專利名稱：制備含氫氣微泡水溶液的方法,其產(chǎn)品及應(yīng)用的制作方法
制備含氫氣微泡水溶液的方法，其產(chǎn)品及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)療領(lǐng)域，具體涉及含氫氣微泡水溶液的制備，其產(chǎn)品及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，氫氣在生物醫(yī)療方面的應(yīng)用越 來(lái)越引起人們的興趣。Dole等(Science，1975,4210:152-154)在《科學(xué)》雜志發(fā)表了連續(xù)呼吸8個(gè)大氣壓97.5%氫氣(2.5%氧)14天，高壓氫氣可有效治療動(dòng)物皮膚惡性腫瘤的論文，一方面可降低氧氣的濃度，另一方面提高了氫氣在機(jī)體內(nèi)的濃度。法國(guó)潛水醫(yī)學(xué)家Gharib 等(Life Sciences, 2001, 324 =719-724)也報(bào)道證明，呼吸8個(gè)大氣壓高壓氫氣可治療肝寄生蟲(chóng)感染引起的炎癥反應(yīng)，首次證明氫氣具有抗炎作用，并提出氫氣與羥自由基直接反應(yīng)是治療炎癥損傷的基礎(chǔ)。日本醫(yī)科大學(xué)Ohsawa 教授(Nature Medicine, 2007,13:688-694)報(bào)道，呼吸 2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷。他們采用化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞學(xué)等手段證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化損傷的最重要介質(zhì)。因此認(rèn)為，氫氣治療腦缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)是選擇性抗氧化作用，提出氫氣可選擇性中和毒性自由基，是一種選擇性抗氧化物質(zhì)。該發(fā)現(xiàn)讓世界生物學(xué)界再次把眼光投向這個(gè)小小的氣體分子，迅速引起廣泛關(guān)注并引起了研究氫氣治療疾病的熱潮。隨后，該研究組又在肝和心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷(BBRC，2007，361:670-674)。美國(guó)匹斯堡大學(xué)移植中心發(fā)表了呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎癥損傷的文章(Am JTransplant.2008，8 (10):2015-24)。第二軍醫(yī)大學(xué)孫學(xué)軍教授的實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了呼吸2%的氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷的文章(Neuroscience Letters,2008,441:167-172)。從疾病發(fā)生機(jī)制上考慮，氧化損傷幾乎是所有疾病的最基本病理生理過(guò)程，氫氣既然是選擇性抗氧化物質(zhì)，就有可能對(duì)人類大部分疾病具有治療作用。大量動(dòng)物試驗(yàn)也證明，氫氣可通過(guò)減少氧化損傷、炎癥性損傷、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程，對(duì)40多種人類常見(jiàn)疾病具有顯著的治療效果。例如腦、心臟、其他各類重要器官如肝、腎和小腸缺血再灌注損傷；再如各類與衰老有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病老年性癡呆、巴金森病、糖尿病和肥胖等；還如各類炎癥性疾病，如關(guān)節(jié)炎、全身炎癥反應(yīng)等等。雖然氫氣對(duì)許多疾病具有潛在的治療價(jià)值，但到目前為止，由于沒(méi)有大規(guī)模臨床證據(jù)，尚沒(méi)有任何一項(xiàng)研究可以明確肯定這種臨床治療價(jià)值。但關(guān)于氫氣治療疾病的臨床研究正逐漸增加，如在糖尿病、腎衰、中風(fēng)、皮膚病、肝癌后放射治療造成的損傷等方面都有氫氣治療有效的文獻(xiàn)報(bào)道。目前用于治療的氫氣應(yīng)用方式主要有呼入氫氣、口服含氫氣水和注射飽和氫氣生理鹽水三種類型。然而，這三種方式在實(shí)際應(yīng)用中各自都存在一些問(wèn)題。
直接呼入氫氣:由于氫氣的易燃易爆的特性，呼入高壓高氫氣存在巨大的安全隱患，雖然將氫氣體積濃度降低到4%可以避免爆炸，但大量氫氧混合物的制備、存儲(chǔ)、運(yùn)輸都有巨大的風(fēng)險(xiǎn)，并且為了安全起見(jiàn)，需要一系列復(fù)雜的設(shè)備及嚴(yán)格的操作來(lái)保證呼吸氫氣的安全性?？诜缓瑲錃馑?雖然每天口服富含氫氣水似乎更具有可行性，但由于氫氣在水中的溶解度極低，加上氫氣容易滲透和擴(kuò)散， 富含氫氣水的制備和存儲(chǔ)都有一定的難度。另夕卜，通過(guò)口服的方式遞送氫氣具有很大的不確定性，供給氫氣的濃度和位置都不可控，更適合持續(xù)的飲用來(lái)起保健作用，不適應(yīng)于臨床疾病應(yīng)用。注射飽和氫氣生理鹽水:采用注射的方式供給氫氣，比口服在劑量控制，給藥時(shí)間和反復(fù)給藥上更有優(yōu)勢(shì)，更容易控制濃度和位置，更具有臨床前景。但由于氫氣在水中低溶解和易擴(kuò)散等性質(zhì)，需要注射的量相對(duì)較大，每千克需要注射5-10ml的量，而且氫氣濃度不穩(wěn)定，存儲(chǔ)時(shí)間短。由于氫氣的高度可燃性及在水中極低的溶解性，20°C的常壓條件下，I體積水中的只能溶解0.0182體積的氫氣，目前除了通過(guò)加壓的辦法來(lái)提高氫氣在水中的溶解度，尚沒(méi)有看到有更有效的報(bào)道。因此，有必要開(kāi)發(fā)更有效的氫氣遞送介質(zhì)和途徑，提高氫氣在水中的溶解度用于醫(yī)療應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中用于醫(yī)療用途的氫氣溶液中氫氣溶解度低、濃度不穩(wěn)定且難以控制、儲(chǔ)存時(shí)間短的問(wèn)題。為此，本發(fā)明一方面提供一種用于制備含氫氣微泡水溶液的方法，包括步驟:SI形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜，其中所述磷脂為20個(gè)C原子的硬脂酸鏈，12-24個(gè)C原子的脂肪酸對(duì)應(yīng)的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，它們的混合物或經(jīng)抗體、多肽靶向修飾的衍生物；S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉(zhuǎn)變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩沖液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液；S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內(nèi)空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分?jǐn)?shù)為0-90% ;以及S4震蕩形成含氫氣微泡水溶液。所述磷脂可以為1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯、1，2_ 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物，并且尤其可以為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物，其中1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿的摩爾比百分?jǐn)?shù)為85-90%，并且其中聚乙二醇酯選自聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。步驟SI還可以包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。所述水性緩沖液可以為磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。所述磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度可以為0.5_15mg/ml。所述氫氣混合氣體可以為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮?dú)?，或它們的混合物的混合氣體，并且尤其可以為氫氣與三氟丙烷的混合氣體，并且氫氣與三氟丙烷的體積比為1: 1-3。所述步驟S4可以通過(guò)機(jī)械震蕩、探頭式細(xì)胞破碎機(jī)超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法進(jìn)行。本發(fā)明另一方面提供一種根據(jù)本發(fā)明的方 法制備得到的含氫氣微泡水溶液，其特征在于，所述含氫氣微泡水溶液中的氫氣含量大于50ul/ml。本發(fā)明再一方面提供該含氫氣微泡水溶液在制備抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化，并且所述藥物同時(shí)具有超聲造影的功能。所述藥物可以通過(guò)靜脈注射，或靜脈輸注給藥。所述藥物中的含氫氣微泡可通過(guò)超聲探頭控制釋放。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):通過(guò)用磷脂膜包裹氫氣形成微泡，大大提高了氫氣在水中的溶解度、溶液中氫氣的濃度可控，且更穩(wěn)定。由此得到的含氫氣微泡水溶液在應(yīng)用中不僅可以降低使用劑量，還兼具超聲造影功能。

圖1為氫氣氟碳混合氣體微泡溶液(左)和純氫氣微泡溶液(右)。圖2為根據(jù)本發(fā)明用于制備含氫氣微泡水溶液的方法流程3為氫氣微泡的氫氣含量測(cè)量裝置不意圖。圖4為根據(jù)本發(fā)明制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的粒徑分布及濃度。圖5為根據(jù)本發(fā)明制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的形貌圖。圖6A和6B分別為使用本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液處理大鼠心肌缺血前后的心電圖。圖7A-C為使用本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液治療心肌缺血，使用氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)的染色對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施方式本發(fā)明提出一種以氫氣作為藥物的新劑型，來(lái)改善目前氫氣藥物溶液中，氫氣溶解度低，濃度不易控制，且穩(wěn)定性差的問(wèn)題。本發(fā)明人注意到，超聲造影技術(shù)中，通過(guò)使用磷脂包裹氣泡形成氣體微泡可以獲得具有較高氣體含量的微泡溶液。然而，由于氫氣分子體積小，具有極強(qiáng)的擴(kuò)散性，單純的氫氣幾乎不能被制備造影劑微泡的磷脂包裹形成氣泡，更不能用于造影和治療。為此，本發(fā)明人通過(guò)兩種方案對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了優(yōu)化:一方面使用氫氣混合氣體，即氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮?dú)獾葰怏w的混合氣體。由于氟碳、氮?dú)獾葰怏w具有較大的分子量和分子體積，不容易穿過(guò)磷脂膜，從而可以起到骨架支撐的作用，使氫氣能夠分布在氣泡內(nèi)。
第二方面在于:要制作氫氣微泡，需要對(duì)常用作微泡造影劑的材料進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)改進(jìn)磷脂材料的種類，以增加外殼的厚度及緊密性，來(lái)提高磷脂膜對(duì)氫氣的包裹能力。本申請(qǐng)中，發(fā)明人將磷脂改成疏水性鏈的長(zhǎng)度為20個(gè)碳原子的磷脂，例如1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，或是22個(gè)甚至24個(gè)碳鏈長(zhǎng)度的磷脂，等等，來(lái)提高氫氣微泡的穩(wěn)定性。圖1為氫氣氟碳混合氣體微泡溶液(左圖)和純氫氣微泡溶液(右圖)。從圖中可見(jiàn)，單純的氫氣幾乎不能形成微泡，或者形成極少部分的泡沫(右圖)，而氟碳和氫氣的混合，可以得到具有豐富泡沫的溶液(左圖)。總體上，本發(fā)明制作含氫氣微泡水溶液的方 法包括四個(gè)步驟，參見(jiàn)圖2所示的流程圖。首先，是步驟SI形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜。為了能夠更完全地去除溶劑，還可以將得到的磷脂薄膜在真空烘箱中干燥處理。例如在45°C干燥2小時(shí)，或更久。低沸點(diǎn)溶劑為能夠溶解磷脂的有機(jī)溶劑，其沸點(diǎn)通常低于65°C，從而能夠容易地使用惰性氣流(如氮?dú)饬?除去。例如，低沸點(diǎn)溶劑可以是三氯甲烷、甲醇、乙醚或他們的混合溶劑等。磷脂如上文所示，可以是20個(gè)C原子的硬脂酸鏈，或是12-24個(gè)C原子的脂肪酸對(duì)應(yīng)的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，或是它們的混合物。此外，磷脂還可以進(jìn)行修飾，例如使用抗體、多肽等對(duì)磷脂進(jìn)行修飾，已得到具有靶向功能的磷脂衍生物。具體地，磷脂可以使用1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯、1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物，例如當(dāng)磷脂為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物時(shí)，前者的摩爾比百分?jǐn)?shù)可以為85-90%。聚乙二醇酯可以是聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。接下來(lái)是步驟S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉(zhuǎn)變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩中液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液。使用中性或弱堿性緩沖液是為了與生理環(huán)境保持等滲透性。該緩沖液可以是磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。緩沖液的量對(duì)最終得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的包膜厚度有影響，通常情況下，磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度可以為0.5-15mg/ml。隨后是步驟S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內(nèi)空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分?jǐn)?shù)為0-90 %。密封容器可以是例如西林瓶這樣的容器。氫氣混合氣體如上文所示，可以為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮?dú)?，或它們的混合物的混合氣體。優(yōu)選的情況中，氫氣混合氣體為氫氣與三氟丙燒的混合氣體，并且氫氣與三氟丙燒的體積比為I: 1-3。
最后是步驟S4:震蕩形成含氫氣微泡水溶液。該步驟可以通過(guò)機(jī)械震蕩、探頭式細(xì)胞破碎機(jī)超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法，等方法進(jìn)行。使用本發(fā)明的方法得到的含氫氣微泡水溶液中，氫氣含量通常大于50ul/ml。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)中氫氣在水中的溶解度(約IOppm)。本發(fā)明得到的含氫氣微泡水溶液具有氫氣的 治療作用，可以用來(lái)制備抗炎藥物，例如用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化。另外，由于制成了含氫氣微泡水溶液的劑型，其還具有超聲造影的功能，可以同時(shí)用作超聲造影劑。其給藥方式包括靜脈注射，或靜脈輸注等等。當(dāng)所用的磷脂為經(jīng)靶向修飾的磷脂時(shí)，本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液還具有靶向標(biāo)記作用。這進(jìn)一步擴(kuò)大了氫氣在治療上的應(yīng)用范圍，和治療效果。而且，由于微泡具有超聲敏感性，本發(fā)明制備的含氫氣微泡水溶液在用于治療時(shí)，可以通過(guò)使用超聲探頭控制氫氣的釋放。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，聚乙二醇2000修飾的1、2_ 二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮?dú)饬鞒ト燃淄槭谷芙獾牟牧显谠嚬鼙谏闲纬梢粚泳鶆虻谋∧?，真空烘箱?5°C干燥2小時(shí)以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質(zhì)量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3以I毫升/瓶將磷脂水混合溶液裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶?jī)?nèi)部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機(jī)械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測(cè)使用如圖3所示的測(cè)量裝置，用注射器抽取上述微泡lml，注入IL總?cè)萘康纳献斐闉V瓶中，將出口用配套的有孔帶導(dǎo)氣管橡膠塞塞緊，導(dǎo)氣管的出口及抽濾瓶的上嘴口分別與氫氣檢測(cè)儀GT901的進(jìn)氣和出氣口形成密閉循環(huán)。按下檢測(cè)儀開(kāi)關(guān)進(jìn)行檢測(cè)，待讀數(shù)穩(wěn)定后得到氣體體積分?jǐn)?shù)為Nppm，經(jīng)換算，Nppm相當(dāng)于每升瓶中氣體含氫氣N ul，即Iml微泡即含有N ul的氫氣。針對(duì)該實(shí)施例，取Iml該微泡用氫氣檢測(cè)裝置分析，Iml氫氣微泡含有87.2ul氫氣。與Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 8倍左右的提高。氫氣微泡的濃度及粒徑分布測(cè)試
用移液器取2.5微升上述微泡，注入到PSS780A顆粒計(jì)數(shù)分析儀的樣品腔中，測(cè)量得到氫氣微泡的粒徑分布及濃度，取一滴稀釋后夾在載玻片上，用顯微鏡觀察并拍照。圖4所示為該實(shí)施例制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的粒徑分布及濃度。從圖中可見(jiàn)，99%以上的微泡小于8um，小于I微米的微泡占據(jù)了微泡數(shù)量的絕大部分，平均粒徑為1.03um,能夠安全的通過(guò)肺循環(huán)，微泡的濃度達(dá)到了每毫升1.33X IO10個(gè)。圖5為該實(shí)施例制備得到的含氫氣微泡水溶液 中氫氣微泡顯微鏡下的形貌圖。從圖中可見(jiàn)，微泡分布相對(duì)均勻，具有良好的分散性質(zhì)，明場(chǎng)顯微鏡下呈現(xiàn)出暗色的磷脂外殼包圍著亮的氣體核心，為典型的微泡結(jié)構(gòu)。心肌缺血再灌灃試齡腹腔麻醉后，全程心電圖監(jiān)測(cè)，如圖6所示，圖6A和6B分別為使用該實(shí)施例含氫氣微泡水溶液處理大鼠心肌缺血前后的心電圖。從圖中可見(jiàn)，缺血前后的心電圖ST段抬高，為心肌缺血的典型心電圖。后期通過(guò)依注射文思藍(lán)染色，確定缺血模型建立成功。對(duì)照組:進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)形成心肌缺血再灌注模型，再灌注前3分鐘通過(guò)靜脈注射0.5ml的生理鹽水。3分鐘后打開(kāi)結(jié)扎部位，再灌注3小時(shí)后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)。然后通過(guò)氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過(guò)重量法測(cè)量心肌平均梗死范圍為42.73%左右(圖7A)。氫氣治療組:左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分鐘通過(guò)靜脈注射
0.1ml的上述氫氣微泡，3分鐘后打開(kāi)結(jié)扎部位，再灌注3小時(shí)后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)，然后通過(guò)氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過(guò)重量法測(cè)量心肌平均梗死范圍為27.43%左右(圖7B)。氫氣+超聲治療組:左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分鐘通過(guò)靜脈注射
0.1ml的上述氫氣微泡，用頻率2.25M聚焦深度5cm的單振元超聲探頭，4.5 %占空比輻照心臟區(qū)域30秒，進(jìn)行氫氣釋放，3分鐘后打開(kāi)結(jié)扎部位，再灌注3小時(shí)后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)，然后通過(guò)氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過(guò)重量法測(cè)量心肌平均梗死范圍為22.56%左右(圖7C)。實(shí)施例2
_5] 含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2_ 二二十二烷基脂肪酰甘油基磷脂酰膽堿(22: 0PC)，聚乙二醇2000修飾的1、2_ 二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮?dú)饬鞒ト燃淄槭谷芙獾牟牧显谠嚬鼙谏闲纬梢粚泳鶆虻谋∧?，真空烘箱?5°C干燥2小時(shí)以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質(zhì)量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在80°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。
S3以I毫升/瓶將磷脂水混合溶液裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶?jī)?nèi)部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1: 3的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機(jī)械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測(cè)取Iml該微泡用上述氫氣檢測(cè)裝置分析，測(cè)得 Iml氫氣微泡含有50.7ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 5倍左右的提高。實(shí)施例3含氫氣微泡水溶液的制備SI按85: 15摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮?dú)饬鞒ト燃淄槭谷芙獾牟牧显谠嚬鼙谏闲纬梢粚泳鶆虻谋∧?，真空烘箱?5°C干燥2小時(shí)以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質(zhì)量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶?jī)?nèi)部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機(jī)械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測(cè)取Iml該微泡用上述氫氣檢測(cè)裝置分析，測(cè)得Iml氫氣微泡含有80.5ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 7倍左右的提高。實(shí)施例4含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮?dú)饬鞒ト燃淄槭谷芙獾牟牧显谠嚬鼙谏闲纬梢粚泳鶆虻谋∧?，真空烘箱?5°C干燥2小時(shí)以上。根據(jù)上述磷脂的總質(zhì)量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶?jī)?nèi)部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4在通入氫氣和全氟丙烷1:1混合氣體的情況下，用探頭式細(xì)胞破碎機(jī)超聲30s即可得到豐富的白色泡沫。氫氣含暈檢測(cè)取Iml該微泡用上述氫氣檢測(cè)裝置分析，測(cè)得Iml氫氣微泡含有60.3ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 6倍左右的提高。
實(shí)施例5含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 5: 5的摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(24: 0，PC)，硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯(PEG40S) ,1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸(DSPC-PEG-folate)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮?dú)饬鞒ト燃淄槭谷芙獾牟牧显谠嚬鼙谏闲纬梢粚泳鶆虻谋∧ぃ婵蘸嫦渲?5°C干燥2小時(shí)以上。根據(jù)上述磷脂的總質(zhì)量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶 液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在85°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶?jī)?nèi)部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機(jī)械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到具有葉酸配體的
氫氣微泡。氫氣含暈檢測(cè)取Iml該微泡用上述氫氣檢測(cè)裝置分析，Iml氫氣微泡含有74.5ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比,有了 7.5倍左右的提高。以上所述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于制備含氫氣微泡水溶液的方法，包括步驟: Si形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜，其中 所述磷脂為20個(gè)C原子的硬脂酸鏈，12-24個(gè)C原子的脂肪酸對(duì)應(yīng)的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，它們的混合物或經(jīng)抗體、多肽靶向修飾的衍生物； S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉(zhuǎn)變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩沖液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液； S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內(nèi)空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分?jǐn)?shù)為0-90% ;以及 S4震蕩形成含氫氣微泡水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂為I，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷脂為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物，其中1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿的摩爾比百分?jǐn)?shù)為85-90 %，并且其中聚乙二醇酯選自聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質(zhì)酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟SI還包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水性緩沖液為磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度為0.5_15mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氫氣混合氣體為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮?dú)?，或它們的混合物的混合氣體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于,所述氫氣混合氣體為氫氣與三氟丙燒的混合氣體，并且氫氣與三氟丙烷的體積比為1: 1-3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4通過(guò)機(jī)械震蕩、探頭式細(xì)胞破碎機(jī)超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法制備得到的含氫氣微泡水溶液，其特征在于，所述含氫氣微泡水溶液中的氫氣含量大于50ul/ml。
11.權(quán)利要求10所述的含氫氣微泡水溶液在制備抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化，并且所述藥物同時(shí)具有超聲造影的功能。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物通過(guò)靜脈注射，或靜脈輸注給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物的含氫氣微泡可通過(guò)超聲`探頭控制釋放。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含氫氣藥物新劑型。通過(guò)使用磷脂包裹，將氫氣制成含氫氣微泡水溶液，大大提高了溶液中氫氣的含量、濃度可控，且更加穩(wěn)定。此外，由于采用微泡技術(shù)，使得到的含氫氣微泡水溶液還可以用作超聲造影劑，具有多重功能效果。
文檔編號(hào)A61K33/00GK103099780SQ20121053311
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者鄭海榮, 嚴(yán)飛, 靳巧鋒, 楊偉, 鄧志婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院