Cik細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CIK細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述制備方法，包括：構(gòu)建正常健康人單個核細(xì)胞庫，利用單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞。本發(fā)明獲得的CIK細(xì)胞，既具有強(qiáng)大殺傷腫瘤細(xì)胞能力，也具有極大的擴(kuò)增能力，且單個核細(xì)胞庫的構(gòu)建及誘導(dǎo)CIK細(xì)胞成本低廉，可用于治療腫瘤。
【專利說明】CIK細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種CIK細(xì)胞(Cytokine-1nducedkiller cells)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]外科手術(shù)、化療、放療是治療惡性腫瘤的常規(guī)手段，這些方法均有一定的侵襲性，會損傷正常細(xì)胞，副作用大。腫瘤細(xì)胞免疫治療，能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而不會損傷正常細(xì)胞，副作用小，因而免疫治療一直是抗腫瘤研究熱點之一。
[0003]細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)是1991年Schmidt_wolf率先發(fā)現(xiàn)的，他采用人外周血單個核細(xì)胞，在體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增，獲得的一群非MHC限制的異質(zhì)細(xì)胞，具有強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞能力，其主要表面標(biāo)志是CD3+CD56+。
[0004]CIK細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞相比，具有增值速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、副作用小、對正常骨髓造血功能影響輕微等優(yōu)點。
[0005]近20年來，國內(nèi)外大量論文報道了自體CIK細(xì)胞治療惡性腫瘤病人的結(jié)果。2010年，有學(xué)者報道了 75例胃癌病人接受自體CIK細(xì)胞治療聯(lián)合化療，中位生存時間為49個月，而對照組(單純使用化療)中位生存時間僅為27個月，即采用化療聯(lián)合CIK治療后，腫瘤病人生存期延長I倍【孔炯，蔣敬庭，吳昌平.CIK細(xì)胞治療胃癌者的相關(guān)臨床因素對其預(yù)后的影響.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15 (4):295-299】。2011年，有學(xué)者評價了 119例腎細(xì)胞癌患者接受自體CIK細(xì)胞治療的結(jié)果，結(jié)果顯示，CIK細(xì)胞治療能顯著改善II1、IV期腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后【張靜，劉亮，于津浦.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療腎細(xì)胞癌臨床療效的評價.中國腫瘤生物治療雜志2011`，18 (5):480-484】。
[0006]但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細(xì)胞功能減弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細(xì)胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細(xì)胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種CIK細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用單個核細(xì)胞庫及其構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明通過利用構(gòu)建的正常健康人單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞，獲得的CIK細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3+⑶56+細(xì)胞的比例較高，并且具有較佳的治療腫瘤效果。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的CIK細(xì)胞的制備方法，包括步驟:
[0009]第一步，構(gòu)建正常健康人單個核細(xì)胞庫，其構(gòu)建步驟包括:
[0010](I)取正常健康人外周血，經(jīng)檢測后，收集外周血的單個核細(xì)胞部分，并對單個核細(xì)胞計數(shù)；
[0011]其中，所述檢測包括:AB0/Rh血型檢測和病原微生物免疫檢測；病原微生物免疫檢測包括:梅毒螺旋體血清學(xué)試驗檢測、HIV抗體檢測、丙型肝炎抗體檢測、乙型肝炎表面抗原檢測、無菌試驗檢測；[0012]收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法包括:方法A和方法B ;其中，方法A，包括步驟:
[0013]I)經(jīng)檢測后的正常健康人外周血中，加入I~1.5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；
[0014]其中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和IMDM培養(yǎng)液；
[0015]2)將步驟I)獲得的血液稀釋液輕輕地加入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上，注意不要破壞界面；
[0016]其中，血液稀釋液與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為2:1;
[0017]3)離心，收集中間層，獲得單個核細(xì)胞；其中，離心的轉(zhuǎn)速為1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為15~20分鐘，優(yōu)選為2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為20分鐘。本步驟中，經(jīng)離心，血液會分層，紅細(xì)胞位于底層，單個核細(xì)胞位于中間層。
[0018]方法B，包括步驟:(I)檢測后的正常健康人，經(jīng)采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集正常健康人的外周血單個核細(xì)胞。
[0019](2)將步驟(1)收集的外周血的單個核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細(xì)胞；其中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘。
[0020](3)在單個核細(xì)胞中加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)程序降溫(如降溫至-80°C)后，置于液氮中冷凍，并建立可供 檢索的細(xì)胞信息檔案，從而構(gòu)建出正常人的單個核細(xì)胞庫；
[0021]其中，冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比)DMS0的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由70% (體積百分比)RPMI1640培養(yǎng)液和20% (體積百分比)FBS (胎牛血清)所構(gòu)成。
[0022]第二步，利用單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞，其步驟包括:
[0023]解凍復(fù)蘇凍存于單個核細(xì)胞庫中的單個核細(xì)胞后，該細(xì)胞在Y干擾素、抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2的誘導(dǎo)下，或在Y干擾素、抗人CD3單克隆抗體、重組人IL-2和重組人IL-1的誘導(dǎo)下，或在重組人纖維蛋白片段(可用市售產(chǎn)品)、抗人CD3單克隆抗體、Y干擾素、重組人IL-2的誘導(dǎo)下，或在重組人纖維蛋白片段、抗人CD3單克隆抗體、Y干擾素、重組人IL-2和重組人IL-1的誘導(dǎo)下，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)13~21天，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，從而獲得CIK細(xì)胞。
[0024]其中，對于第二步的利用單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞，其具體方法為采用方法I或方法II進(jìn)行操作，具體如下:
[0025]方法I包括步驟:
[0026]①取單個核細(xì)胞庫中的單個核細(xì)胞，解凍復(fù)蘇
[0027]取凍存于液氮的單個核細(xì)胞庫中的單個核細(xì)胞，于37°C水浴中，快速解凍后，加入完全培養(yǎng)基，離心，棄上清，獲得凍存復(fù)蘇的單個核細(xì)胞沉淀物；
[0028]其中，完全培養(yǎng)基，包括:含10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0029]離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘；
[0030]②在凍存復(fù)蘇的單個核細(xì)胞中，按照I X 106/mL細(xì)胞，加入含500~2000IU/mLY干擾素(Y-1FN)的完全培養(yǎng)基，放入37°C、5% (濃度百分比)二氧化碳的培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng);
[0031]③步驟②的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/ml抗人CD3單克隆抗體和500~2000IU/ml重組人IL-2，放入37°C、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13天~21天，從而獲得CIK細(xì)胞。步驟③的繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)中，可每2~3天用含500~2000IU/ml重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞大量擴(kuò)增，如誘導(dǎo)19天后，最大可擴(kuò)增600多倍，如果以3 X IO7細(xì)胞接種，可獲得1.8X101Q以上的CIK細(xì)胞。
[0032]方法II包括步驟:
[0033]按照I X IOVmL復(fù)蘇的單個核細(xì)胞，加入到包被有I~10 μ g/ml重組人纖維蛋白片段和I~10 μ g/ml抗人⑶3單克隆抗體的培養(yǎng)板中，然后，加入500~2000IU/ml Y干擾素和500~2000IU/ml重組人IL-2開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，并用含500~2000IU/ml重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/ml重組人IL-2和100~500IU/ml重組人IL-1的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13~21天，獲得CIK細(xì)胞。
[0034]所述利用所構(gòu)建的單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞中，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13天~21天，如誘導(dǎo)培養(yǎng)19天后，可終止培養(yǎng)。
[0035]另外，本發(fā)明公開了一種如上所述的CIK細(xì)胞制備方法所制備的CIK細(xì)胞。
[0036]再者，本發(fā)明又公開了一種細(xì)胞制劑，包括:上述的制備的CIK細(xì)胞。
[0037]同時，本發(fā)明還公開了一種上述CIK細(xì)胞的應(yīng)用，如該CIK細(xì)胞可在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0038]本發(fā)明獲得的CIK細(xì)胞，既具有強(qiáng)大殺傷腫瘤細(xì)胞能力，也具有極大的擴(kuò)增能力。正常健康人事先存儲外周血`單個核細(xì)胞于細(xì)胞庫中，待將來患有腫瘤后，從細(xì)胞庫中取出，復(fù)蘇后，誘導(dǎo)大量擴(kuò)增成為CIK細(xì)胞，用于自身腫瘤的治療；也可根據(jù)HLA配型，提供他人治療腫瘤。本發(fā)明的單個核細(xì)胞庫的構(gòu)建及誘導(dǎo)CIK細(xì)胞成本低廉，富有應(yīng)用前景，如可用于治療腫瘤。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]下面結(jié)合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
[0040]圖1是經(jīng)凍存的健康人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的光鏡下的CIK細(xì)胞形態(tài)圖；其中，A為誘導(dǎo)第O天(光鏡放大100倍)，B為誘導(dǎo)第I天(光鏡放大200倍)，C為誘導(dǎo)第2天(光鏡放大100倍)，D為誘導(dǎo)第7天(光鏡放大100倍)。
[0041]圖2是經(jīng)凍存的健康人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞生長曲線圖。
[0042]圖3是經(jīng)凍存的健康人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性圖。
[0043]圖4是流式細(xì)胞儀檢測圖；其中，A為誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞前；B為誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞的第19天。
【具體實施方式】
[0044]以下實施例中，所用的原料或試劑除特別說明外，均為市售可得。
[0045]另外，以下實施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10% (體積百分比)FBS的RPMI1640培養(yǎng)液；冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比)DMS0的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70% (體積百分比)RPMI1640培養(yǎng)液和20% (體積百分比)FBS (胎牛血清)所構(gòu)成。
[0046]實施例1
[0047]一、單個核細(xì)胞庫的構(gòu)建
[0048](I)取正常人外周血30ml，經(jīng)嚴(yán)格檢測程序(流式細(xì)胞儀⑶3、⑶4、⑶8、⑶3⑶56檢測，ABO/Rh血型檢測，梅毒螺旋體血清學(xué)試驗檢測，HIV抗體檢測，丙型肝炎抗體檢測，乙型肝炎表面抗原檢測，無菌試驗等)，確定安全性后，加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)液(Invitrogen公司)，充分混勻。
[0049](2)將步驟(1)獲得的倍比稀釋的外周血60ml，加入到30ml淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)(比重1.077)的界面上(不要破壞界面)，以2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取中間層——富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20ml。取少量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99%。
[0050](3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清液，沉淀為單個核細(xì)胞。以I X IO7個細(xì)胞中，加入ImL冷凍保護(hù)劑，放入凍存管中密封，并放入含有異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)凍存盒內(nèi)。
[0051](4)將凍存盒置于4°C冰箱放置15分鐘，然后放入-80°C冰箱過夜。
[0052](5)次日，將細(xì)胞放入_196°C液氮中長期保存。液氮罐采用Thermofisher公司。留取小部分細(xì)胞儲存在_80°C冰箱里，作為庫存產(chǎn)品信息的復(fù)查樣本。所有樣本信息包括:姓名，地址，聯(lián)系方式，流式細(xì)胞儀檢測信息，ABO/Rh血型信息，傳染病檢測信息，無菌試驗信息等輸入電腦，建立完整的數(shù)據(jù)檔案備詢。
[0053]至此，單個核細(xì)胞儲存庫建成。
[0054]二、解凍單個核細(xì)胞，誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞
[0055](I)根據(jù)資料信息，在單個核細(xì)胞庫中，查詢到相應(yīng)的凍存的單個核細(xì)胞。取凍存的單個核細(xì)胞，放入37°C水浴中，快速融化，復(fù)蘇細(xì)胞。
[0056](2)按照IXlO7單個核細(xì)胞中，加入5ml完全培養(yǎng)基，充分混勻，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
[0057](3)在離心獲得的下層細(xì)胞沉淀中，加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/ml。
[0058](4)按照 lX106/ml 細(xì)胞，加入 1000IU/ml y -1FNCPeprotech 公司)，置 37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0059]其中，剛復(fù)蘇的健康人外周血單個核細(xì)胞呈懸浮生長，大小均一，折光性一致(如圖1-A所示)。
[0060](5)步驟(4)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入I μ g/ml抗人⑶3單克隆抗體(Biolegend 公司)和 1000IU/mL 重組人 IL-2 (Peprotech 公司)，置 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞鑒定方法:細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，CD3+CD56+雙陽性標(biāo)志細(xì)胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細(xì)胞能力增強(qiáng)(非MHC限制性)。
[0061]其中，單個核細(xì)胞中加入Y-1FN，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第I天)，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活化透亮，折光性強(qiáng)(如圖1-B所示)。在單個核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天)，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細(xì)胞明顯增大(如圖ι-c所示)。[0062](6)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含1000IU/HiL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測CD3、⑶56、⑶4、⑶8陽性細(xì)胞數(shù)，檢測CIK細(xì)胞殺傷K562腫瘤細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)活性。
[0063](7)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0064]其中，在誘導(dǎo)第7天時，肉眼下即可觀察到白色斑點，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞集落明顯增多、增大，大集落成黑團(tuán)，看不清細(xì)胞形態(tài)，周邊游離細(xì)胞飽滿折光性好，大小形態(tài)各異(如圖1-D所不)。
[0065]三、按照以上方法進(jìn)行誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞的相應(yīng)檢測結(jié)果
[0066]1、檢測CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)
[0067]檢測方法為:按I X IO6單個核細(xì)胞/孔，接種在24孔板內(nèi)，按照上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞和細(xì)胞換液，第7天開始換成25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，對誘導(dǎo)的第O、
4、7、10、13、16、19天，取11^樣本，通過血細(xì)胞計數(shù)儀(日本光電公司，1^1(-6410?)，進(jìn)行(:11(細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)檢測，取5次試驗結(jié)果的平均值，繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示。
[0068]其中，CIK細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進(jìn)入快速增長期，16天后增殖速度趨緩，第19天CIK細(xì)胞最高增殖622倍，最低271倍，平均增殖462.2倍。
[0069]2、CIK細(xì)胞的殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性的檢測
[0070]經(jīng)凍存的健康人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞的殺傷K562腫瘤細(xì)胞活性的檢測方法為:取對數(shù)生長的K562腫瘤細(xì)胞，用含有體積百分比為10%FBS的MDM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5X 104/mL,每孔100 μ L,鋪于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔。取第7、10、
13、16、19天CIK細(xì)胞，及未經(jīng)培養(yǎng)的單個核細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞數(shù)為
IX106/mL，取100 μ L加入96孔板中，效靶比(即CIK細(xì)胞:Κ562腫瘤細(xì)胞)20:1，設(shè)空白對照組、效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì)胞對照組，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時后，加入20 μ L CCK-8 (日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品)，繼續(xù)孵育5小時，顯黃色，采用Thermofisher公司multiscanFC酶聯(lián)儀,雙波長,參比波長620mm、檢測波長450mm檢測OD值。取4次試驗結(jié)果的平均值，繪制殺傷率曲線，結(jié)果如圖3所示。
[0071]殺傷率的計算公式如下:
[0072]
計算殺傷率(%) = (1-效靶細(xì)胞組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值/靶細(xì)胞OD值-空白對照組OD值）X100%
[0073]其中，
[0074]效靶細(xì)胞組OD值為:CIK細(xì)胞和K562靶細(xì)胞組檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D 值。
[0075]效應(yīng)細(xì)胞組OD值為:單純CIK細(xì)胞檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0076]靶細(xì)胞組OD值為:K562靶細(xì)胞組檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0077]空白對照組OD值為:完全培養(yǎng)基和10%FBS的IMDM培養(yǎng)液混合后，檢測的波長450nm0D 值一波長 620nm0D 值。
[0078]由圖3可知，凍存后的單個核細(xì)胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562活性最高，平均達(dá)95.3%(范圍95.3±4.2%)，此后逐步下降，第19天最低，平均82%(范圍 82 ±10%)。
[0079]3、流式細(xì)胞儀進(jìn)行誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞檢測
[0080]采用流式細(xì)胞儀(BD公司FACS Calibur)，對誘導(dǎo)前的外周血單個核細(xì)胞和誘導(dǎo)后的第19天進(jìn)行⑶3、⑶4、⑶8、⑶3⑶56檢測，結(jié)果分別如圖4-A、4-B所示。其中，誘導(dǎo)CIK細(xì)胞前，外周血單個核細(xì)胞的CD3+為52.84%, CD4+為36.58%, CD8+為24.98%, CD3+CD56+為
1.35% ;誘導(dǎo) CIK 細(xì)胞的第 19 天，CD3.為 98.91%, CD4.為 1.56%, CD8+ 為 91.37%, CD3+CD56+為 63.72%。
[0081]4、CIK細(xì)胞表型測定
[0082]用pH7.4的IXPBS調(diào)整細(xì)胞密度至lX106/mL，加入到流式細(xì)胞檢測管中，200 μ L/管，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體(BD公司)，置暗處，4°C標(biāo)記20分鐘，pH7.4的IXPBS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，1%甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀檢測。取5次試驗結(jié)果的平均值，結(jié)果見表1。
[0083]從表1可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的延長，CIK主要效應(yīng)細(xì)胞⑶3+⑶56+雙陽性細(xì)胞所占比例大幅上升，第19天達(dá)到均數(shù)為56.4%,范圍為49.5%-63.3%。
[0084]表1凍存的健康人單個核細(xì)胞誘導(dǎo)CIK細(xì)胞表型的變化(X ± S，%)
【權(quán)利要求】
1.一種CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括步驟: 第一步，構(gòu)建正常健康人單個核細(xì)胞庫，其構(gòu)建步驟包括: (1)取正常健康人外周血，經(jīng)檢測后，收集外周血的單個核細(xì)胞部分，并對單個核細(xì)胞計數(shù)； (2)將步驟(1)收集的外周血的單個核細(xì)胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細(xì)胞； (3)在單個核細(xì)胞中加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)程序降溫后，置于液氮中冷凍，并建立供檢索的細(xì)胞信息檔案，從而構(gòu)建出正常人的單個核細(xì)胞庫； 第二步，利用單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞，其步驟包括: 解凍復(fù)蘇凍存于單個核細(xì)胞庫中的單個核細(xì)胞后，該細(xì)胞在Y干擾素、抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2的誘導(dǎo)下，或在Y干擾素、抗人⑶3單克隆抗體、重組人IL-2和重組人IL-1，或在重組人纖維蛋白片段、抗人CD3單克隆抗體、Y干擾素、重組人IL-2的誘導(dǎo)下，或在重組人纖維蛋白片段、抗人CD3單克隆抗體、Y干擾素、重組人IL-2和重組人IL-1的誘導(dǎo)下，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)13~21天，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，獲得CIK細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，檢測包括:ABO/Rh血型檢測和病原微生物免疫檢測；其中，病原微生物免疫檢測包括:梅毒螺旋體血清學(xué)試驗檢測、HIV抗體檢測、丙型肝炎抗體檢測、乙型肝炎表面抗原檢測、無菌試驗檢測。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，收集外周血的單個核細(xì)胞部分的方法包括:方法A和方法B ； 其中，方法A包括步驟: 1)經(jīng)檢測后的正常健康人外 周血中，加入I~1.5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7.2 PBS緩沖液稀釋，充分混勻； 其中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和IMDM培養(yǎng)液； 2)將步驟I)獲得的血液稀釋液加入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上； 3)1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單個核細(xì)胞； 方法B包括步驟:檢測后的正常健康人，經(jīng)采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集正常健康人的外周血單個核細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘； 步驟(3)中，冷凍保護(hù)劑是含體積百分比為10%DMS0的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由體積百分比為70%RPMI1640培養(yǎng)液和體積百分比為20%FBS所構(gòu)成；程序降溫后，降溫至_80°C。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述第二步的利用單個核細(xì)胞庫誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞中，其具體方法為采用方法I或方法II進(jìn)行操作，其中， 方法I包括步驟: ①取單個核細(xì)胞庫中的單個核細(xì)胞，解凍復(fù)蘇； ②在復(fù)蘇的單個核細(xì)胞中，按照1\106/1^細(xì)胞，加入含500~2000幾/1^￥干擾素的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)； 其中，完全培養(yǎng)基，包括:含體積百分比為10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液； ③步驟②的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/ml抗人⑶3單克隆抗體和500~2000IU/ml重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13~21天，獲得CIK細(xì)胞； 方法II包括步驟: 按照I X IOfVmL復(fù)蘇的單個核細(xì)胞，加入到包被有I~10μ g/ml重組人纖維蛋白片段和I~10 μ g/ml抗人⑶3單克隆抗體的培養(yǎng)板中，然后，加入500~2000IU/ml Y干擾素和500~2000IU/ml重組人IL-2，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，并用含500~2000IU/ml重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/ml重組人IL-2和100~500IU/ml重組人IL-1的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13~21天，獲得CIK細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述步驟③的繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)中，每2~3天用含500~2000IU/ml重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/ml重組人IL-2和100~500IU/ml重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
7.—種CIK細(xì)胞，其特征在于，所述CIK細(xì)胞是由如權(quán)利要求1-6任一項所述的方法所制備的CIK細(xì)胞。
8.一種細(xì)胞制劑，其特征在于，包括:如權(quán)利要求7所述的CIK細(xì)胞。
9.一種如權(quán)利要求7所述的CIK細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于:所述CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用 。
【文檔編號】A61P35/00GK103865874SQ201210543662
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】仇志根 申請人:聯(lián)亙生物科技（上海）有限公司