專利名稱：丹酚酸b在制備用于三氧化二砷誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)及協(xié)同抗腫瘤作用藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種藥用活性成分在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及在丹酚酸B制備藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三氧化二砷(As2O3)是目前治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)最有效的藥物之一，被美國NCCN確定為APL復(fù)發(fā)的首選用藥。近年來三氧化二砷不單治療白血病，而且在淋巴瘤、骨髓瘤等惡性腫瘤的治療研究方面也取得了一些成果。雖然常規(guī)治療劑量的砷劑相對安全，但在臨床應(yīng)用中仍常出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，特別是心臟毒性反應(yīng)，限制了 As2O3在臨床的廣泛使用。目前三氧化二砷引起心臟毒性的研究，國內(nèi)外雖均有文獻(xiàn)報道，但多為小樣本資料，少有大宗臨床研究。國外報道用神劑治療白血病心臟毒性發(fā)生率聞達(dá)92.9%，甚至100%。三氧化二砷引起的心臟毒性主要為心電圖改變，50%以上患者可引起Q-T間期延長，其他表現(xiàn)有竇性心動過速、非特異性ST-T變化和心動過速。最常見的急性合并癥還有液體潴留(心包、胸腔積液)。此外，重者在治療中會出現(xiàn)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速，完全性房室傳導(dǎo)阻滯或猝死等。目前對于As2O3化療過程中出現(xiàn)的心臟毒性尚無特異性療法，常規(guī)靜脈使用大劑量維生素C。丹參是一直以來被廣泛用于治療心血管疾病如心絞痛，心梗，中風(fēng)的傳統(tǒng)中藥丹酚酸B是丹參中最豐富并且具有生物活性的丹酚酸。已被證明具有重要的心血管保護(hù)作用。研究證明丹酚酸B具有抑制腫瘤增長作用，提示丹酚酸B與抗癌藥物聯(lián)用很可能在癌癥治療中發(fā)揮增效減毒的作用。通過系統(tǒng)研究丹酚酸B對三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及心臟毒性的保護(hù)作用及分子機制，丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)合用藥充分發(fā)揮二者的增效減毒作用，提高三氧化二·砷的臨床療效并降低其心臟毒性，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了丹酚酸B在制備用于心肌細(xì)胞保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；更具體地，本發(fā)明公開了丹酚酸B在制備用于三氧化二砷誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還公開了丹酚酸B和三氧化二砷聯(lián)合用于制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用；本發(fā)明公開了丹酚酸B在制備用于協(xié)同抗腫瘤作用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步公開了丹酚酸B在制備用于協(xié)同抗腫瘤藥物三氧化二砷中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的上述應(yīng)用，所述的丹酚酸B為藥物組合物，由丹酚酸B與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制成藥物組合物。本發(fā)明所述三氧化二砷誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)及協(xié)同抗腫瘤作用的藥物為丹酚酸B的藥物組合物，所述藥物組合物最小單元所含活性成分丹酹酸B的量為2.5-100mgo本發(fā)明所述的丹酚酸B藥物組合物為臨床上任何可接受的劑型形式，包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型。用于口服時，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選片劑和水針劑型。上述藥物組合物，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于口服制劑的藥用賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、表面活性劑、吸附載體等。上述藥物組合物，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于注射劑的藥用賦形劑，包括溶劑、抗氧劑、助溶劑、吸附劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑。藥物組合物最小單元是指一片，一顆膠囊，一袋顆粒或一支注射劑等。本發(fā)明劑型可使用藥物制劑工藝學(xué)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的慣常使用的任何方法產(chǎn)生并且對此沒有特別限制。例如，本發(fā)明片劑可通過使用本領(lǐng)域公知的合適的方法?；?、干燥和篩分主要藥劑和賦形劑、粘合劑等等，向所得混合物中加入潤滑劑等等然后混合并形成片劑。造粒可通過本領(lǐng)域公知的任何合適的方法進(jìn)行，例如濕法造粒、干法造?；蚣訜嵩炝?。合適的非限制性實例包括使用高速攪拌造粒機、流動造粒干燥機、擠壓造粒機或滾筒壓緊器進(jìn)行這些造粒方法。此外，例如干燥和篩分的方法可以根據(jù)進(jìn)行造粒的需要進(jìn)行。主要藥劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑等等的混合物還可直接形成片劑。如果需要薄膜包衣，可以使用本領(lǐng)域已知的任何薄膜包衣裝置，并且作為薄膜包衣基質(zhì)，合適的實例包括糖衣基、親水膜包衣基、腸溶薄膜包衣基和緩釋薄膜包衣基。


圖1丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)用對心臟功能的影響結(jié)果；正常組，As203組，As203+Sal B組和Sal B組小鼠給藥結(jié)束后分別對其進(jìn)行小動物心動超聲。通過M_mode成像分別對各組左室末端收縮直徑(LVDs)，左室末端舒張直徑(LVDd)，射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)進(jìn)行定量比較。圖2丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)用對心肌損傷的影響結(jié)果；分別對正常組，As203組，As203+Sal B組和Sal B組小鼠心臟組織進(jìn)行HE染色分析。圖3丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)用對血漿中心肌酶活性的影響結(jié)果；收集正常組，As203 組，As203+Sal B 組和 Sal B 組的血清，并對血清中 CK, LDH, GOT, CAT, SOD 和 GSH-Px的活性進(jìn)行測定。圖4三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型；MTT對細(xì)胞存活率測定。(A)三氧化二砷(OiiM to 10 PM)可以濃度依賴性的降低心肌細(xì)胞存活率。(B) SalB (0.1uM to IOyM)對心肌細(xì)胞存活沒有影響。圖5丹酚酸B對三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用；(A) Sal B可以濃度依賴性的提高三氧化二砷誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的下降。(B)LDH試劑盒測定Sal B對LDH水平的影響。(C)Hoechst 33342/PI熒光染色檢測細(xì)胞凋亡及壞死。(D)熒光測定法檢測Caspase-3活性。(E)熒光測定法檢測胞內(nèi)ROS水平。圖6丹酚酸B增強三氧化二砷對H印G2和HeLa腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用；MTT法分別檢測Sal B對HepG2和HeLa細(xì)胞存活率的影響。

圖1丹酚酸B增強三氧化二砷對S180腫瘤小鼠的抗腫瘤作用；將給藥結(jié)束后的小鼠取出腫瘤，并對其腫瘤重量進(jìn)行測定。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，不構(gòu)成對本發(fā)明的進(jìn)一步限制。實施例1丹酚酸B和三氧化二砷聯(lián)用對體內(nèi)心肌的保護(hù)作用實施例1.1體內(nèi)As2O3所誘導(dǎo)的小鼠心肌病模型建立6-8周鼠齡的ICR小鼠(北京維通利華，北京，中國)。動物適應(yīng)I周并且期間自由獲取食物和水。60只小鼠隨即分為4組:正常對照組(control);三氧化二砷單給藥組(As203);三氧化二砷與丹酚酸B聯(lián)合給藥組(As203+SalB);丹酚酸B單給藥組(Sal B)。所有處理均采用尾靜脈注射，每天注射一次，給藥兩周。control組小鼠被注射10ml/kg生理鹽水；As2O3組注射1.5mg/kg As2O3;As203+Sal B組先注射2mg/kg Sal B，I小時后注射1.5mg/kgAs203; Sal B 組注射 2mg/kg 的 Sal B.
實施例1.2小動物心臟超聲兩周后，將小鼠用三溴乙醇麻醉，將小鼠經(jīng)胸腔超聲心動超聲(visunlsonics,型號:VEV0770)檢測心 臟功能和結(jié)構(gòu)變化。為測定左心室收縮功能和心房直徑，后用帶有15-MHz探針的Acuson Sequoia C-256儀器進(jìn)行超聲心動圖分析。通過Miode成像定量左室末端收縮直徑(LVDs)，左室末端舒張直徑(LVDd)，射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)0結(jié)果如圖1所示，與正常組相比，三氧化二砷組射血分?jǐn)?shù)明顯下降，而聯(lián)合給藥組可以顯著上升。同樣，三氧化二砷組左室短軸縮短率明顯下降，而聯(lián)合給藥組可以顯著上升。然而，左室末端收縮和舒張直徑在各組間沒有顯著差異。實施例1.3形態(tài)學(xué)檢查兩周后，心動超聲后，用大劑量戊巴比妥納將小鼠全部致死，取心臟組織用4%的甲醛固定。5_的組織切片用蘇木精和曙紅染色。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果如圖2所示，正常組:組織結(jié)構(gòu)基本正常。As2O3組:大面積心肌纖維溶解斷裂，多量出血。As203+Sal B組:少量心肌纖維溶解斷裂。Sal B組:組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見少量出血點。實施例1.4血漿收集和生化檢測在水合氯醛麻醉下使用毛細(xì)管收集小鼠內(nèi)眥的血樣。血樣在采集后一小時內(nèi)在3053g下離心10分鐘，隨后血漿中LDH, GSH-PX, CAT, SOD, CK, GOT的活性根據(jù)廠商說明書，通過從Jiancheng Bio-engineering Institute (南京，中國)購買的商業(yè)檢測試劑盒來測定。結(jié)果如圖3所示，與三氧化二砷組相比，丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)用可以降低LDH, CAT, CK, GOT的活性，提高保護(hù)酶S0D，GSH-PX的活性。證明二者聯(lián)用具有保護(hù)三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌氧化損傷作用。實施例2:丹酚酸B對體外心肌細(xì)胞的保護(hù)作用實施例2.1三氧化二砷誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷模型大鼠心肌細(xì)胞H9C2 (胚胎期BDlX大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系)(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)在添加胎牛血清的達(dá)爾貝克改良的Eagle’ s培養(yǎng)基中，于37° C下5% CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)常地傳代并在實驗前繼代培養(yǎng)到90%的集合。細(xì)胞以1X104的密度接種于96孔板.三氧化二砷(0，2，4，6，8，IOumol)預(yù)處理24h后，每孔加入5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)并孵育4h.。棄上清，每孔加150 DMSO溶解，570nm酶標(biāo)儀(Spectrafluor, TECAN, Sunri se, Austria)檢測吸光度。結(jié)果如圖4A所示，三氧化二砷濃度依賴性的降低細(xì)胞存活率，其中三氧化二砷10 U mo I作用24h，細(xì)胞存活率為62.97%，確定為模型條件。實施例2.2丹酚酸B對H9c2心肌細(xì)胞的影響H9c2心肌細(xì)胞以I X IO4的密度接種于96孔板.丹酚酸B(0.1, I, 10 U g/ml)預(yù)處理12h后，每孔加入5mg/ml MTT (0.1mg/每孔)并孵育4h.。棄上清，每孔加150 u I DMSO溶解，570nm 酶標(biāo)儀(Spectraf luor, TECAN, Sunrise, Austria)檢測吸光度。結(jié)果如圖4B所示，丹酚酸B (0.1, I, 10 U g/ml)對心肌細(xì)胞無增殖及毒性作用。實施例2.3丹酚酸B對三氧化二砷誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用大鼠心肌細(xì)胞H9C2 (胚胎期BDlX大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系)以1X104的密度接種于96孔板.丹酹酸B(0.1, I, IOu g/ml)預(yù)處理12h后，三氧化二砷IOy M作用24h,之后每孔加入5mg/ml MTT (0.1mg/每孔)并孵育4h.。棄上清，每孔加150 u I DMSO溶解，570nm 酶標(biāo)儀(Spectrafluor, TECAN, Sunrise, Austria)檢測吸光度。結(jié)果如圖5A所示，丹酚酸B可以濃度依賴性的保護(hù)三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。其中丹酚酸B劑量IOy g/ml達(dá)到最大保護(hù)作用。實施例2.4 LDH釋放測定大鼠心肌細(xì)胞H9C2 (胚胎期B`DlX大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系)以3X IO5的密度接種于每孔。丹酚酸B (IOii g/ml)預(yù)處理12h后，三氧化二砷IOii M作用24h，，之后收集上清。LDH水平根據(jù)LDH試劑盒說明書測定。結(jié)果如圖5B所示，10 ii M ATO可以顯著提高LDH釋放。而加入10 u g/ml SalB預(yù)處理后，LDH活性可以顯著降低。LDH是細(xì)胞出現(xiàn)死亡的標(biāo)志，結(jié)果證明Sal B能夠保護(hù)ATO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。實施例2.5 Hoechst 33342/PI 染色利用Hoechst 33342/PI染色，并通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞死亡水平(Molecular Devices, USA)。H9c2 細(xì)胞于 96-孔板中培養(yǎng) 36 小時 丹酚酸 B (10 u g/ml)預(yù)處理12h后，三氧化二砷10 ii M作用24h，之后細(xì)胞于5mg/ml Hoechst 33342避光孵育15分鐘，并用PBS洗2次。PI (終濃度I U g/ml)加入細(xì)胞中，用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)獲取圖像，并用HCS軟件對其核大小和細(xì)胞膜滲透性進(jìn)行計算分析。結(jié)果如圖5C所示，通過高內(nèi)涵成像系統(tǒng)成像，正常組細(xì)胞被染成低藍(lán)色，三氧化二砷組可觀察到亮藍(lán)色熒光，并可看到呈PI陽性的紅色熒光，而丹酚酸B預(yù)處理組可以明顯改善三氧化二砷導(dǎo)致的形態(tài)變化。實施例2.6 CASPASE-3活性分析Caspase-3活性通過突光激活的caspase-3染色試劑盒(BioVision, CA, USA),按操作說明進(jìn)行測定。丹酹酸B (10 ii g/ml)預(yù)處理12h后,三氧化二砷10 ii M作用24h,之后300 u LdXlO6Cell s/mL)細(xì)胞液加入 I y LFITC-DEVD-FMK 底物在黑暗中 37° C 孵育 lh。熒光通過酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485nm和發(fā)射波長535nm下進(jìn)行測定。結(jié)果如圖 所示，10 ii M ATO可以提高caspase-3活性，而加入丹酚酸B后可以抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的caspase-3活化。實施例2.7 ROS產(chǎn)生測定ROS水平根據(jù)總ROS檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。丹酚酸B(10i! g/ml)預(yù)處理12h后，三氧化二砷IOii M作用24h，之后收集細(xì)胞并用IX洗液洗一次,之后用IOOy I的carboXy-H2DCFDA(終濃度25 u M)在黑暗中37° C孵育30min。熒光通過酶標(biāo)儀在激發(fā)波長495nm和發(fā)射波長529nm下進(jìn)行測定。結(jié)果如圖5E所示，與正常組相比，Sal B預(yù)處理可以降低ATO誘導(dǎo)的ROS釋放，而ATO處理組可以提高ROS水平。ROS產(chǎn)生會促使細(xì)胞損傷和凋亡進(jìn)程，結(jié)果證明Sal B能夠保護(hù)三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。實施例3丹酚酸B和三氧化二砷聯(lián)用對抗腫瘤作用的影響實施例3.1丹酚酸B聯(lián)合三氧化二砷對A549腫瘤細(xì)胞的影響實驗HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)和HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)分別以5 X IO3密度接種于96孔板，細(xì)胞分別用三氧化二砷(10 ii M)單獨處理，Sal B (IOu g/ml)單獨處理和二者聯(lián)用共同處理細(xì)胞48h，用MTT檢測細(xì)胞活力。如圖6所示，從圖6的結(jié)果可以看出丹酚酸B能夠顯著增強三氧化二砷誘導(dǎo)體外HepG2和HeLa細(xì)胞的生長抑制率。實施例3.2丹酚酸B聯(lián)合三氧化二砷對S180體內(nèi)腫瘤小鼠的影響實驗ICR小鼠皮下接種5 X106密度的S180細(xì)胞(小鼠肉瘤細(xì)胞)。24小時后，小鼠隨機分為4組,每組15只。(a) Control組中小鼠被注射10ml/kg生理鹽水；(b) As2O3組注射
1.5mg/kg As2O3; (c)As203+Sal B 組先注射 2mg/kg Sal B，I 小時后注射 1.5mg/kgAs203; (d)Sal B組注射2mg/kg的Sal B。均尾靜脈注射，每天注射一次，給藥兩周。兩周后，處死小鼠取出腫瘤，稱量腫瘤重量。結(jié)果如圖7所示，從圖7的結(jié)果可以看出丹酚酸B與三氧化二砷聯(lián)用能夠降低體內(nèi)S180腫瘤的重量。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.丹酚酸B在制備心肌細(xì)胞保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
2.丹酚酸B在制備用于三氧化二砷誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。
3.丹酚酸B在制備用于協(xié)同抗腫瘤作用藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的丹酚酸B在制備用于協(xié)同抗腫瘤作用藥物中的應(yīng)用，其中抗腫瘤藥物為三氧化二砷。
5.丹酚酸B和三氧化二砷聯(lián)合用于制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求f5任一所述的應(yīng)用，其中丹酚酸B為丹酚酸B的藥物組合物，是由丹酚酸B與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物最小單元所含活性成分楊梅苷的量為 2.5-100mg。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述的丹酚酸B藥物組合物為臨床上任何可接受的劑型形式。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的劑型形式包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型；用于口服時，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。
10.根據(jù)權(quán)要求6所述的應(yīng)用，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于口服制劑的藥用賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、表面活性劑、吸附載體等；也可選自適用于 注射劑的藥用賦形劑，包括溶劑、抗氧劑、助溶劑、吸附劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹酚酸B在制備用于三氧化二砷誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)及協(xié)同抗腫瘤作用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的丹酚酸B可以是丹酚酸B的藥物組合物，包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型。用于口服時，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選片劑和水針劑型。
文檔編號A61P35/00GK103230390SQ20121050157
公開日2013年8月7日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者孫曉波, 孫桂波, 王敏 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所