專利名稱：一種治療肺曲霉病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，具體地說，涉及一種治療肺曲霉病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
肺曲霉菌病(Pulmonary aspergillosis, PA)是臨床上較少見的一種肺部感染疾病。目前，隨著抗生素、激素、抗癌藥物的廣泛應(yīng)用和診斷技術(shù)的不斷提高，肺曲霉菌病的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。曲霉菌(asperigillus，ASP)在免疫抑制患者中已成為僅次于白色念珠菌的重要致病真菌，且已成為首要的致死性真菌。ASP屬于囊菌綱真正子囊菌亞綱。廣泛存在于潮濕環(huán)境。在350多種曲霉菌中有7種常常造成人類感染，即煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、稻曲霉、雜色曲霉、土曲霉和巢曲霉。在諸多曲霉屬中，95%以上的肺曲霉菌病是由煙曲霉所致，其次是黃曲霉菌。
肺曲霉菌病很少為原發(fā)病，絕大多數(shù)繼發(fā)于慢性肺部疾病和全身性疾病及免疫缺陷患者。好發(fā)部位為右肺多于左肺，上肺葉多于下肺葉，因機(jī)體免疫狀態(tài)和基礎(chǔ)肺疾病不同分為侵襲性肺曲霉菌病(Invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、過敏性支氣管肺曲霉菌病(Allergic bron-chopulmonary aspergillosis, ΑΒΡΑ)和由月市曲霉菌球(pulmonary aspergilloma)所致的肺曲霉菌病。
目前臨床上肺曲霉菌病的治療主要采用抗菌藥物，首選兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬爭(zhēng)等。但臨床上的治療往往忽視了對(duì)曲霉菌變應(yīng)原引起的變態(tài)反應(yīng)的治療。 在部分肺曲霉菌患者中，煙曲霉霉菌SlgE水平能達(dá)到六級(jí)以上(>100IU/ml)。常規(guī)抗真菌藥物和新型 抗真菌藥物只能抑制曲霉菌的生長(zhǎng)，并不能消除和降低曲霉菌變應(yīng)原引起變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)體損害和臨床癥狀。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的治療肺曲霉病的藥物組合物。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種治療肺曲霉病的藥物組合物，所述藥物組合物的有效成分為肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗和抗真菌劑。
前述藥物組合物中，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗為煙曲霉變應(yīng)原疫苗、黑曲霉變應(yīng)原疫苗、黃曲霉變應(yīng)原疫苗、稻曲霉變應(yīng)原疫苗、雜色曲霉變應(yīng)原疫苗、土曲霉變應(yīng)原疫苗或巢曲霉變應(yīng)原疫苗中的一種或多種。優(yōu)選為煙曲霉變應(yīng)原疫苗和黃曲霉變應(yīng)原疫苗。
前述藥物組合物中，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗任選包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體，如甘露醇、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、人血白蛋白、氫氧化鋁、L-酪氨酸、磷酸鈣、硫酸鎂、MPL等。
前述藥物組合物中，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗為含氫氧化鋁佐劑或酪氨酸佐劑的變應(yīng)原疫苗。
前述藥物組合物中，所述抗真菌劑為兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑或卡泊芬爭(zhēng)中的一種或多種。其中，所述兩性霉素B為脫氧膽酸鹽形式或脂質(zhì)體制劑。
前述藥物組合物中，制備所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗的方法包括以下步驟菌體培養(yǎng)、收獲、滅活、脫脂、蛋白提取、純化、脫毒和凍干。具體為在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺曲霉菌， 離心收集菌體，用70 75%乙醇滅活，滅活后真空干燥，干燥后的菌體用丙酮反復(fù)脫脂幾次，直至丙酮揮發(fā)完全。然后將脫脂干燥后的菌體用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過180 200目篩，過篩后即為肺曲霉菌變應(yīng)原原料，-20°C保存。按1:10 50 (g:mL)的投料比加入碳酸氫鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液中，2 8°C下攪拌提取12 48h，提取液于8000rpm，4°C離心25min,收集上清,上清依次經(jīng)8 μ m、0. 8 μ m、0. 45 μ m和0· 22 μ m的濾膜過濾,將過濾后的液體經(jīng)5kD膜超濾，直至濾出液為無色，濃縮至原體積的1/3，使蛋白濃度不低于O.1mg/ ml (Bradford),向其中加入10 150 μ g/ml甲醒,攪拌后于2 8°C放置12 48h,然后用5kD膜超濾(5 10倍體積的緩沖液)，凍干。優(yōu)選地，向甲醛處理后的蛋白原液中加入 2%的甘露醇，O. 03% 2%HSA，分裝，每瓶1ml，凍干。
本發(fā)明的肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗優(yōu)選為含氫氧化鋁佐劑的變應(yīng)原疫苗，將甲醛脫毒超濾后的肺曲霉菌變應(yīng)原和氫氧化鋁混合，2 8°C攪拌過夜，鋁含量為O. 8mg 1. 25mg/ ml ο
本發(fā)明的肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗優(yōu)選為含酪氨酸佐劑的變應(yīng)原疫苗，將甲醛脫毒超濾后的肺曲霉菌變應(yīng)原和酪氨酸混合，酪氨酸含量為10 40mg/ml。
本發(fā)明還提供所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療由真菌感染所致疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療肺曲霉病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的治療肺曲霉病的藥物組合中的肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗使用方法包括劑量遞增和維持劑量?jī)蓚€(gè)階段，維持劑量每針O. 5ml。肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗的使用方法為用溶媒溶解肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗，將Iml肺曲霉菌變應(yīng)原注射液加入到9ml溶媒中配制稀釋液 10'梯度稀釋，配制10'10'10'10'Kr6的稀釋液。從稀釋液Kr6開始注射，每個(gè)濃度初始注射劑量為O. 1ml，直至注射劑量達(dá)1ml，間隔3天注射一次，每個(gè)濃度共注射10次。完成劑量遞增注射后，進(jìn)入到維持劑量階段，每次注射O. 5ml,間隔3天注射一次，注射I個(gè)月后，間隔I周注射一次，一年后間隔4周注射一次，治療3年。
肺曲霉囷感染人體后的臨床癥狀王要包括侵襲性肺曲霉囷病 (Invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、過敏性支氣管肺曲霉菌病(Allergic bron-chopulmonary aspergillosis, ΑΒΡΑ)和由月市曲霉菌球(pulmonary aspergilloma)所致的肺曲霉菌病。肺曲霉菌經(jīng)氣道侵入肺組織，伴隨支氣管炎癥等一些癥狀，沿血行播散， 菌體在肺內(nèi)空洞處生長(zhǎng)，菌絲在肺空洞和空腔內(nèi)蔓延，血內(nèi)肺曲霉菌特異性IgE升高，發(fā)生變態(tài)型支氣管炎癥。現(xiàn)臨床上對(duì)于肺曲霉菌病的治療采用抗真菌劑抑制真菌的生長(zhǎng)，但忽略肺曲霉菌在體內(nèi)的變態(tài)反應(yīng)，臨床效果并不佳。本發(fā)明治療肺曲霉菌病的藥物組合采用抗真菌劑和煙曲霉菌變應(yīng)原疫苗的聯(lián)合，不僅抑制了肺曲霉菌在肺內(nèi)的生長(zhǎng)，而且緩解和消除了肺曲霉菌引起的變態(tài)反應(yīng)支氣管炎癥，從感染機(jī)制入手，全方位的治療肺曲霉菌病。
本發(fā)明的一種治療肺曲霉病的藥物組合物，首次將抗真菌感染的藥物(抗真菌劑) 和治療由真菌弓丨起的變態(tài)反應(yīng)疫苗(肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗)聯(lián)合使用，在有效抑制曲霉菌生長(zhǎng)的同時(shí)，還能消除和降低曲霉菌變應(yīng)原引起變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)體損害和臨床癥狀。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實(shí)施例1肺曲霉菌病患者血清學(xué)診斷
隨機(jī)抽取2008年2月 2011年12月北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科確診的肺曲霉菌病人，血清用Phadia UniCAP診斷系統(tǒng)，使用煙曲霉菌變應(yīng)原包被試劑診斷。
在203例確診的肺曲霉菌病人中，經(jīng)血清學(xué)診斷，煙曲霉陽性病人為193例，3級(jí)以上共有128例。
實(shí)施例2煙曲霉菌變應(yīng)原凍干疫苗的制備
1.1菌體培養(yǎng)和收獲
將煙曲霉菌種從_80°C冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間72h，再接種到蛋白胨-葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48h。刮取斜面培養(yǎng)基上的煙曲霉菌菌胎接種到IL三角瓶中的液體培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)50天。液體培養(yǎng)基配方為蔗糖30g、硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂O. 5g、氯化鉀O. 5g、硫酸亞鐵 O. Olg、注射用水1000ml。培養(yǎng)結(jié)束后，將三角瓶中的液體倒去，收集菌體，用70 75%乙醇滅活，滅活后在真空干燥器中干燥。
1. 2 脫脂
干燥后的菌體稱重158g，按1:5 (g:mL)向菌體中加入丙酮，反復(fù)脫脂幾次，直至脫脂丙酮上清澄清無色。脫脂后的菌體在真空干燥器中干燥，直至沒有丙酮的味道。將脫脂干燥后的菌體用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，過篩后即為煙曲霉變應(yīng)原原料，-200C 保存。
1. 3蛋白提取
用50mM 磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4 6. 61g、NaH2PO4 O. 402g、H2OlOOOml)按 1:25 (gmL)的投料比，將煙曲霉變應(yīng)原原料加入緩沖液中，2 8°C條件下攪拌提取24h。提取液在8000rpm,4°C的條件下離心25min。將離心后的上清依次經(jīng)8 μ m、0. 8 μ m、0. 45 μ m和 O. 22 μ m的濾膜過濾，將過濾后的液體經(jīng)5kD膜超濾，直至濾出液為無色，濃縮至原體積的 1/3,使蛋白濃度不低于O. lmg/ml (Bradford)。
1. 4 脫毒
向蛋白原液中加入50 μ g/ml甲醒,于2 8°C放置12 48h,然后用5kD膜超濾 (8倍體積緩沖液)去除甲醛。
1. 5分裝凍干
向甲醛處理后的蛋白原液中加入2%的甘露醇，1%HSA,分裝，每瓶1ml，凍干。
實(shí)施例3煙曲霉菌變應(yīng)原含氫氧化鋁佐劑疫苗的制備
1.1菌體培養(yǎng)和收獲
將煙曲霉菌種從_80°C冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間72h，再接種到蛋白胨-葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48h。刮取斜面培養(yǎng)基上的煙曲霉菌菌胎接種到IL三角瓶中的液體培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)50天。液體培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g、硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂O. 5g、氯化鉀O. 5g、硫酸亞鐵O. Olg、注射用水1000ml。培養(yǎng)結(jié)束后，將三角瓶中的液體倒去，收集菌體，用70 75% 乙醇滅活，滅活后在真空干燥器中干燥。
1. 2 脫脂
干燥后的菌體稱重138g，按1:5 (g:mL)向菌體中加入丙酮，反復(fù)脫脂幾次，直至脫脂丙酮上清澄清無色。脫脂后的菌體在真空干燥器中干燥，直至沒有丙酮的味道。將脫脂干燥后的菌體用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過180 200目篩，過篩后即為煙曲霉變應(yīng)原原料，-20°C保存。
1. 3蛋白提取
用50mM 磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4 6. 61g、NaH2PO4 O. 402g、H2OlOOOml)按 1:25 (gmL)的投料比，將煙曲霉變應(yīng)原原料加入緩沖液中，2 8°C條件下攪拌提取24h。提取液在8000rpm,4°C的條件下離心25min。將離心后的上清依次經(jīng)8 μ m、0. 8 μ m、0. 45 μ m和 O. 22 μ m的濾膜過濾，將過濾后的液體經(jīng)5kD膜超濾，直至濾出液為無色，濃縮至原來體積的1/3，蛋白濃度不低于O. lmg/ml (Bradford)。
1. 4 脫毒
向蛋白原液中加入50 μ g/ml甲醒,于2 8°C放置12 48h,然后用5kD膜超濾 (8倍體積緩沖液)去除甲醛。
1. 5半成品配制
將煙曲霉變應(yīng)原原液和等體積鋁含量為2. 5mg/ml的氫氧化鋁混合后4°C攪拌過夜。分裝，每瓶5ml。
實(shí)施例4煙曲霉菌變應(yīng)原含酪氨酸佐劑疫苗的制備
1.1菌體培養(yǎng)和收獲
將煙曲霉菌種從_80°C冰箱取出，在蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間72h，再接種到蛋白胨-葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48h。刮取斜面培養(yǎng)基上的煙曲霉菌菌胎接種到IL三角瓶中的液體培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)50天。液體培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g、硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂O. 5g、氯化鉀O. 5g、硫酸亞鐵O. Olg、注射用水1000ml。培養(yǎng)結(jié)束后，將三角瓶中的液體倒去，收集菌體，用70 75% 乙醇滅活，滅活后在真空干燥器中干燥。
1. 2 脫脂
干燥后的菌體稱重166g，按1:5 (g:mL)向菌體中加入丙酮，反復(fù)脫脂幾次，直至脫脂丙酮上清澄清無色。脫脂后的菌體在真空干燥器中干燥，直至沒有丙酮的味道。將脫脂干燥后的菌體用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過180 200目篩，過篩后即為煙曲霉變應(yīng)原原料，-20°C保存。
1. 3蛋白提取
用50mM 磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4 6. 61g、NaH2PO4 O. 402g、H2OlOOOml)按 1:25 (gmL)的投料比，將煙曲霉變應(yīng)原原料加入緩沖液中，2 8°C條件下攪拌提取24h。提取液在8000rpm,4°C的條件下離心25min。將離心后的上清依次經(jīng)8 μ m、0. 8 μ m>0. 45 μ m和O.22 μ m的濾膜過濾，將過濾后的液體經(jīng)5kD膜超濾，直至濾出液為無色，濃縮至原來體積的1/3，蛋白濃度不低于O. lmg/ml (Bradford)。
1. 4 脫毒
向蛋白原液中加入50 μ g/ml甲醛，于2 8°C放置12 48h，然后用5kD膜超濾 8倍體積緩沖液去除甲醛。
1. 5半成品配制
將L-酪氨酸用3. 9M鹽酸溶解配制為24%的酪氨酸酸溶液。向15L10000AU/ml煙曲霉變應(yīng)原原液中加入IM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液5L，在攪拌的條件下緩慢滴入 L-酪氨酸酸溶液和3. 2M NaOH維持pH7. 0-8. O。離心沉淀，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液洗滌沉淀兩次，向沉淀中加入PBS 30L溶解。分裝，每瓶5ml。
實(shí)施例5煙曲霉變應(yīng)原安全性檢驗(yàn)
將疫苗成品按每只小鼠O. 5ml，腹腔注射體重為18_20g的小鼠，共40只，一個(gè)月內(nèi)應(yīng)無死亡，小鼠體重增加應(yīng)等同于正常生理鹽水對(duì)照組，結(jié)果見表I。
表I煙曲霉變應(yīng)原疫苗安全性檢驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種治療肺曲霉病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的有效成分為肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗和抗真菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗為煙曲霉變應(yīng)原疫苗、黑曲霉變應(yīng)原疫苗、黃曲霉變應(yīng)原疫苗、稻曲霉變應(yīng)原疫苗、雜色曲霉變應(yīng)原疫苗、土曲霉變應(yīng)原疫苗或巢曲霉變應(yīng)原疫苗中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗任選包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗為含氫氧化鋁佐劑或酪氨酸佐劑的變應(yīng)原疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗真菌劑為兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑或卡泊芬爭(zhēng)中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述兩性霉素B為脫氧膽酸鹽形式或脂質(zhì)體制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，制備所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗的方法包括以下步驟菌體培養(yǎng)、收獲、滅活、脫脂、蛋白提取、純化、脫毒和凍干。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，制備所述肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗的方法為在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺曲霉菌，離心收集菌體，用70 75%乙醇滅活，滅活后真空干燥，干燥后的菌體用丙酮反復(fù)脫脂幾次，將脫脂后的菌體真空干燥，直至丙酮揮發(fā)完全，然后粉碎菌體，過180 200目篩，然后按1:10 50 (g:mL)的投料比加入碳酸氫鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液中，2 8°C下攪拌提取12 48h,提取液于8000rpm,4°C離心25min,收集上清，上清依次經(jīng)8 ii m、0. 8 ii m、0. 45 ii m和0. 22 ii m的濾膜過濾，將過濾后的液體經(jīng)5kD膜超濾，直至濾出液為無色，濃縮至原體積的1/3，使蛋白濃度不低于0. lmg/ml，向其中加入10 150ii g/ml甲醒,攪拌后于2 8°C放置12 48h,然后用5kD膜超濾,凍干。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療由真菌感染所致疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療肺曲霉病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療肺曲霉病的藥物組合物，其有效成分為肺曲霉菌變應(yīng)原疫苗和抗真菌劑。使用本發(fā)明的藥物組合物治療肺曲霉病，在有效抑制曲霉菌生長(zhǎng)的同時(shí)，還能消除和降低曲霉菌變應(yīng)原引起變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)體損害和臨床癥狀。
文檔編號(hào)A61K38/12GK102988988SQ20121054009
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者白彩明, 姜敏, 裴瀟竹, 湯承祁, 牛占坡, 馬博晨 申請(qǐng)人:北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司