專利名稱：紫丹參乙素的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥用成分和抗血管新生化合物領(lǐng)域，特別涉及從中藥甘西鼠尾草{Salvia przewalskii Maxim)中分離得到的紫丹參乙素在制備抗腫瘤及抑制血管異常新生藥物中的用途。
背景技術(shù)：
近年來癌癥的發(fā)病率和死亡率急劇上升，已成為威脅人類健康和生命的第一殺手。目前癌癥的治療手段主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療，但因?yàn)檫@些治療手段表現(xiàn)出的局限性以及缺乏特異性，導(dǎo)致上述手段在癌癥治療運(yùn)用方面受到較大程度的限制。因此尋找一類對癌細(xì)胞有特異性殺傷作用且副作用小的抗腫瘤藥物成為當(dāng)下醫(yī)藥領(lǐng)域·的研究熱點(diǎn)。近年來由于抑制腫瘤血管新生成為治療癌癥的新靶點(diǎn)，所以血管新生抑制劑有潛力成為特異性強(qiáng)、毒副作用小的一類新型抗癌藥，因此從天然產(chǎn)物中尋找新的有血管新生抑制作用的化合物在癌癥治療方面具有較大前景。甘西鼠尾草przewalskii Maxim)為唇形科鼠尾草屬植物,是我國廣泛使用的中草藥，民間多用其根入藥，即藏藥紅秦艽；四川以其作為秦艽的代用品，云南被廣泛用作丹參(Sahia miltiorrhiza Bunge)的替代物。其主要成分與丹參類似,主要為丹參醌類及丹酚酸類化合物。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了幾種丹參醌類化合物具有擴(kuò)冠、消炎、抗血小板凝聚等作用，近年來又有一些新的藥理活性如抗腫瘤、消除自由基等活性。從甘西鼠尾草中分離得到的紫丹參乙素為二萜醌類化合物，目前尚未發(fā)現(xiàn)該化合物活性方面的相關(guān)研究，所以該化合物在抗腫瘤及血管新生抑制作用方面的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫丹參乙素的新醫(yī)藥用途，即紫丹參乙素在制備抗腫瘤血管異常新生藥物中的應(yīng)用，即制備以抑制血管新生為治療途徑的抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中所述紫丹參乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
.I r
χ_ η
Y T
本發(fā)明中所述紫丹參乙素作為抗腫瘤血管異常新生藥物的主要活性成分制成藥物，作為血管新生抑制劑來治療癌癥。本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進(jìn)劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、色素和甜味劑等。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成丸齊 、粉劑、片齊IJ、粒劑、口服液和注射液等多種形式。本發(fā)明中所使用的紫丹參乙素是從中藥材甘西鼠尾草中分離得到的單體化合物，實(shí)驗(yàn)采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮和硅膠等低廉、常見的試劑提取分離，實(shí)驗(yàn)方法簡單可靠，成本低，效率高，可進(jìn)行工業(yè)化生長，有利于推廣應(yīng)用。本發(fā)明利用人肝癌細(xì)胞株H印G-2，通過MTT實(shí)驗(yàn)來測試紫丹參乙素對腫瘤細(xì)胞 的增殖影響，結(jié)果顯示經(jīng)紫丹參乙素處理的人肝癌細(xì)胞(IfepG-2)，在加藥濃度為5. O、10. Omg/L時與不加藥對照組比較，細(xì)胞增殖活性有明顯下降，說明紫丹參乙素能夠有效的抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本發(fā)明采用雞胚尿囊膜(CAM)模型來進(jìn)行抑制血管新生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度(10、15 mg/L)紫丹參乙素處理的雞胚尿囊膜與空白對照組比較，其血管新生受到明顯的抑制，因此可以說明紫丹參乙素具有明顯的血管新生抑制作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明紫丹參乙素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制血管的異常新生，所以紫丹參乙素可作為一種有效的抗腫瘤劑和抗血管異常新生藥物，且療效好，安全性高，適于實(shí)際推廣利用。


圖I為本發(fā)明從甘西鼠尾草中分離得到紫丹參乙素的工藝流程示意圖。圖2為本發(fā)明不同濃度紫丹參乙素對腫瘤細(xì)胞(HepG-2)作用后MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖3為本發(fā)明不同濃度紫丹參乙素對H印G-2細(xì)胞株增殖影響的抑制率結(jié)果比較示意圖。圖4為本發(fā)明紫丹參乙素作用于雞胚尿囊膜，經(jīng)IPP圖像處理軟件處理后抑制血管生長的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖5為本發(fā)明雞胚尿囊膜經(jīng)不同濃度的紫丹參乙素給藥后，其所對應(yīng)的血管生長面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但在本發(fā)明的的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例，實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例I :紫丹參乙素的制備(下述實(shí)施例中使用的紫丹參乙素是采用如下方法制備得到的)
干燥甘西鼠尾草(全草)7. 3 kg，粉碎過60目篩，用100%丙酮(每次20 L)室溫下超聲提取5次，提取液減壓濃縮得粗浸膏300 g ;將所得到的粗浸膏上正相硅膠(8(Γ100目，青島海洋化工)柱(干法上樣)，依次用純石油醚、石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚乙酸乙酯為9:1、3:1、I: I、3:7 )洗脫，收集各部分洗脫液，減壓濃縮，濃縮液分開轉(zhuǎn)移至10 mL青霉素瓶中，用TLC進(jìn)行檢測，將成分大致相同的餾分進(jìn)行合并；對石油醚乙酸乙酯=1:1洗脫液洗脫部分(52 g)進(jìn)行分離，分離方法為正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯混合液(5:1、2:1、1:1、1:2)進(jìn)行洗脫，在石油醚乙酸乙酯為2:1的洗脫餾分中析出大量棕色針晶，吸出母液，然后對析出的大量棕色針晶進(jìn)行重結(jié)晶，即得到紫丹參乙素230 mg，其HPLC純度檢測結(jié)果為96. 782%，該化合物經(jīng)核磁共振檢測得到的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)《丹參有效化學(xué)成分的研究》中所述紫丹參乙素(przewaquinone B)的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)基本一致，1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)如下
1H-NMR (400 MHz, C5D5N) δ 9. 57 (1Η, d, / = 8.0 Hz, H—1), 7. 75 (1H, d, J=8. 8 Hz, H-2), 7. 49 (1H, d, / = 6. 8 Hz, H—3)，8. 25 (1H, d, / = 8. 4 Hz, H—6)，7.99 (1H, d, / = 8.8 Hz, H—7)，7. 25 (1H, s, H—16), 5. 21 (3H, s, Me-17), 2. 51(3H, s, Me-18). 13C-NMR (100 MHz, C5D5N) δ 128.4 (C-I), 132.55 (C_2)，130.33(C-3), 133. 70 (C-4), 132.77 (C_5)，130. 33 (C_6)，118.89 (C_7)，128.81 (C_8)，123.77 (C-9), 129.44 (C-IO), 182.97 (C-Il), 175.33 (C-12), 119.67 (C-13),160.89 (C-14), 124.83 (C-15), 142.67 (C-16), 55. 74 (C-17), 19.45 (C-18)。根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)，確定該化合物即為紫丹參乙素。實(shí)施例2 :紫丹參乙素體外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)
按常規(guī)MTT實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行，取對數(shù)期的人肝癌細(xì)胞株H印G-2，接種于96孔板上，接種量大約為每孔3000個細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)24 h后，設(shè)6個不同濃度(O. 1、0. 5、I. 0、2. 5、5. O、10mg/L)的紫丹參乙素給藥組和空白對照組，每個濃度的藥物各加入5個孔中，37 °C培養(yǎng)72h，加入MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)，每孔20 μ L，繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入150 yLDMSO，震蕩I h，于酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度OD值。(見圖2)
結(jié)果顯示紫丹參乙素加藥濃度為5. O mg/L和10 mg/L時腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯下降。圖中顯示，在紫丹參乙素濃度為2. 5 mg/L,5 mg/LUO mg/L時，該化合物對于細(xì)胞的抑制率顯著提高(抑制率=1-加藥組OD值/空白對照組OD值)。(見圖3)
實(shí)施例3 :紫丹參乙素體內(nèi)抗血管新生作用實(shí)驗(yàn)
取新鮮種雞蛋在溫度為37. 8°C, CO2濃度為5%，濕度適宜的條件下孵育7天，然后在氣室端開窗(1X1 Cm),用直徑為6 mm的無菌濾紙片作為給藥載體,用移液槍精確吸取40 μ L的紫丹參乙素藥液滴于無菌濾紙片上，待濾紙片揮干，然后將濾紙片放置于雞胚尿囊膜上，給藥組設(shè)置3個濃度(5 mg/LUO mg/LU5 mg/L)，并設(shè)置空白對照組(生理鹽水組)和陽性對照藥組(地塞米松組)，其中空白對照組和陽性對照組給藥方法與上述方法一致，在完成給藥操作后，用無菌透明膠帶封窗，將雞蛋在上述條件下繼續(xù)孵育48 h，取下尿囊膜組織，將其放入脫水液(甲醇丙酮=1:1)中脫水固定15 min處理后，對尿囊膜組織表面血管用數(shù)碼相機(jī)微距拍照，用IPP圖像處理軟件對圖片中血管面積進(jìn)行計(jì)算。(見圖4-5)
圖4顯示加藥后，給藥濃度為10、15 mg/L相較于空白對照組，其尿囊膜新生血管受到明顯抑制。圖5顯示了經(jīng)面積計(jì)算后血管面積的柱狀圖，從圖中可以看出當(dāng)給藥濃度為10. O、15. O mg/L，血管面積較生理鹽水組明顯降低。
權(quán)利要求
1.紫丹參こ素在制備抗腫瘤血管異常新生藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化合物紫丹參乙素在制備抗腫瘤血管異常新生藥物中的應(yīng)用，MTT實(shí)驗(yàn)證明，紫丹參乙素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在加藥濃度為5.0、10.0mg/L時細(xì)胞增殖活性有明顯下降；雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)顯示，濃度為10mg/L和15mg/L的紫丹參乙素對雞胚尿囊膜的新生血管有較為明顯的抑制作用，因此紫丹參乙素可以用于制備抗腫瘤血管異常新生的藥物，且療效好，安全性高，適于實(shí)際推廣利用。
文檔編號A61P35/00GK102949386SQ20121049385
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者李寶才, 莊文婷, 朱路平, 李鵬, 向誠, 何靜, 秦誼, 戴偉鋒, 張敉 申請人:昆明理工大學(xué)