專利名稱：鴨瘟病毒缺失gE基因轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的構(gòu)建方法，具體地說是一種鴨瘟病毒缺失gE基因轉(zhuǎn)移載體以及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
近年來我國水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，存欄量和出欄量長期保持世界第一的位置，到2010年僅肉鴨的出欄量就達(dá)到20. 84億只。但隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，各種疾病常導(dǎo)致鴨群大面積死亡，僅2010年因鴨群各種疾病累計造成直接和間接養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失50億元。鴨的多種常發(fā)疾病中，鴨瘟流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率高，病死率大，通常在90%以上，因此對水禽業(yè)發(fā)展危害極大。初步估計鴨瘟作為鴨群養(yǎng)殖的常見病多發(fā)病其常規(guī)預(yù)防和治療用藥在國內(nèi)每年至少擁有15億元銷售市場。目前，臨床上常用鴨瘟弱毒疫苗來預(yù)防鴨瘟疾病，并取得一定的臨床效果。但是弱毒疫苗的應(yīng)用帶來的副作用也相對比較突出，比如弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險、臨床難以區(qū)分野毒和疫苗毒、無法根除鴨瘟疾病等。因此，臨床急需開展鴨瘟基因工程標(biāo)記疫苗的研究來改進(jìn)上述疫苗的缺點(diǎn)，為徹底根除水禽業(yè)的鴨瘟疾病打下基礎(chǔ)。病原鴨痕病毒(Duck Plague Virus)屬于皰疫病毒科皰疫病毒屬中的濾過性的病毒。鴨瘟病毒的DNA具典型的皰疹病毒DNA的特征，大小約為150kb，兩端為末端重復(fù)序列，中間有內(nèi)部重復(fù)序列。囊膜蛋白為皰疹病毒的主要保護(hù)性抗原，它在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，以及病毒的成熟與釋放中均起重要的作用。皰疹病毒gE基因是皰疹病毒從視網(wǎng)膜、嗅覺上皮細(xì)胞、三叉神經(jīng)節(jié)侵入中樞神經(jīng)組織所必需的毒力基因，對皰疹病毒在體內(nèi)毒力表達(dá)、侵襲神經(jīng)和沿著神經(jīng)傳遞起著決定性的作用。皰疹病毒gE蛋白對于病毒感染及復(fù)制都是非必需的。皰疹病毒中，囊膜糖蛋白不僅介導(dǎo)病毒對靶細(xì)胞的感染而且還是被感染的宿主免疫系統(tǒng)識別的主要抗原 。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速發(fā)展，其中基因缺失疫苗和活載體疫苗成為當(dāng)前新型疫苗的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因缺失疫苗和活載體疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近動物自然感染的方式，多價苗還可以達(dá)到一針預(yù)防多病的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的載體，為包含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、BHG pA，以及鴨瘟病毒gE基因缺失序列的pdgE載體。上述的載體，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。本發(fā)明的載體，其構(gòu)建方法如下首先獲得含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、BHG pA的質(zhì)粒pCMV，將LacZ基因表達(dá)盒插入載體質(zhì)粒pCMV中得到載體質(zhì)粒pCMV_LacZ ;然后構(gòu)建含有g(shù)E基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的載體pdgE ;最后將含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亞克隆入載體pdgE內(nèi)，構(gòu)建成鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ。本發(fā)明構(gòu)建的載體用來制備預(yù)防鴨瘟的疫苗。本發(fā)明鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ是利用基因工程技術(shù)，利用PCR擴(kuò)增gE基因上、下游同源臂將其亞克隆在pGEM-T載體上構(gòu)建得到pdgE質(zhì)粒；利用基因重組獲得含有CMV啟動子-多克隆酶切位點(diǎn)MCS-BHG pA基因序列和LacZ基因的基因序列，并將其插入PdgE質(zhì)粒中構(gòu)建鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ ;獲得鴨瘟病毒gE基因缺失重組病毒株DPV/ gE—，同時保留了原有的抗原性。本發(fā)明制備的載體可用來構(gòu)建鴨瘟病毒gE基因缺失疫苗，為構(gòu)建重組鴨瘟病毒搭建物質(zhì)平臺。


圖1: gE基因同源臂引物應(yīng)用設(shè)計示意圖；圖2 :重組載體pCMV-LacZ的構(gòu)建示意圖；圖3 :gE基因缺失載體pdgE質(zhì)粒的構(gòu)建不意圖；圖4:鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所制備的載體中鴨瘟病毒gE基因的上下游同源臂分別為1046bp和1081bp ;含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列的長度為4146bp。本發(fā)明的核酸長度為6217bp。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明載體的制備及應(yīng)用效果進(jìn)行詳細(xì)的描述。一.設(shè)計引物(1)擴(kuò)增gE基因兼并引物gEl: 5’ ATGATGGTTACTTTTATATCTACAG 3’gE2: 5， TCAGATGCGGAAACTAGATT 3，(2) gE基因上游同源臂擴(kuò)增引物UpgEl: 5’ GGCGGAGCAACTGCCTTCAAG 3’UpgE2:5’TTGTCGACCCCGGGCGTACCAATTGTTGAGGTTCC 3’ (SmaI 和 Sail)(3) gE基因下游同源臂擴(kuò)增引物DogEl: 5’ GCGCCCGGGTCATGGATGTTGAACTAAT 3’ (SmaI)DogE2:5，CTTGTCGACCGCGTCGGTACGTAGCGTCAC 3， (Sail)擴(kuò)增gE基因及上、下游同源臂引物，引物應(yīng)用示意圖見附圖1。(4 )擴(kuò)增CMV+MCS+BHG pA基因序列引物gE3: 5， TTCCCGGGGTTGACATTGATTATTG 3， (SmaI)gE4: 5， AACCCGGGCCATAGAGCCCACCGCAT 3， (SmaI)(5)擴(kuò)增LacZ基因序列引物gE5: 5， AAGGTACCAGTTGATCCCGTCGTTTTA 3， (KpnI)gE6: 5， TTCTAGATTATTTTTGACACCAGACCAACTG 3， (XbaI)二.重組載體pCMV-LacZ的構(gòu)建重組載體pCMV-LacZ的構(gòu)建策略見附圖2。
1. pCMV序列的克隆利用擴(kuò)增CMV+MCS+BHG pA基因序列引物以pcDNA5_T0質(zhì)粒(購自LifeTechnologies公司，貨號:V103320)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接pGEM_T easy載體(購自Promega公司，貨號A3600),測定序列正確,構(gòu)成質(zhì)粒pCMV。2.重組載體pCMV-LacZ的構(gòu)建分別用內(nèi)切酶KpnI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pcDNA3. 1/His/LacZ (購自LifeTechnologies公司，貨號V38520)和pCMV,獲得LacZ序列和線性pCMV序列，分別純化回收。酶切后的LacZ片段與pCMV載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、及陽性克隆篩選，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCMV-LacZo三.gE基因缺失載體pdgE質(zhì)粒的構(gòu)建gE基因缺失載體pdgE質(zhì)粒的構(gòu)建策略見附圖3。1. gE基因上下游同源臂基因克隆的構(gòu)建分別利用UpgEl/ UpgE2、DogEl/ DogE2兩對引物以鴨瘟病毒基因組DNA為模板進(jìn)行上、下游同源臂PCR擴(kuò)增，獲得上游同源臂和下游同源臂基因。同源臂序列分別連接pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。將測序正確質(zhì)粒分別命名為pUPgE和pDOgE。

2. gE基因缺失載體pdgE質(zhì)粒的構(gòu)建用內(nèi)切酶分別雙酶切pUPgE和pDOgE質(zhì)粒，獲得UPgE片段和線性pDOgE質(zhì)粒片段，進(jìn)行純化回收。UPgE和線性pDOgE質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆，構(gòu)建質(zhì)粒命名為pdgE。四.帶有LacZ基因的鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建帶有LacZ基因的鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建策略見附圖4。用內(nèi)切酶酶切pdgE、pCMV-LacZ質(zhì)粒。將片段CMV-LacZ插入線性化的質(zhì)粒pdgE，連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。利用酶切鑒定篩選陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒pdgE -LacZ，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1,與最初的構(gòu)思的序列相一致。五.表達(dá)LacZ基因的gE一毒株的篩選和鑒定1. pdgE-LacZ轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的純化使用Wizard Purefection Plasmid DNA 純化試劑盒(購自 Promega 公司)純化pdgE-LacZ轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備將長成單層雞胚成纖維細(xì)胞用胰酶消化后，用含有10%牛血清的液體培養(yǎng)基營養(yǎng)液吹打分散細(xì)胞，以IX 106/mL的濃度接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20小時至細(xì)胞長至80%單層，用于轉(zhuǎn)染。3.轉(zhuǎn)染將制備的鴨瘟病毒液稀釋1000倍，以500uL接種于單層雞胚成纖維細(xì)胞細(xì)胞，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中吸附I小時，吸棄病毒液，加入含2%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，吸棄培養(yǎng)基，加入新鮮的不含有抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)基洗漆細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，重復(fù)洗漆3次,使用Invitrogen公司Lepofectamine 2000脂質(zhì)體將質(zhì)粒pdgE -LacZ轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞細(xì)胞。制備250uL A液(用不含有抗生素和血清的培養(yǎng)基稀釋2. 5ug pdgE - LacZ質(zhì)粒)，300 uL B液(240uL不含有抗生素和血清的培養(yǎng)基、10 uL脂質(zhì)體)，室溫放置5min后，逐滴將A液加入B液，室溫放置20min，將混合液溫和混勻，逐滴接種細(xì)胞，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，吸棄上清，加入含2%牛血清培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.重組病毒的篩選逐日用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯CPE后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，離心去掉細(xì)胞碎片，保存上清作為重組病毒的原液。將上述病毒液作10倍梯度稀釋，以lO'lO'KT3的濃度分別接種生長至90%以上的單層雞胚成纖維細(xì)胞，感作I小時后加入含2%牛血清、1%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)CPE后，吸棄培養(yǎng)基，加入融化的含I %低熔點(diǎn)瓊脂糖、150 u g/mL X-gal的DMEM培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)藍(lán)色蝕斑出現(xiàn)時，挑取彼此分離的單個蝕斑，用巴氏管小心刺穿培養(yǎng)基吸取藍(lán)斑，放入ImL含有2%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，凍融3次進(jìn)行新一輪的蝕斑純化，直至病變細(xì)胞全為藍(lán)色。5.重組病毒的PCR鑒定利用擴(kuò)增LacZ和gE基因兩對引物進(jìn)行分別PCR鑒定，確定轉(zhuǎn)入了上述構(gòu)建的質(zhì)粒pdgE -LacZ，獲得鴨瘟gE基因缺失疫苗株DPV/ gE—。六.鴨瘟gE基因缺失疫苗株(DPV/ gE—)產(chǎn)生鴨瘟抗體水平1.鴨瘟gE基因缺失疫苗(DPV/ gE—)的制備(I)制苗毒液制備將毒種鴨瘟gE基因缺失疫苗株DPV/ gE—加入長有致密單層的雞胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶內(nèi)，37°C吸附I小時，棄毒液，加入維持液，37°C培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。 接毒后1-3天75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，即可反復(fù)凍融3次后，IOOOOrpm離心IOmin,收獲病毒液。(2)配苗及分裝將檢驗(yàn)合格的半成品苗于37°C水浴中快速融化，過濾除去細(xì)胞碎片，加入5%蔗糖脫脂牛乳保護(hù)劑，充分混勻，無菌分裝于小瓶中。(3)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長，符合規(guī)定。2.鴨瘟gE基因缺失重組病毒免疫產(chǎn)生鴨瘟抗體水平測定按鴨瘟弱毒活疫苗的標(biāo)準(zhǔn)免疫程序分別用鴨瘟gE基因缺失重組病毒、鴨瘟標(biāo)準(zhǔn)毒株(陽性對照組)和生理鹽水接種I日齡雛鴨，將100倍稀釋的重組病毒的ELD50作為免疫劑量。建立試驗(yàn)組、陽性對照組和空白對照組，每組5只，0. 5mL/只，正常條件下飼養(yǎng)。分別于免疫后I周、2周、3周、4周抽取雛鴨血清。將抽取的血清滅活處理后，每組血清按1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280做梯度稀釋，分別與體積為0. 5mL的鴨瘟病毒等體積混合，用含有100個ELD50/0. 2mL作為中和劑量，混合物37°C感作30min，混合物接種9日齡鴨胚，各組5枚，每枚0. 2mL，37°C條件培養(yǎng)，6天后記錄培養(yǎng)結(jié)果。通過鴨胚中和試驗(yàn)檢測抗血清的中和滴度,結(jié)果顯示雛鴨經(jīng)過鴨瘟gE基因缺失重組病毒免疫后可以產(chǎn)生鴨瘟病毒抗體，而且抗體水平再統(tǒng)計期內(nèi)呈增高趨勢，說明鴨瘟gE基因缺失重組病毒保持了原有的抗原性。
權(quán)利要求
1.一種鴨瘟病毒缺失gE基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述的載體為包含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、BHG pA，以及鴨瘟病毒gE基因缺失序列的pdgE載體。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其核苷酸序列為SEQID NO:1。
3.權(quán)利要求1所述的載體，其構(gòu)建方法如下首先獲得含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、BHG pA的質(zhì)粒pCMV，將LacZ基因表達(dá)盒插入載體質(zhì)粒pCMV中得到載體質(zhì)粒PCMV-LacZ ;然后構(gòu)建含有g(shù)E基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的載體pdgE ;最后將含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亞克隆入載體pdgE內(nèi)，構(gòu)建成鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ。
4.權(quán)利要求1所述的載體在來制備預(yù)防鴨瘟的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明首先利用基因重組獲得含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、BHG pA的質(zhì)粒pCMV，將LacZ基因表達(dá)盒插入載體質(zhì)粒pCMV中得到載體質(zhì)粒pCMV-LacZ；其次利用PCR擴(kuò)增和基因重組構(gòu)建含有g(shù)E基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的載體pdgE；最后將含有CMV啟動子、多克隆酶切位點(diǎn)MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亞克隆入載體pdgE內(nèi)，構(gòu)建成鴨瘟病毒gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體pdgE-LacZ，獲得鴨瘟病毒gE基因缺失重組病毒株DPV/ gE—，同時保留了原有的抗原性。本產(chǎn)品可以用來構(gòu)架鴨瘟病毒gE基因缺失疫苗，還可以用來構(gòu)建重組活載體疫苗。
文檔編號A61P31/22GK103060356SQ20121054975
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者魏波, 凌紅麗, 徐麗麗, 王睿智 申請人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司