專利名稱：一種用于治療肝癌的藥物組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療肝癌的藥物組合物及其應用，特別涉及一種含有三氧化二砷和含有PML基因的重組腺病毒的聯(lián)合治療肝癌的藥物組合物及其應用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，統(tǒng)計資料表明，全世界每年有38. 6萬人死于肝癌，其中45%在中國，且有上升趨勢，已成為我國第二位惡性腫瘤致死原因，可見我國為肝癌高發(fā)國家，每年新發(fā)患者在10萬以上，死亡率高，生存期短，嚴重威脅人民健康。近年來，隨著對腫瘤發(fā)病的分子機制及細胞生長調(diào)控機理研究的深入與發(fā)展，證實細胞凋亡是生物體一種與細胞有絲分裂相反方式調(diào)節(jié)細胞群體相對衡定的主要方式，研究認為腫瘤的無限生長與其喪失了自發(fā)性凋亡有關。
分子克隆和基因重組技術的飛速發(fā)展，使腫瘤的基因治療取得了巨大進展，為腫瘤的治療開辟了新的途徑。早幼粒細胞白血病蛋白(PML)屬于一類新型核蛋白家族。研究表明PML蛋白參與了多種凋亡途徑。其中感染單鏈RNA病毒的細胞導致PML重新分布于胞漿中，并導致細胞抵抗血清剔除誘導的凋亡效應。反義PML寡核苷酸促進血清剔除后細胞的存活，提示PML直接參與細胞凋亡過程。用腺病毒pml:重組物(ad-pml)轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系mcf-7，人膀胱移行細胞癌細胞系證實PML蛋白高表達能夠有效地抑制腫瘤細胞的體外生長和成瘤能力，這對于應用pml基因?qū)敕椒ㄖ委熎渌麑嶓w腫瘤提供了一種新思路。
但由于腫瘤的發(fā)生是復雜的多因素、多步驟、涉及多基因事件發(fā)生的過程，針對單一環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)基因治療常常不能達到滿意的治療效果。因此，有研究者提出將基因治療與其他傳統(tǒng)抗癌策略如化療、免疫治療等相結合，以期獲得增強或是協(xié)同的抗癌作用。
三氧化二砷(As2O3)作為傳統(tǒng)中藥毒藥,近年來，國內(nèi)外應用As2O3治療以急性早幼粒細胞白血病為主的惡性血液病與實體瘤，療效顯著，尤其是抗肝癌及膽囊癌的作用受到國內(nèi)外腫瘤界的廣泛關注。研究人員發(fā)現(xiàn)對肝癌細胞選擇性強，機理獨特，可使肝癌細胞的凋亡。這提示我們As2O3可能會成為一種新的治療肝癌和輔助治療肝癌的藥物。但是人們都知道砷本身具有很強的毒性，通過與細胞酶蛋白巰基結合而抑制各種線粒體酶活性，影響氧化磷酸化過程，損害細胞的呼吸作用，不良反應主要是輕度骨髓抑制和肝功損害。
鑒于惡性腫瘤的生物學特性，及基因治療研究的不完善性，基于國內(nèi)學者應用三氧化二砷(As2O3)在白血病治療及其作用機制 的研究成果。并且，單獨應用As2O3或Ad-pml 療效有限，過分增大劑量往往對提高療效無益且可能增加毒性。因此將兩種治療方法進行有機結合，進行多靶點治療對提高療效、分散毒性具有重要意義。
本研究運用分子生物學和細胞生物學技術，觀察聯(lián)合應用三氧化二砷和PML基因重組腺病毒在體外及體內(nèi)治療肝癌的效果，探討其作用機制及特點，以期為肝癌的化學與基因聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。發(fā)明內(nèi)容
三氧化二砷是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，但具有一定的毒副作用，增加劑量往往可以增加療效，但可能會增加毒副作用；pml基因治療腫瘤的價值已受到廣泛關注，但療效有限，本發(fā)明將二者聯(lián)合治療肝癌，希望能夠通過多靶點治療以提高療效、降低毒性。
為了達到上述目的本發(fā)明采用的技術手段為
本發(fā)明運用分子生物學和細胞生物學技術，觀察聯(lián)合應用三氧化二砷和PML基因重組腺病毒在體外及體內(nèi)治療肝癌的效果，探討其作用機制及特點，以期為肝癌的化學與基因聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。本發(fā)明通過實驗1、成功重組了 Ad-pml基因；通過轉(zhuǎn)染HeLa 細胞表達實驗，證明應用腺病毒做載體，不但能夠增加轉(zhuǎn)染效率，而且可以在細胞中大量表達。2、PML重組腺病毒(Ad-pml)于體外、體內(nèi)明顯抑制肝腫瘤細胞的生長，這為Ad-pml基因治療提供了理論與實驗基礎，對于肝癌的PML基因治療提供的依據(jù)。3、As2O3和Ad-pml 聯(lián)合應用有協(xié)同抗肝癌細胞作用，其機制與增強肝癌細胞凋亡及控制凋亡相關基因的表達有關。
因此，本發(fā)明提出了一種用于治療肝癌的藥物組合物，其特征在于其有效成分為三氧化二砷和含有PML基因的重組腺病毒。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的藥物組合物中含有的三氧化二砷的濃度為5 μ mol/L， 含有的重組腺病毒的MOI為20。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的重組腺病毒是按照以下方法制備得到的
(I)重組載體PSG-PML的構建
分別用EcoR I和Bgl II雙酶切PSG-CMV和PSG5-PML質(zhì)粒，分別回收純化載體片段和目的DNA片段，將純化后的兩個片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒PSG-PML ；
(2)重組腺病毒的構建
將重組載體PSG-PML與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3通過Lipofectamine2000 共轉(zhuǎn)染至293細胞；共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，獲得重組腺病毒 Ad-pmlο
進一步的，本發(fā)明還提出了所述的藥物組合物在制備治療肝癌藥物中的應用。
相較于現(xiàn)有技術本發(fā)明的有益效果是
1、成功重組了 Ad-pml基因；通過轉(zhuǎn)染HeLa細胞表達實驗，證明應用腺病毒做載體，不但能夠增加轉(zhuǎn)染效率，而且可以在細胞中大量表達。
2、PML重組腺病毒(Ad-pml)于體外、體內(nèi)明顯抑制肝腫瘤細胞的生長，這為 Ad-pml基因治療提供了理論與實驗基礎，對于肝癌的PML基因治療提供的依據(jù)。
3、As2O3和Ad-pml聯(lián)合應用有協(xié)同抗肝癌細胞作用，其機制與增強肝癌細胞凋亡及控制凋亡相關基因的表達有關。


圖1為PML基因重組腺病毒載體的構建的實驗流程圖2為PSG-CMV和PSG5-PML雙酶切后回收產(chǎn)物電泳結果；
圖2A I lKb DNA Ladder ；2 =PSG-CMV 酶切回收產(chǎn)物 5085bp ；
圖 2B I PSG5-PML 酶切回收產(chǎn)物 2IOObp ；2 λ DNA/EcoR I+HindIII ；
圖3為重組質(zhì)粒PSG-PML的酶切鑒定結果；
I 6:篩選的陽性重組 PSG-PML 質(zhì)粒。7 :1Kb DNA Ladder
圖4為重組病毒PSG-PML的PCR鑒定結果；
1:陰性對照 2 :陽性對照(PSG5-PML) 3 :1Kb DNA Ladder 4 :重組病毒(PSG-PML)
圖5為PCR產(chǎn)物測序結果(部分)；
圖6為免疫熒光方法檢測PML基因表達的結果(24h)
圖7為聯(lián)合應用As2O3和Ad-pml體外、體內(nèi)治療肝癌的實驗流程圖8為流式細胞儀檢測細胞凋亡結果；
圖9為應用半定量RT-PCR的方法對Ad-pml、As2O3及二者聯(lián)合作用細胞48小時后，各組細胞P53與Bcl-2 mRNA的相對表達強度變化測定結果；
圖9A 為 p53 mRNA 表達結果(470bp);1:Ad_pml 和 As2O3 聯(lián)合應用,p53 mRNA 表達最強；2 :單獨應用Ad-pml ；3 :單獨應用As2O3 ；4 :肝癌細胞對照，p53 mRNA表達最弱，各泳道最前面的是內(nèi)對照β-actin;
圖9B是Bcl-2 mRNA表達結果(760bp) ；1 :肝癌細胞對照，Bcl-2 mRNA表達最強；2:單獨應用As2O3 ;3 :單獨應用Ad-pml 4 :Ad_pml和As2O3聯(lián)合應用，Bcl_2 mRNA表達最弱， 各泳道最前面的是內(nèi)對照β-actin;
具體實施例方式
下面通過實驗并結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制 本發(fā)明的保護范圍。
實施例1表達PML基因的重組腺病毒載體(Ad-pml)的構建
(一)質(zhì)粒和細胞
PSG-CMV、PSG5-PML質(zhì)粒購自上海東方肝膽醫(yī)院；含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3 購自 Microbix Biosystems 公司;293 細胞購自加拿大 Microbix Biosystems 公司。
(二)主要試劑
內(nèi)切酶 Xba1、BamH1、EcoR1、Hind II1、ScaI 及 Taq 酶、DNA 連接酶 SolutionI 均購自TakaRa公司。
胎牛血清、小牛血清、DMEM、LipofectAmine2000試劑盒購自GIBCO BRL公司。
膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒DNA制備試劑盒、病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。
PML單克隆抗體及綠色突光標記的二抗均購自Invitrogen公司。
(三)引物合成
采用PCGENE軟件中的PCRPLAN程序，設置各參數(shù)
最適Tm=66，Tm允許范圍50-80 ;引物長度15_25bp，G-C含量40-60%，引物內(nèi)互補最大值為3，3’端G-C添加為1，引物與模板其它位點同源最大值為60%。經(jīng)過運算，獲得較佳的引物序列。并由基康基因公司合成。
本實驗采用的引物如下
1、PML 基因的上游引物5’ GAG ACT AAA TTA GAA AGG GGT GG 3’
2、PML 基因的下游引物5’ TTC GGA GGA GGA GTT CCA GTT TC 3’
(四)實驗方法
實驗流程圖如圖1所示。
1、PSG-PML載體的構建
(I) PSG-CMV 和 PSG5-PML 質(zhì)粒的酶切
酶切體系
I Ox緩沖液4.0 μ IO X緩沖液4.0 μ EcoR I! .0 μ EcoR I1.0 μ Bgl II1.0 μ Bgl II1.Ομ PSG-CMVPSG5-PML μβ雙蒸水I μ!雙蒸水Ιμ 總體積40 μ I總體積40 μ
酶切條件37 0C 水浴
用O. 8%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAGEN公司的凝膠純化試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物(按試劑盒說明操作)?；厥誔SG-CMV 5085bp大小的DNA片段(PSG)和回收PSG5-PML 2100bp 大小的DNA片段(PML)。
(2)純化后連接產(chǎn)物的克隆 O目的片段和載體的連接連接體系
PSGPML連接緩沖液μ μ μ 10 μ

總體積連接條件16 °C 30min 連接采用TaKaRa DNA Iigase試劑盒2)制備DH5α感受態(tài)細菌CaCL2法3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌；4)陽性克隆的篩選挑取單菌落，接種于3mlLB/AMP+液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，粗提質(zhì)粒，電泳，通過質(zhì)粒大小鑒定是否插入了外源片段。
5)陽性克隆的鑒定酶切鑒定插入的外源片段是否為我們的目的基因。
2、重組及鑒定
(I)將質(zhì)粒PSG-PML與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3通過Lipof ectamine2000 共轉(zhuǎn)染至293細胞(按試劑盒說明操作)。
(2)共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，獲得重組腺病毒Ad-pml,*_QIAamp DNA Blood Mini燈セ提取腺病毒0嫩，應用卩〔8進行鑒定。引物序列如下卩1し基因上游引物(ロ爪1-叩)5，GAGACT AAA TTA GAA AGG GGT GG 3，卩厘し基因下游引物ひ爪レ如界卩)5，TTC GGA GGA GGA GTT CCA GTT TC 3，PCR反應體系
權利要求
1.一種用于治療肝癌的藥物組合物，其特征在于其有效成分為三氧化二砷和含有PML 基因的重組腺病毒。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中含有的三氧化二砷的濃度為5 μ mol/L，含有的重組腺病毒的MOI為20。
3.如權利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于所述的重組腺病毒是按照以下方法制備得到的(1)重組載體PSG-PML的構建分別用EcoR I和Bgl II雙酶切PSG-CMV和PSG5-PML質(zhì)粒，分別回收純化載體片段和目的DNA片段，將純化后的兩個片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒 PSG-PML ；(2)重組腺病毒的構建將重組載體PSG-PML與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pPE3通過Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細胞；共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，獲得重組腺病毒 Ad-pmlο
4.權利要求1-3任一項所述的藥物組合物在制備治療肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療肝癌的藥物組合物及其應用，本發(fā)明的藥物組合具體為一種含有三氧化二砷和含有PML基因的重組腺病毒的聯(lián)合治療肝癌的藥物組合物，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。本發(fā)明首次提出三氧化二砷和PML基因重組腺病毒聯(lián)合治療肝癌這一治療理念，并通過運用分子生物學和細胞生物學技術，觀察聯(lián)合應用三氧化二砷和PML基因重組腺病毒在體外及體內(nèi)治療肝癌的效果，揭示其作用機制及特點，為肝癌的治療提供了理論依據(jù)和新方法。
文檔編號A61K48/00GK102989011SQ20121051775
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權日2012年12月6日
發(fā)明者崔立明, 張士德, 胡悅, 孫麗琴, 李曉波 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學