復(fù)洗滌一次，8000g 4° C離心IOmin ；(5)去上清，吸水紙上扣干EP管，通風(fēng)櫥中干燥數(shù)分鐘；(6) RNA沉淀溶于20-100 μ I水中，充分溶解，NanoDrop2000測(cè)定濃度，并稀釋至相同濃度(I μ g/μ I)。 3. 2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(I)處理基因組DNA : 10 μ I的處理體系。RNA 模板(I μ g/ μ I)、10XReaction Buffer with MgCl2、DNase I 各 I μ I,RNasefree 水補(bǔ)至 10 μ 1，混勻后，37。C 30min ;然后加入 I μ I 50mM EDTA,65° C IOmin,滅活殘余的DNase I。(2) cDNA 合成Fermentas 體系表I
試齊Ij_fflS_
RNA 模板(I pg)11 μ 5 X AM V RT buffer4μ1
dNTP Mix, 10 mM each2μ1
RiboLock1·' RNase Inhibitor0.5 μ (20 u)
01igo(dT)i s primer or0.5 (ug (100 pmol)
Random hexamer primer or0.2 μ I (100 pmol)Gene-specific primer15-20 pmol
AMV Reverse Transcriptase0.5 μ I (10 u)
Total Volume20Lii
t上述20μ I反應(yīng)體系，混勻后離心，若使用Oligo (dT) 18primer orGene-specificprimer,程序設(shè)置為 50。C 60min,85。C 5min ;若使用 Random hexamerprimer,程序設(shè)置為 25° C 10min,50° C 60min,85° C 5min。3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(I)反應(yīng)體系按如下表格配制表 2ComponentVolumef.Lil) for I reaction
Master Mix(2x)5.0
Forward Primer0.5Reverse Primer0.5 Sample(IOx)1.0 DEPC H2O3.0 Total Volume10 0(2)根據(jù)AB公司St印One PCR擴(kuò)增儀操作說(shuō)明設(shè)置程序參數(shù)，具體條件如下Holding Stage :95。C IOmin ；Cycling Stage :95。C 15s,60° C 30s,72° C 30s(40cycle) ；Melt Curve Stage :95° C 15s,60° C lmin,95° C 15s。3. 4數(shù)據(jù)處理熒光定量PCR定量檢測(cè)所得miRNA的5 CT值，采用Excel 2003數(shù)據(jù)分析工具，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEVX 0. 5，認(rèn)為結(jié)果可靠。如圖1F，為實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，顯示P69和M12細(xì)胞中miR-296-3p的表達(dá)水平差異，M12細(xì)胞較P69細(xì)胞高I. 5倍。4免疫印跡分析4. I細(xì)胞總蛋白的抽提(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁細(xì)胞，70%生長(zhǎng)密度，移除舊的培養(yǎng)液，使用IXPBS洗滌2次；(2)每 6cm 培養(yǎng)皿細(xì)胞加 SDS 裂解緩沖液(62. 5mM Tris, 2%SDS, pH=6. 8) 50ul，室溫靜置2-3min，細(xì)胞刮刮下，轉(zhuǎn)移至I. 5ml EP管，100° C水浴IOmin ；(3)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理細(xì)胞裂解液，20kHz，30s X 3 ；(4) 13000rpm,室溫離心15min,轉(zhuǎn)移上清至新的I. 5ml EP管；(5)NanoDrop2000測(cè)定蛋白濃度，立即上樣或?qū)悠繁４嬗?20° C備用。4.2蛋白免疫印跡(I)制膠①將I. 5mm厚的制膠用的玻板洗凈后，晾干備用；②將玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，卡在架子上準(zhǔn)備灌膠(操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊以免漏膠)；③按下表配置12%和8%的分離膠及5%的濃縮膠；表3分離膠及濃縮膠配方
權(quán)利要求
1.miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。
2.anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了miR-296-3p在制備腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移診斷試劑盒中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-296-3p通過(guò)作用于其靶基因CDH1，使其轉(zhuǎn)錄受抑制或降解，使E-鈣粘蛋白表達(dá)下降，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移侵襲。過(guò)表達(dá)miR-296-3p后，E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞間的粘附減弱，遷移侵襲能力增強(qiáng)。因此，檢測(cè)miRNA-296-3p和E-鈣粘蛋白的表達(dá)，可以對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行診斷和病理分級(jí)，對(duì)其轉(zhuǎn)移和預(yù)后做出評(píng)價(jià)。圍繞miR-296-3p靶向E-鈣粘蛋白的特點(diǎn)可以設(shè)計(jì)腫瘤轉(zhuǎn)移干預(yù)策略，提出了anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域有重大實(shí)際意義和巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102965439SQ20121049167
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者余健秀, 閆潔, 黃建, 王艷麗 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院