專利名稱：一種修飾組織工程支架的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種運(yùn)用分子組裝技術(shù)修飾組織工程支架的方法，和該方法獲得的組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物支架的制備是組織工程學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，理想的生物支架應(yīng)具備以下特性1.具有良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞的黏附并為細(xì)胞在其表面增殖提供適宜的微環(huán)境，在體外培養(yǎng)時(shí)無細(xì)胞毒性，植入體內(nèi)時(shí)不會(huì)引起機(jī)體炎癥和排斥反應(yīng)；2.具有三維立體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部互相貫通形成開放孔道結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供足夠的黏附空間，并利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的傳輸；3.具有生物可降解性，與細(xì)胞的增殖速度相匹配，且降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞繁殖無害，容易被機(jī)體代謝或吸收；4.可塑性強(qiáng)，方便構(gòu)建與需要再生、修復(fù)的組織器官相同的外形；5.具有與被移植組織器官相適應(yīng)的力學(xué)性能；6.方便消毒殺菌處理，且不影響材料的性質(zhì)。作為生物材料應(yīng)用的形式之一，水凝膠可定義為在水中溶脹并保持大量水分，可降解或不可降解的聚合物。由于水凝膠網(wǎng)絡(luò)中充斥有大量的水分，使得整個(gè)材料具備了一種流體的性質(zhì)，這與充盈有大量水分的機(jī)體組織極其相似，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出，柔軟濕潤(rùn)的表面以及組織親和力大大減少了材料對(duì)周圍組織的刺激性，使得水凝膠具有良好的生物相容性。水凝膠因其流動(dòng)性很容易充滿整個(gè)不規(guī)則的缺損部位，手術(shù)創(chuàng)傷非常微小且易于操作，最適合用于構(gòu)建力學(xué)強(qiáng)度較低的軟組織器官。用于制備水凝膠的材料有殼聚糖，海藻酸鹽，透明質(zhì)酸，聚乙烯醇等。其中，殼聚糖為甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，是天然多糖中唯一的堿性多糖，它由β_(1，4)糖苷單元連接組成，這些糖苷單元上還隨機(jī)地帶有N-乙?；Y(jié)構(gòu)，因而它具有糖胺多糖和透明質(zhì)酸的部分特點(diǎn)。殼聚糖在自然界廣泛存在，取材便利，生物相容性良好，可生物降解且降解產(chǎn)物無毒性。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，它們必須在適宜的基質(zhì)上貼附、鋪展才能正常代謝增殖和分化。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞黏附。細(xì)胞外基質(zhì)中有許多細(xì)胞受體識(shí)別的多肽和糖配體，此類受體、配體相互作用對(duì)維持細(xì)胞功能具有很重要的作用，同時(shí)還能賦予細(xì)胞環(huán)境的響應(yīng)性。細(xì)胞外基質(zhì)的首要功能是介導(dǎo)細(xì)胞黏附，大多數(shù)細(xì)胞缺乏黏附就會(huì)凋亡或死亡，而喪失黏附相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑會(huì)使癌性腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。通過表面修飾的方法可以在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中模擬細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)并調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和組織構(gòu)建。目前主要運(yùn)用等離子沉積(聚合)蝕刻、輻射接枝、濕化學(xué)反應(yīng)、吸附、光反應(yīng)、固定化等方法對(duì)支架材料表面改性，以改善支架材料的生物相容性，從納米到微米尺度上調(diào)控表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞行為或生物礦化，控制生物活性物質(zhì)的釋放速率，防止蛋白質(zhì)或細(xì)胞黏附和組織黏連等。這些方法存在諸如有機(jī)試劑殘留，過程復(fù)雜，成本過高等不足之處，限制了實(shí)際應(yīng)用。以濕化學(xué)反應(yīng)修飾組織工程支架材料為例，Boccafoschi等將聚乳酸(PLLA)支架置于乙醇/水溶液中部分水解酯基，然后通過EDC/NHS反應(yīng)在酸性MES溶液中活化支架中的羧基連接生物活性分子RGD中的氨基，其中RGD是細(xì)胞黏附蛋白纖維粘連蛋白(fibronectin)的重要片段，從而在支架材料表面修飾RGD以增強(qiáng)細(xì)胞在材料表面的黏附能力。(Boccafoschi F, Fusaro L, Mosca C，Bosetti M, Chevallier P, Mantovani
D,Cannas M.The biologicalresponse ofpoly (L-Iactide)fiIms modified bydifferent biomolecules: Role of thecoating strategy. J. Biomed. Mater. Res. PartA, 2012，100A, 2373-2381.)上述濕化學(xué)反應(yīng)修飾支架材料的缺點(diǎn)在于I.破壞生物活性分子的活性。EDC/NHS反應(yīng)在酸性MES溶液中進(jìn)行，pH=5. 6，此溶液中RGD分子上的活性位點(diǎn)可能減少。2.生物活性分子的選擇有限。在支架材料上修飾生物活性分子需要滿足EDC/NHS反應(yīng)的條件要求，即反應(yīng)物分子中必須含有羧酸或伯胺基。3.生物活性分子的含量無法控制。EDC/NHS反應(yīng)劇烈，無法精確控制連接R⑶分子的數(shù)量。反應(yīng)完成后支架材料不可以再次進(jìn)行EDC/NHS反應(yīng)連接RGD分子。層層組裝技術(shù)(Layer-by-Layer assembly technique, LbL)最初是基于聚電解質(zhì)所帶正負(fù)電荷間相互作用開發(fā)的一種超分子自組裝技術(shù)，而后拓展到氫鍵作用、疏水作用及生物分子間特異性識(shí)別作用等都可以作為層層自組裝膜的驅(qū)動(dòng)力，這大大延伸了此技術(shù)在生物材料制備及改性中的應(yīng)用潛力，組裝材料涉及功能性聚電解質(zhì)、生物活性分子、納米粒子、有機(jī)/無機(jī)微粒、細(xì)菌、病毒等。在組織工程領(lǐng)域，運(yùn)用層層組裝技術(shù)修飾支架材料具有如下優(yōu)勢(shì)1.組裝分子的選擇范圍廣泛，生物活性分子(如蛋白質(zhì)、多糖、DNA等)都含有分子間相互作用位點(diǎn)，合適的條件下可以用于組裝；2.制備工藝簡(jiǎn)單，通過簡(jiǎn)單的交替浸涂技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在分子水平上對(duì)支架結(jié)構(gòu)和功能的設(shè)計(jì)；3.制備條件溫和，可在常溫水溶液中進(jìn)行，從而保持生物分子的天然活性，不影響其物理化學(xué)性質(zhì)；4.適用的基體材料種類多，對(duì)基體材料的體型結(jié)構(gòu)適應(yīng)性強(qiáng)，并可在具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的裝置和材料上實(shí)現(xiàn)。通過層層組裝技術(shù)把細(xì)胞外基質(zhì)組分直接固定在材料表面，從而在材料表面覆蓋一層細(xì)胞外基質(zhì)，使材料的細(xì)胞相容性明顯提高,這類研究已成為細(xì)胞相容性材料研究中的熱點(diǎn)。采用人為的方式形成材料一細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合層，可通過選擇特定細(xì)胞外基質(zhì)(如促進(jìn)細(xì)胞黏附的透明質(zhì)酸、軟骨素、纖維粘連蛋白、膠原等)或類細(xì)胞外基質(zhì)，改善細(xì)胞在材料表面的黏附及生長(zhǎng)性能，是一種簡(jiǎn)單有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)組織工程支架表面修飾中存在的有機(jī)試劑殘留，過程復(fù)雜，成本過高等問題，本發(fā)明的目的在于運(yùn)用層層組裝技術(shù)修飾組織工程支架，提供一種簡(jiǎn)單實(shí)用，可控性強(qiáng)，清潔低成本的方法修飾組織工程支架。一種修飾組織工程支架的方法，包括如下步驟a.將組織工程支架浸于活性組分I水溶液中f 8小時(shí)；b.將完成步驟a的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分I ;c.將完成步驟b的組織工程支架浸于活性組分II水溶液中廣8小時(shí)；d.將完成步驟c的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分II ;e.重復(fù) a_d 步驟 η 次,O < η < 100。
其中，所述組織工程支架、活性組分I或活性組分II之間是通過靜電、氫鍵、范德華力、疏水作用、共價(jià)鍵、分子特異性識(shí)別作用中的至少一種作用力相互結(jié)合的。所述活性組分I和活性組分II可以根據(jù)所修飾組織工程支架表面分子的電荷、組成、化學(xué)鍵以及目標(biāo)組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分等因素選擇。優(yōu)選地，所述活性組分I在其水溶液中的質(zhì)量百分比為O. riwt. % ;所述活性組分II在其水溶液中的質(zhì)量百分比為O. riwt. %0進(jìn)一步地，所述活性組分I是軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、粘多糖、纖維粘連蛋白、層連蛋白中的至少一種；所述活性組分II是殼聚糖、賴氨酸、膠原中的至少一種。所述組織工程支架包括水凝膠支架，優(yōu)選地，所述組織工程支架是由凝膠組分通過交聯(lián)劑相互交聯(lián)獲得水凝膠支架。進(jìn)一步地，所述凝膠組分是殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、海藻酸鉀、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一種。進(jìn)一步地，所述交聯(lián)劑是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl3水溶液、CrCl3水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一種。本發(fā)明還提供由修飾組織工程支架方法獲得的一種組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，包括組織工程支架，所述組織工程支架外包覆有交替層疊的活性組分I及活性組分II。這種交替層疊結(jié)構(gòu)能減少或避免活性組分的流失，將活性組分固定在支架上。其中，所述組織工程支架、活性組分I或活性組分II之間是通過靜電，氫鍵，范德華力，疏水作用，共價(jià)鍵，分子特異性識(shí)別作用中的至少一種作用力結(jié)合的。進(jìn)一步地，所述活性組分I是軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、粘多糖、海藻酸鈉、纖維粘連蛋白、層連蛋白中的至少一種。進(jìn)一步地，所述活性組分II是殼聚糖、賴氨酸、膠原中的至少一種。優(yōu)選地，所述組織工程支架包括水凝膠支架，所述水凝膠支架是由凝膠組分通過交聯(lián)劑相互交聯(lián)獲得。進(jìn)一步地，所述凝膠組分是殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、海藻酸鉀、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一種。進(jìn)一步地，所述交聯(lián)劑是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一種。本發(fā)明還提供這種組織工程支架的修飾方法在制備醫(yī)療器械中的應(yīng)用，具有良好的生物相容性。本發(fā)明在常溫水體系中進(jìn)行，通過活性組分與組織工程支架之間的相互作用將活性組分層層組裝在組織工程支架網(wǎng)絡(luò)中，組裝的成份和層數(shù)可調(diào)，此方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可控性強(qiáng)，清潔低成本。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I修飾水凝膠支架的流程示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I水凝膠支架不同組裝層數(shù)的表面Zeta電位變化圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例I水凝膠支架中軟骨素隨不同組裝層數(shù)的含量變化圖。圖4a為本發(fā)明實(shí)施例I水凝膠支架中細(xì)胞的掃描電鏡圖，圖4b為圖4a的局部放大圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例I在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞/支架材料中的DNA總量示意圖。
具體實(shí)施例方式在下文將結(jié)合附圖及實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其目的是使本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員更容易理解本發(fā)明的實(shí)施及優(yōu)點(diǎn)，而不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。除非在本發(fā)明說明書中另有定義，否則在此所有的技術(shù)術(shù)語都是根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常使用和理解的慣用定義來使用。實(shí)施例I本實(shí)施例的組織工程支架是采用交聯(lián)劑和凝膠組分制備的水凝膠支架，例如，交聯(lián)劑是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液或乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一種，凝膠組分是殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、海藻酸鉀、聚乙烯醇或聚丙烯酸中的至少一種，兩者發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)獲得水凝膠支架。具體制備方法可參見申請(qǐng)?zhí)枮?01010237869. X的發(fā)明申請(qǐng)“生物大分子的水凝膠生物支架及其制備方法”。配制O. 2wt.%軟骨素水溶液作為活性組分I溶液；0.2wt.%殼聚糖水溶液(含
O.Iwt. %醋酸)作為活性組分II水溶液備用。然后采用層層組裝的方法通過下列步驟對(duì)水凝膠支架進(jìn)行修飾層層組裝技術(shù)修飾殼聚糖水凝膠支架的流程見圖I。a.將殼聚糖水凝膠支架浸入O. 2wt. %軟骨素水溶液中2h，使水凝膠支架上能組裝上一層軟骨素。浸泡過程中，通過表面Zeta電位測(cè)試結(jié)果(結(jié)合圖2所示)證實(shí)軟骨素呈負(fù)電性，而殼聚糖呈正電性，兩者能通過靜電作用相互結(jié)合，組裝完成后在殼聚糖水凝膠支架表面便組裝了一層軟骨素分子。根據(jù)不同的組裝濃度需要，浸泡過程可以適當(dāng)延長(zhǎng)，一般浸泡時(shí)長(zhǎng)達(dá)到8小時(shí)可保證裝載完成。下面是層層組裝過程中修飾水凝膠支架的表面Zeta電位測(cè)試結(jié)果(見圖2)通過考察層層組裝過程中殼聚糖水凝膠支架表面Zeta電位的變化研究組裝的驅(qū)動(dòng)力。為測(cè)試需要，將水凝膠支架粉碎成微米尺寸的凝膠顆粒，在組裝過程中在表面Zeta電位儀上測(cè)試凝膠顆粒的表面Zeta電位。由圖2可知，軟骨素分子在水溶液中呈電負(fù)性，組裝軟骨素后支架表面Zeta電位為負(fù)值，殼聚糖分子在水溶液中呈電正性，組裝殼聚糖后支架表面Zeta電位為正值，因此，層層組裝的驅(qū)動(dòng)力為軟骨素分子與殼聚糖分子之間的靜電作用。b.然后將組裝有軟骨素的水凝膠支架置于純水中浸泡Ih,清洗掉多余軟骨素。當(dāng)組裝到一定數(shù)量的軟骨素分子，由于靜電作用的減弱，殼聚糖與軟骨素之間的靜電作用已不足組裝更多的軟骨素分子，此時(shí)軟骨素的組裝達(dá)到飽和，一些組裝不牢固的軟骨素將被清洗掉。c.將完成步驟b的水凝膠支架浸入O. 2wt. %殼聚糖水溶液中2h，在組裝有軟骨素的水凝膠支架上，通過靜電作用組裝一層殼聚糖。在軟骨素的基礎(chǔ)上包覆殼聚糖，能讓活性組分固定在水凝膠支架的表面，減少或避免活性組分的流失，還能增強(qiáng)水凝膠支架體型結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性，使材料的細(xì)胞相容性明顯提高。根據(jù)不同的組裝濃度需要，浸泡過程可以適當(dāng)延長(zhǎng)，一般浸泡時(shí)長(zhǎng)達(dá)到8小時(shí)可保證裝載完成。d.同樣地，待軟骨素與殼聚糖之間的靜電作用達(dá)到飽和，將完成步驟c的水凝膠支架置于純水中浸泡lh，清洗掉多余殼聚糖。本實(shí)施例重復(fù)上述步驟a d為10次?？筛鶕?jù)需要重復(fù)以上a d步驟η次，100。調(diào)控殼聚糖水凝膠支架中軟骨素的含量，由此在水凝膠支架上獲得交替層疊
軟骨素與殼聚糖的水凝膠組織結(jié)構(gòu)。下面是修飾后的水凝膠組織結(jié)構(gòu)中軟骨素的含量測(cè)試通過EDC/NHS反應(yīng)在軟骨素分子中標(biāo)記熒光分子Alexa Fluor 555cadaverine (Invitrogen),并進(jìn)行上述組裝過程。在突光光度計(jì)上記錄突光分子的強(qiáng)度計(jì)算溶液中軟骨素的濃度。比較組裝軟骨素前后軟骨素水溶液中軟骨素的濃度變化計(jì)算殼聚糖水凝膠組織結(jié)構(gòu)中軟骨素的含量。組裝不同層數(shù)軟骨素的水凝膠組織結(jié)構(gòu)中軟骨素的含量變化見圖3。由圖可知，通過軟骨素組裝層數(shù)的變化可以調(diào)控殼聚糖水凝膠組織結(jié)構(gòu)中軟骨素的含量。下面是修飾后水凝膠組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在殼聚糖水凝膠組織結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞(human lungfibroblast, HLF),比較軟骨素組裝前后細(xì)胞在支架材料中的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)10天后在組裝了軟骨素的殼聚糖水凝膠組織結(jié)構(gòu)中細(xì)胞形態(tài)表征見圖4。由圖可知，細(xì)胞在支架表面充分鋪展，在細(xì)胞群落中觀察到大量細(xì)胞偽足，表明細(xì)胞與支架材料之間的強(qiáng)烈相互作用。在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞/支架材料中的DNA總量(圖5)。相同條件下，與未組裝軟骨素的樣品比較可知，在組裝了軟骨素的樣品中可以檢測(cè)到更多的DNA成份(與樣品中細(xì)胞數(shù)相對(duì)應(yīng))，表明組裝了軟骨素和殼聚糖的水凝膠支架可以為細(xì)胞提供更好的生長(zhǎng)環(huán)境。實(shí)施例2本實(shí)施與實(shí)施例I不同的是，將殼聚糖水凝膠支架浸入活性組分I的Iwt. %肝素水溶液中4h，在水凝膠支架上組裝肝素，然后置于純水中Ih清洗多余肝素；將水凝膠支架浸入活性組分II的O. 2wt. %殼聚糖水溶液中3h在支架上組裝殼聚糖；然后置于純水中Ih清洗多余殼聚糖。本實(shí)施例重復(fù)上述步驟30次。根據(jù)需要重復(fù)以上步驟，可以調(diào)控殼聚糖水凝膠支架中肝素的含量，由此獲得在水凝膠支架上交替層疊肝素與殼聚糖的水凝膠組織結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3本實(shí)施與實(shí)施例I不同的是，將膠原水凝膠支架浸入活性組分I的O. 4wt. %軟骨素水溶液中2h，在水凝膠支架上組裝軟骨素，然后置于純水中Ih清洗多余軟骨素；將水凝膠支架浸入活性組分II的O. 3wt. %膠原水溶液中5h在支架上組裝膠原，然后置于純水中Ih清洗多余膠原。本實(shí)施例重復(fù)上述步驟40次。根據(jù)需要重復(fù)以上步驟，可以調(diào)控膠原水凝膠支架中軟骨素的含量，由此獲得在水凝膠支架上交替層疊軟骨素與膠原的水凝膠組織結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4本實(shí)施與實(shí)施例I不同的是，將殼聚糖水凝膠支架浸入活性組分I的O. Iwt. %海藻酸鈉水溶液中2h，在水凝膠支架上組裝海藻酸鈉，然后置于純水中Ih清洗多余海藻酸鈉；將水凝膠支架浸入活性組分II的Iwt. %賴氨酸水溶液中4h在支架上組裝賴氨酸,然后說
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置于純水中Ih清洗多余賴氨酸。本實(shí)施例重復(fù)上述步驟10次。根據(jù)需要重復(fù)以上步驟，可以調(diào)控殼聚糖水凝膠支架中賴氨酸的含量。由此獲得在水凝膠支架上交替層疊海藻酸鈉與賴氨酸的水凝膠組織結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5本實(shí)施與實(shí)施例I不同的是，將膠原水凝膠支架浸入活性組分I的O. 3wt. %粘多糖水溶液中8h，在水凝膠支架上組裝粘多糖，然后置于純水中Ih清洗多余粘多糖；將支架浸入活性組分II的O. 2wt. %賴氨酸水溶液中3h在支架上組裝賴氨酸,然后置于純水中Ih清洗多余賴氨酸。再將所述水凝膠支架浸入活性組分I的O. Iwt. %海藻酸鈉水溶液中3h，在水凝膠支架上組裝海藻酸鈉，然后置于純水中Ih清洗多余海藻酸鈉；將水凝膠支架浸入活性組分II的O. 4wt. %賴氨酸水溶液中8h在支架上組裝賴氨酸,然后置于純水中Ih清洗多余賴氨酸。本實(shí)施例重復(fù)上述步驟10次。根據(jù)需要重復(fù)以上步驟，可以調(diào)控水凝膠支架中各種組分的含量。由此獲得在水凝膠支架上交替層疊粘多糖、海藻酸鈉、賴氨酸的水凝膠組織結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施例中，活性組分I還可以是纖維粘連蛋白或?qū)舆B蛋白。本發(fā)明中活性組分I和活性組分II可以根據(jù)所修飾組織工程支架表面分子的電荷、組成、化學(xué)鍵等因素選擇。本發(fā)明中所修飾的組織工程支架表面的初始電性為正值，故活性組分I選擇在水溶液中顯負(fù)電性的分子，而活性組分II選擇在水溶液中顯正電性的分子，這樣活性組分I和活性組分II是通過靜電作用層層組裝到支架上。同樣地，修飾不同的組織工程支架也可以通過不同的作用力，例如還可以是氫鍵、范德華力、疏水作用、共價(jià)鍵或分子特異性識(shí)別作用等。本發(fā)明實(shí)施例中活性組分I和活性組分II的選擇不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明在常溫水體系中進(jìn)行，通過活性組分與組織工程支架之間的相互作用將活性組分層層組裝在組織工程支架網(wǎng)絡(luò)中，組裝的成份和層數(shù)可調(diào)，此方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可控性強(qiáng)，清潔低成本。通過層層組裝技術(shù)把細(xì)胞外基質(zhì)成分直接固定在材料表面，從而在材料表面覆蓋一層細(xì)胞外基質(zhì)，使材料的細(xì)胞相容性明顯提高。采用人為的方式形成材料一細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合層，可通過選擇特定細(xì)胞外基質(zhì)(如促進(jìn)細(xì)胞黏附的透明質(zhì)酸、軟骨素、纖維粘連蛋白、膠原等)或類細(xì)胞外基質(zhì)，改善細(xì)胞在材料表面的黏附及生長(zhǎng)性能，是一種方便有效修飾水凝膠支架的方法。由于具有良好的細(xì)胞相容性，制作出的水凝膠組織結(jié)構(gòu)在制備醫(yī)療器械中具有廣泛的應(yīng)用，例如，可將水凝膠支架制作成不同的形狀，如柱狀、人血管狀、人耳狀、人鼻狀、人指骨狀等，再修飾上細(xì)胞外基質(zhì)組分，能獲得性能較佳的生物材料應(yīng)用在醫(yī)療領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種修飾組織工程支架的方法，其特征在于，包括如下步驟a.將組織工程支架浸于活性組分I水溶液中f8小時(shí)；b.將完成步驟a的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分I;C.將完成步驟b的組織工程支架浸于活性組分II水溶液中廣8小時(shí)；d.將完成步驟c的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分II；e.重復(fù)a_d步驟η次,O< η < 100。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述組織工程支架、活性組分I或活性組分II之間是通過靜電、氫鍵、范德華力、疏水作用、共價(jià)鍵、分子特異性識(shí)別作用中的至少一種作用力相互結(jié)合的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述活性組分I在其水溶液中的質(zhì)量百分比為O. f Iwt. %;所述活性組分II在其水溶液中的質(zhì)量百分比為O. I^lwt. %。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述活性組分I是軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、粘多糖、纖維粘連蛋白、層連蛋白中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述活性組分II是殼聚糖、賴氨酸、膠原中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述修飾組織工程支架的方法，所述組織工程支架包括水凝膠支架，所述水凝膠支架是由凝膠組分通過交聯(lián)劑相互交聯(lián)獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述凝膠組分是殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、海藻酸鉀、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述修飾組織工程支架的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl3水溶液、CrCl3水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一種。
9.一種組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，包括組織工程支架，其特征在于，所述組織工程支架外包覆有交替層疊的活性組分I及活性組分II。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述組織工程支架、活性組分I或活性組分II之間是通過靜電，氫鍵，范德華力，疏水作用，共價(jià)鍵，分子特異性識(shí)別作用中的至少一種作用力結(jié)合的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述活性組分I是軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、粘多糖、海藻酸鈉、纖維粘連蛋白、層連蛋白中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述活性組分II是殼聚糖、賴氨酸、膠原中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述組織工程支架包括水凝膠支架，所述水凝膠支架是由凝膠組分通過交聯(lián)劑相互交聯(lián)獲得。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述凝膠組分是殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、海藻酸鉀、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述交聯(lián)劑是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一種。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求f 15任一項(xiàng)所述的修飾組織工程支架的方法在制備醫(yī)療器械中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種運(yùn)用分子層層組裝技術(shù)修飾組織工程支架的方法，包括如下步驟a．將組織工程支架浸于活性組分Ⅰ水溶液中1~8小時(shí)；b．將完成步驟a的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分Ⅰ；c．將完成步驟b的組織工程支架浸于活性組分Ⅱ水溶液中1~8小時(shí)；d．將完成步驟c的組織工程支架取出并清洗掉多余的活性組分Ⅱ；e．重復(fù)a-d步驟n次，0≤n≤100。本發(fā)明還提供一種組織工程支架的組織結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。本發(fā)明在常溫水體系中進(jìn)行，通過活性組分與組織工程支架之間的相互作用將活性組分層層組裝在組織工程支架網(wǎng)絡(luò)中，組裝的成份和層數(shù)可調(diào)，此方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可控性強(qiáng)，清潔低成本。
文檔編號(hào)A61L31/04GK102940909SQ20121050934
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者杜明春, 戴建武 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所