專利名稱：細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物復(fù)合材料領(lǐng)域，特別是涉及一種細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法。
背景技術(shù)：
木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)能合成分泌進(jìn)入培養(yǎng)液中的細(xì)胞外纖維素。這種分泌出來的細(xì)菌纖維素是以水合膠的形態(tài)存在，其中水分含量為其干重的500 700倍，因此在醫(yī)學(xué)上，這種高水分含量的材料非常適合作為一種直接被利用的創(chuàng)傷修復(fù)水合膠材料。細(xì)菌纖維素與植物衍化的纖維素有相同的分子和化學(xué)組成，但細(xì)菌纖維素具有高純度、高結(jié)晶度、納米結(jié)構(gòu)、在水合狀態(tài)下具有類似皮膚的機(jī)械性能和在生產(chǎn)階段就易通過各種器皿和模具來塑形等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌纖維素作為獨(dú)立的材料已經(jīng)使用在外科燒傷病人的創(chuàng)傷修復(fù)中并已獲得了優(yōu)良的治療效果。此外，有些研究者也正在研究賦予使細(xì)菌纖維素在體內(nèi)具有生物降解和吸收的功能。目前，為了擴(kuò)展細(xì)菌纖維素的應(yīng)用范圍，將其與其他材料進(jìn)行復(fù)合，賦予其新的功能已成為了當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。細(xì)菌纖維素能與無機(jī)、有機(jī)和金屬材料等復(fù)合。包括輕基磷灰石(Hydroxyapatite)、聚乳酸(PolyIactide)、納米金顆粒、殼聚糖，海藻酸鈉等。傳統(tǒng)的細(xì)菌纖維素符合材料的制備方法都是采用在發(fā)酵中進(jìn)行原位復(fù)合和在發(fā)酵后通過化學(xué)反應(yīng)或者物理沉積復(fù)合。其中原位復(fù)合主要針對(duì)一些不易溶于水或者有機(jī)溶劑的有機(jī)大分子，如前面提到的殼聚糖，海藻酸鈉或者聚乳酸等。原位復(fù)合是指在發(fā)酵前期，在培養(yǎng)液中加入需要復(fù)合進(jìn)入細(xì)菌纖維素的材料，然后依靠細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生細(xì)菌纖維素膜，使先前進(jìn)入培養(yǎng)液中的材料復(fù)合進(jìn)入細(xì)菌纖維素的網(wǎng)狀膜的空間。目前的原位復(fù)合技術(shù)相對(duì)于發(fā)酵后而言比較，不需要發(fā)酵后的任何化學(xué)和物理處理，節(jié)省了材料成本和可能的反應(yīng)污染等，材料的成本會(huì)大大降低。但是，在使用原位復(fù)合制備細(xì)菌纖維素與其他有機(jī)大分子的復(fù)合材料時(shí)，由于這種結(jié)合是物理結(jié)合，所以分散于培養(yǎng)液中的大分子材料并不能很好的進(jìn)入細(xì)菌纖維素的網(wǎng)狀膜的空間，復(fù)合率較低，造成材料的浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種復(fù)合率較高的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法。一種細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，包括制備包含葡萄糖、蛋白胨、無水磷酸氫二鈉和檸檬酸的培養(yǎng)液；將保藏編號(hào)為ATCC 700178、保藏編號(hào)為ATCC 53582或保藏編號(hào)為ATCC 53524的木醋桿菌菌種接種到所述培養(yǎng)液中，在28 32°C靜態(tài)培養(yǎng)I 2天，在所述培養(yǎng)液中生成細(xì)菌纖維素薄膜，在無菌條件下打散所述細(xì)菌纖維素薄膜，酶解所述細(xì)菌纖維素薄膜后離心，得到細(xì)菌接種液；將所述細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:1 1:3配制成菌液；將復(fù)合配體進(jìn)行預(yù)處理，然后通過滅菌處理后得到無菌凝膠；
將所述無菌凝膠與所述菌液按照體積比1:1 3:1充分混合，滴加至第一無菌氯化鈣溶液中，形成凝膠復(fù)合體小球，將所述凝膠復(fù)合體小球置于第二無菌氯化鈣溶液中靜置6 12小時(shí)后轉(zhuǎn)移至新配置的所述培養(yǎng)液，旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 3天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材；及將所述細(xì)菌纖維素復(fù)合基材采用靜態(tài)發(fā)酵或旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 5天，得到細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液還包括硫酸鎂、硫酸銨和玉米漿提取液。在其中一個(gè)實(shí)施例中，每IOOmL的培養(yǎng)液的成分為10 40g葡糖糖,3 6g蛋白胨,2 3g無水磷酸氫二鈉，I 2g梓檬酸,0. 5 1. 5g硫酸鎂,0. 5 Ig硫酸銨,0. 5 1.5mL玉米糖漿提取液。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)合配體為殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鈉、微晶纖維素、改性纖維素、改性淀粉、瓊脂糖、聚乳酸、聚乙醇酸、膠體硅、丙烯酸和海藻酸鈉的混合物、羥基磷灰石和海藻酸鈉的混合物、粘土和海藻酸鈉的混合物中的一種。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)合配體為殼聚糖，所述預(yù)處理為將每15 30g的所述殼聚糖在50 80°C完全溶解于IL的0. 1% 1. 0%的醋酸溶液中。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)合配體為海藻酸鈉，所述預(yù)處理為將每15 30g的所述海藻酸鈉溶解在IL的蒸餾水中，在80 100°C持續(xù)攪拌作用下，形成海藻酸鈉凝膠。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)合配體為丙烯酸與海藻酸鈉的混合物，所述預(yù)處理為將所述丙烯酸置于體積比10:1 15:1的蒸餾水和氨水的混合液中，加入氧化鋁和過硫酸鉀，所述丙烯酸、氧化鋁、過硫酸鉀的質(zhì)量比為1:0. 01:0. 05 1:0. 005:0. 025，然后在pH為6. 5 7. 5的條件下加熱攪拌聚合3 6小時(shí)，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5 3%的海藻酸鈉水溶液。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述酶解為往每IOOmL的打散的所述細(xì)菌纖維素薄膜的培養(yǎng)液中加入I 5mL的纖維素酶水溶液在26 33°C酶解I 3小時(shí)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一無菌氯化I丐溶液的濃度為0. 05mol/L 0.1mol/L0在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第二無菌氯化鈣溶液的濃度為0. 025mol/L 0.05mol/L。上述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法中，在培養(yǎng)液中生成含有細(xì)菌纖維素的細(xì)菌接種液，將細(xì)菌接種液在生理鹽水中配置成菌液，將復(fù)合配體經(jīng)預(yù)處理后形成中等粘度的無菌凝膠，再將無菌凝膠與菌液按照一定比例配合，然后在含有鈣離子的溶液中形成具有一定大小的凝膠復(fù)合體小球，將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，發(fā)酵天后，細(xì)菌纖維素長(zhǎng)出顆粒，形成新的顆粒包裹外層殼聚糖，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材；繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵成類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，或者轉(zhuǎn)變成靜態(tài)發(fā)酵形成薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。上述的制備方法中，通過含有鈣離子的溶劑來增強(qiáng)凝膠的結(jié)構(gòu)，先形成凝膠復(fù)合體小球，再繼續(xù)發(fā)酵獲得細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，其復(fù)合率高，材料利用率高。復(fù)合配體與細(xì)菌纖維素結(jié)合很緊密。


圖1為一實(shí)施方式的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法的流程圖；圖2為實(shí)施例3的類球狀細(xì)菌纖維素殼聚糖復(fù)合材料的圖片；圖3為實(shí)施例4的薄膜狀細(xì)菌纖維素殼聚糖復(fù)合材料的圖片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法進(jìn)行詳細(xì)說明。請(qǐng)參閱圖1，一實(shí)施方式類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，包括S101、制備包含葡萄糖、蛋白胨、無水磷酸氫二鈉和檸檬酸的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液是用于滿足菌體的生長(zhǎng)和維持的養(yǎng)料，并促進(jìn)產(chǎn)物的形成。本實(shí)施例中，培養(yǎng)液可以包括葡萄糖、蛋白胨、無水磷酸氫二鈉和檸檬酸。葡萄糖、蛋白胨、無水磷酸氫二鈉和朽1檬酸。具體操作可以為配置IOOmL的培養(yǎng)液。將20g葡萄糖、5g蛋白胨、2. 7g無水磷酸氫二鈉、1. 15g檸檬酸混合。將培養(yǎng)液pH值調(diào)節(jié)到6.0，適合菌種生長(zhǎng)。然后可根據(jù)不同的菌種對(duì)培養(yǎng)液的需求，在培養(yǎng)液中添加其他成分。本實(shí)施例中，對(duì)于用于培養(yǎng)保藏編號(hào)為ATCC 700178的菌種，可以在培養(yǎng)液中加入硫酸鎂、硫酸銨和玉米糖漿提取液。在其他實(shí)施例中，也可以根據(jù)菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，添加其他成分。S102、將保藏編號(hào)為ATCC 700178、保藏編號(hào)為ATCC 53582或保藏編號(hào)為ATCC53524木醋桿菌菌種接種到培養(yǎng)液中，在30°C靜態(tài)培養(yǎng)2天，在培養(yǎng)液中生成細(xì)菌纖維素薄膜，在無菌條件下打散細(xì)菌纖維素薄膜，酶解細(xì)菌纖維素薄膜后離心，得到細(xì)菌接種液。木醋桿菌是合成纖維素最強(qiáng)的細(xì)菌之一，且木醋桿菌所合成的纖維素具有較高的結(jié)晶度、聚合度和非常一致的分子取向，并且以單一的纖維素形式存在；同時(shí)純度高，獲得的纖維素抗拉力強(qiáng)度高，有極強(qiáng)的持水性和透水、透氣性；還具有生物可降解性，屬于環(huán)境友好型產(chǎn)品。本實(shí)施例中，選用保藏編號(hào)為ATCC 700178、保藏編號(hào)為ATCC 53582或保藏編號(hào)為ATCC 53524木醋桿菌菌種，作為產(chǎn)生木醋桿菌的菌種。在30°C靜態(tài)培養(yǎng)2天，選取木醋桿菌最適宜的生長(zhǎng)溫度25 30°C，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。然后打散生成的細(xì)菌纖維素薄膜，往每IOOmL的打散的細(xì)菌纖維素薄膜的培養(yǎng)液中加入I 5mL纖維素酶水溶液在26 33°C酶解I 3小時(shí)。在此過程中，如取ImL的JCM 9730木醋桿菌菌液至于IOOmL的培養(yǎng)液中，然后打散生成的細(xì)菌纖維素薄膜得到的溶液的過程中會(huì)有部分損失，此時(shí)的溶液為IOOmL,因此需要加入I 5mL纖維素酶水溶液。用高速離心機(jī)在離心力為2500 3500RCF下，離心5 15分鐘。在整個(gè)培養(yǎng)細(xì)菌接種液的過程中，一直保持無菌操作，以保證能獲得所需要的細(xì)菌。S103、將細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:1 1:3配制成菌液。根據(jù)菌液中活菌數(shù)量，將得到的細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比為1:1 1:3配置，得到一定濃度的菌液。生理鹽水又稱為無菌生理鹽水，在細(xì)菌接種液與復(fù)合配體復(fù)合前能暫時(shí)性保持細(xì)胞活性。S104、將復(fù)合配體進(jìn)行預(yù)處理，然后通過滅菌處理后得到無菌凝膠。

復(fù)合配體可以為殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鈉、微晶纖維素、改性纖維素、改性淀粉、瓊脂糖、聚乳酸、聚乙醇酸、膠體硅、丙烯酸、羥基磷灰石、粘土中的至少一種。當(dāng)復(fù)合配體為殼聚糖時(shí)，預(yù)處理可以為將分子量范圍在I 10萬左右的每15 30g殼聚糖在50°C條件下完全溶解于IL的0. 1% 1%的醋酸溶液中，形成具有一定粘度的凝膠。當(dāng)復(fù)合配體為海藻酸鈉時(shí)，預(yù)處理可以為直接將每15 30g的海藻酸鈉溶解在IL的蒸餾水中，形成中度凝膠，用于與菌液復(fù)合。當(dāng)復(fù)合配體為丙烯酸時(shí)，需要加入能形成凝膠的大分子做介質(zhì)。如果將丙烯酸與海藻酸鈉作為復(fù)合配體，再和菌液混合反應(yīng)，則可生產(chǎn)出物理復(fù)合較強(qiáng)的纖維素、海藻酸鈉、聚丙烯酸的復(fù)合材料。此復(fù)合材料的需要通過丙烯酸反應(yīng)生成聚丙烯酸的水合凝膠。具體的，預(yù)處理可以為將丙烯酸置于體積比為10:1 15:1的蒸餾水和氨水混合液中，加入氧化鋁和過硫酸鉀，所述丙烯酸、氧化鋁、過硫酸鉀的質(zhì)量比為1:0.01:0. 05 1:0. 005:0. 025,在pH為6. 5 7. 5的條件下加熱攪拌聚合3 6小時(shí)后加入凝膠介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5 3%的海藻酸鈉水溶液。在其他的實(shí)施例中，也可以采用海藻酸鈉作為凝膠介質(zhì)，來固定化硼酸鹽，羥基磷灰石，粘土材料等形成凝膠。滅菌處理可以為將凝膠進(jìn)行高壓蒸氣滅菌法進(jìn)行滅菌，能殺死影響菌液的細(xì)菌，該方法滅菌效果可靠、用法簡(jiǎn)單。當(dāng)然，在其他實(shí)施例中，也可以采用輻射滅菌或者干熱滅菌法對(duì)凝膠進(jìn)行滅菌處理，獲得無菌凝膠。S105、將無菌凝膠與菌液按照體積比1:1 3:1充分混合，滴加至第一無菌氯化鈣溶液中，形成凝膠復(fù)合體小球，將凝膠復(fù)合體小球置于第二無菌氯化鈣溶液中靜置6 12小時(shí)后轉(zhuǎn)移至新配置的所述培養(yǎng)液，旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 3天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。本實(shí)施例中，可以將混合液在無菌條件下倒入針筒內(nèi)，以每秒I 2滴的速度將混合液以液滴的形式注入第一氯化鈣溶液中，在第一氯化鈣溶液中得到凝膠包裹著的細(xì)胞的凝膠復(fù)合體小球，其中，第一無菌氯化I丐溶液的氯化I丐的濃度為0. 05mol/L 0. lmol/Lo當(dāng)然，在其他實(shí)施例中，也可以采用具有一定比例孔徑的多孔篩板來形成凝膠復(fù)合體小球。然后將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移至第二無菌氯化鈣溶液，第二無菌氯化鈣的濃度為0. 025mol/L 0. 05mol/L。氯化鈣溶液的濃度太大的 話，凝膠小球表面固化得厲害，纖維無法長(zhǎng)出球，太小的話，起不到固化的作用，因此選擇0. 025mol/L 0. 05mol/L的濃度范圍。細(xì)菌纖維素長(zhǎng)出顆粒，形成新的顆粒包裹外層的凝膠，得到小球狀的細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。S106、將細(xì)菌纖維素復(fù)合基材采用靜態(tài)發(fā)酵或旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 5天，得到細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。在細(xì)菌纖維素復(fù)合基材中，凝膠已被完全包裹在纖維素的小球中。在繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵的過程中，外層的纖維素小球?qū)⒗^續(xù)加固。旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 5天后，得到類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。當(dāng)然，也可依據(jù)所需要的小球的干重質(zhì)量密度來判定是否停止發(fā)酵。通常在125rpm轉(zhuǎn)速下，小球生長(zhǎng)到8 12mm時(shí)，軸向尺寸便不再增長(zhǎng)。但只要培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分充足，小球的干重質(zhì)量密度則會(huì)進(jìn)一步增加。如果需要0.1 0. 15mg/mm3的干重質(zhì)量密度，通常繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)至4 6天。如果需要0. 2mg/mm3以上的干重質(zhì)量密度，則需要培養(yǎng)10天以上。如果將細(xì)菌纖維素復(fù)合基材轉(zhuǎn)為靜態(tài)發(fā)酵2 5天，在靜態(tài)發(fā)酵過程中，小球繼續(xù)長(zhǎng)大，相互之間連接起來，形成了均勻而平整的薄膜狀細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。在靜態(tài)發(fā)酵過程中，根據(jù)所需的薄膜的厚度和尺寸來決定繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間。通常當(dāng)薄膜厚度要求在0. 5 Imm左右(冷凍干燥后，薄膜為250 X 150mm的方形)，需要靜態(tài)培養(yǎng)3 5天。當(dāng)薄膜厚度要求在I 2mm左右,需要靜態(tài)培養(yǎng)8 10天。當(dāng)薄膜厚度要求超過2mm,則需要靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)。在培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)充分的條件下，薄膜的長(zhǎng)寬厚尺寸會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，大尺寸的薄膜長(zhǎng)成所需時(shí)間更長(zhǎng)，反之時(shí)間會(huì)相應(yīng)縮短。
獲得細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料后，通過對(duì)培養(yǎng)液中的復(fù)合配體的殘留量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基本無復(fù)合配體游離出凝膠小球外，由此證明復(fù)合配體的損失率幾乎為零，幾乎100%的復(fù)合配體被復(fù)合進(jìn)入了細(xì)菌纖維素中。上述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法中，在培養(yǎng)液中生成含有細(xì)菌纖維素的細(xì)菌接種液，將細(xì)菌接種液在生理鹽水中配置成菌液，將復(fù)合配體經(jīng)預(yù)處理后形成中等粘度的無菌凝膠，再將菌液與無菌凝膠按照一定比例配合，然后在含有鈣離子的溶液中形成具有一定大小的凝膠復(fù)合體小球，將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，發(fā)酵天后，細(xì)菌纖維素長(zhǎng)出顆粒，形成新的顆粒包裹外層殼聚糖，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材；繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵成類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，或者轉(zhuǎn)變成靜態(tài)發(fā)酵形成薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。上述的制備方法中，通過含有鈣離子的溶劑來增強(qiáng)凝膠的結(jié)構(gòu)，先形成凝膠復(fù)合體小球，再繼續(xù)發(fā)酵獲得細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，其復(fù)合率高，材料利用率高。復(fù)合配體與細(xì)菌纖維素結(jié)合很緊密。上述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料可以用于注射型的藥物傳導(dǎo)材料，用在特定部位的靶向給藥。例如，殼聚糖已經(jīng)被證明對(duì)一些神經(jīng)纖維具有導(dǎo)向生長(zhǎng)功能，同時(shí)細(xì)菌纖維素?fù)碛蟹浅?yōu)良的粘附吸收功能，因此可以考慮將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料作為藥物用于治療受傷部位，而避免手術(shù)植入導(dǎo)致病人的身體創(chuàng)傷和疼痛。此外，對(duì)于一些內(nèi)部組織的創(chuàng)傷修復(fù)，如內(nèi)部組織粘膜破損，可采用將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料作為藥物直接注入修復(fù)損傷部位。實(shí)施例1制備培養(yǎng)液由20g葡萄糖,5g蛋白`胨,2. 7g無水磷酸氫二鈉，1. 15g朽1檬酸,Ig硫酸鎂，Ig硫酸銨，ImL玉米糖漿提取液組成IOOmL的培養(yǎng)液。細(xì)菌接種液的制備取ImL的JCM 9730木醋桿菌菌液至于IOOmL的培養(yǎng)液中，在30°C靜態(tài)培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)液和生成的細(xì)菌纖維素薄膜在無菌條件下轉(zhuǎn)移到滅菌的攪拌器內(nèi)，打散細(xì)菌纖維素薄膜后，加入2mL的纖維素酶水溶液在30°C酶解2小時(shí)，待細(xì)菌纖維素薄膜完全酶解掉以后，用高速離心機(jī)在3000RCF的離心力下離心10分鐘，取沉淀為細(xì)菌接種液。菌液的制備將上述細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:1比例混合后備用。無菌凝膠的制備取25g分子量范圍在I 10萬左右中度凝膠級(jí)別的殼聚糖，溶于IL的0. 1%的醋酸溶液中，50°C條件下，加熱攪拌配置成具有一定粘度凝膠溶液，蒸汽滅菌后，得到無菌凝膠。細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備將無菌凝膠與菌液按照體積比2:1充分混合。配置0. 05mol/L和0. lmol/L的氯化鈣溶液，滅菌。使用20mL的注射器配合0. 8mm的針頭，將混合液在無菌條件下倒入針筒內(nèi)，以每秒I滴的速度將混合液以液滴的形式注入0. lmol/L氯化鈣溶液中形成凝膠復(fù)合體小球。完成后，將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移到0. 05mol/L氯化鈣溶液中靜置6小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移小球到新配置的培養(yǎng)液中，在離心力為125RPM條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵4天，外層的纖維素小球繼續(xù)加固，得到類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，其干重質(zhì)量密度為0. lmg/mm3。實(shí)施例2
1、制備培養(yǎng)液由20g葡萄糖,5g蛋白胨,2. 7g無水磷酸氫二鈉，1. 15g朽1檬酸,Ig硫酸鎂，Ig硫酸銨，ImL玉米糖漿提取液組成IOOmL的培養(yǎng)液。2、細(xì)菌接種液的制備取ImL的JCM 9730木醋桿菌菌液至于IOOmL的培養(yǎng)液中，在30°C靜態(tài)培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)液和生成的細(xì)菌纖維素薄膜在無菌條件下轉(zhuǎn)移到滅菌的攪拌器內(nèi)，打散細(xì)菌纖維素薄膜后，每IOOmL的纖維素菌液加入ImL的纖維素酶水溶液在33°C酶解I小時(shí)，待細(xì)菌纖維素薄膜完全酶解掉以后，用高速離心機(jī)使用3000RCF的離心力，離心10分鐘，取沉淀為細(xì)菌接種液。3、菌液的制備將上述細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:3比例混合后備用。4、無菌凝膠的制備取30g分子量范圍在I 10萬左右的中度凝膠級(jí)別的殼聚糖溶于IL的1%的醋酸溶液，在50°C條件下完全溶解形成具有一定粘度的凝膠后蒸汽滅菌冷卻后，得到無菌凝膠。5、細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備將無菌凝膠與菌液按照體積比1:1充分混合。配置0. 025mol/L和0. 5mol/L的氯化鈣溶液，滅菌。使用20mL的注射器配合0. 8mm的針頭，將混合液在無菌條件下倒入針筒內(nèi)，以每秒I滴的速度將混合液以液滴的形式注入0. 05mol/L氯化鈣溶液中形成凝膠復(fù)合體小球。完成后，將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移到0. 025mol/L氯化鈣溶液中靜置12小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移小球到新配置的培養(yǎng)液中，在離心力為125RPM條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)發(fā)酵3天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。6、薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材轉(zhuǎn)入靜態(tài) 發(fā)酵5天，形成薄膜，得到薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。如果薄膜長(zhǎng)寬尺寸為250 X 150mm，則所獲得的薄膜厚度在Imm左右。實(shí)施例31、制備培養(yǎng)液由20g葡萄糖,5g蛋白胨,2. 7g無水磷酸氫二鈉，1. 15g朽1檬酸,Ig硫酸鎂，Ig硫酸銨，ImL玉米糖漿提取液組成IOOmL的培養(yǎng)液。2、細(xì)菌接種液的制備取ImL的JCM 9730木醋桿菌菌液至于IOOmL的培養(yǎng)液中，在30°C靜態(tài)培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)液和生成的細(xì)菌纖維素薄膜在無菌條件下轉(zhuǎn)移到滅菌的攪拌器內(nèi)，打散細(xì)菌纖維素薄膜后，每IOOmL纖維素菌液加入5mL的液體纖維素酶在28°C酶解3小時(shí)，待細(xì)菌纖維素薄膜完全酶解掉以后，用高速離心機(jī)在3000RCF的離心力下離心10分鐘，取沉淀為細(xì)菌接種液。3、菌液的制備將上述細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:3比例混合后備用。4、無菌凝膠的制備將30g海藻酸鈉溶于IL的蒸餾水中形成海藻酸鈉凝膠。5、類球狀細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備將無菌凝膠與菌液按照體積比3:1充分混合。使用注射器以每秒2滴的速度將混合凝膠以液滴的形式滴入0. 05mol/L的氯化鈣溶液中中形成凝膠復(fù)合體小球。然后將生成的小球轉(zhuǎn)入到0. lmol/L的氯化鈣溶液繼續(xù)加固12小時(shí)。最后將小球轉(zhuǎn)入新配置培養(yǎng)液中，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)4天后，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。6、類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵5天，外層的纖維素小球繼續(xù)加固，得到類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，其干重質(zhì)量密度為0. 3mg/mm3，如圖2所示。實(shí)施例41、制備培養(yǎng)液。
2、細(xì)菌接種液的制備。3、菌液的制備。4、無菌凝膠的制備。5、細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備。上述步驟與實(shí)施例3中I 5步驟相同。6、薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材轉(zhuǎn)入靜態(tài)發(fā)酵5天，形成薄膜，得到薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，薄膜厚度在0. 5mm左右，如圖3所示。實(shí)施例51、制備培養(yǎng)液。2、細(xì)菌接種液的制備。3、菌液的制備。上述步驟與實(shí)施例1中I 3步驟相同。4、無菌凝膠的制備取Ig丙烯酸，置于含有0. Olg的氧化鋁，ImL的濃氨水，15mL的蒸餾水和Ig的丙烯酸，加入0. 05g的過硫酸鉀反應(yīng)系統(tǒng)中，在pH6. 5的條件下，加熱攪拌聚合至6小時(shí)，獲得柔軟的聚丙烯酸膠體。經(jīng)滅菌后得到無菌凝膠。5、細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備將菌液和1. 5的海藻酸鈉按照體積比2:1充分混合。配置0. 05mol/L和0. lmol/L的氯化I丐溶液，滅菌。使用20mL的注射器配合0. 8mm的針頭，將混合液在無菌條件下倒入針筒內(nèi)，以每秒2滴的速度將混合液以液滴的形式注入0. lmol/L氯化鈣溶液中形成凝膠復(fù)合體小球。完成后，將凝膠復(fù)合體小球轉(zhuǎn)移到0. 05mol/L氯化鈣溶液中靜置6小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移小球到新配置的培養(yǎng)液中，在離心力為125RPM條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材。6、類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材繼續(xù)旋轉(zhuǎn)發(fā)酵5天，外層的纖維素小球繼續(xù)加固，得到類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，其干重質(zhì)量密度為0. 25mg/mm30實(shí)施例61、制備培養(yǎng)液。2、細(xì)菌接種液的制備。3、菌液的制備。4、無菌凝膠的制備。5、細(xì)菌纖維素復(fù)合基材的制備。上述步驟與實(shí)施例5中I 5步驟相同。6、薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備將上述類球狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材轉(zhuǎn)入靜態(tài)發(fā)酵6天，形成薄膜，得到薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料，薄膜厚度在Imm左右。由于聚丙烯酸有良好的粘彈性，所以這種復(fù)合材料可以作為藥物用于肌肉組織創(chuàng)傷修復(fù)中，海藻酸鈉和細(xì)菌纖維素行使給藥的傷口愈合的功能，聚丙烯酸行使在給藥過程中傷口愈合中模擬組織生物行為的功能。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括制備包含葡萄糖、蛋白胨、無水磷酸氫二鈉和檸檬酸的培養(yǎng)液；將保藏編號(hào)為ATCC 700178、保藏編號(hào)為ATCC 53582或保藏編號(hào)為ATCC 53524的木醋桿菌菌種接種到所述培養(yǎng)液中，在28 32°C靜態(tài)培養(yǎng)I 2天，在所述培養(yǎng)液中生成細(xì)菌纖維素薄膜，在無菌條件下打散所述細(xì)菌纖維素薄膜，酶解所述細(xì)菌纖維素薄膜后離心，得到細(xì)菌接種液；將所述細(xì)菌接種液與生理鹽水按照體積比1:1 1:3配制成菌液；將復(fù)合配體進(jìn)行預(yù)處理，然后通過滅菌處理后得到無菌凝膠；將所述無菌凝膠與所述菌液按照體積比1:1 3:1充分混合，滴加至第一無菌氯化鈣溶液中，形成凝膠復(fù)合體小球，將所述凝膠復(fù)合體小球置于第二無菌氯化鈣溶液中靜置6 12小時(shí)后轉(zhuǎn)移至新配置的所述培養(yǎng)液，旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 3天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材；及將所述細(xì)菌纖維素復(fù)合基材采用靜態(tài)發(fā)酵或旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2 5天，得到細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液還包括硫酸鎂、硫酸銨和玉米漿提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，每IOOmL的培養(yǎng)液的成分為10 40g葡糖糖,3 6g蛋白胨,2 3g無水磷酸氫二鈉，I 2g朽1檬酸,O. 5 1. 5g硫酸鎂,O. 5 Ig硫酸銨,O. 5 1. 5mL玉米糖衆(zhòng)提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合配體為殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鈉、微晶纖維素、改性纖維素、改性淀粉、瓊脂糖、聚乳酸、聚乙醇酸、膠體硅、丙烯酸和海藻酸鈉的混合物、羥基磷灰石和海藻酸鈉的混合物、粘土和海藻酸鈉的混合物中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合配體為殼聚糖，所述預(yù)處理為將每15 30g的所述殼聚糖在50 80°C完全溶解于IL的O.1% 1. 0%的醋酸溶液中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合配體為海藻酸鈉，所述預(yù)處理為將每15 30g的所述海藻酸鈉溶解在IL的蒸餾水中，在80 100°C持續(xù)攪拌作用下，形成海藻酸鈉凝膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合配體為丙烯酸與海藻酸鈉的混合物，所述預(yù)處理為將所述丙烯酸置于體積比10:1 15:1的蒸餾水和氨水的混合液中，加入氧化鋁和過硫酸鉀，所述丙烯酸、氧化鋁、過硫酸鉀的質(zhì)量比為1: O. 01:0. 05 1: O. 005:0. 025，然后在pH為6. 5 7. 5的條件下加熱攪拌聚合3 6小時(shí)，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5 3%的海藻酸鈉水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述酶解為往每IOOmL的打散的所述細(xì)菌纖維素薄膜的培養(yǎng)液中加入I 5mL的纖維素酶水溶液在26 33°C酶解I 3小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合基材的制備方法，其特征在于，所述第一無菌氯化I丐溶液的濃度為O. 05mol/L O. lmol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述第二無菌氯化鈣溶液的濃度為O. 025mol/L O. 05mol/L。
全文摘要
一種細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料的制備方法，包括制備培養(yǎng)液；將木醋桿菌菌種接種到培養(yǎng)液中，30℃靜態(tài)培養(yǎng)2天，生成細(xì)菌纖維素薄膜，在無菌條件下打散細(xì)菌纖維素薄膜，酶解細(xì)菌纖維素薄膜后離心，得到細(xì)菌接種液；與生理鹽水按照體積比1:1～1:3配制成菌液；將復(fù)合配體進(jìn)行預(yù)處理后再滅菌，得到無菌凝膠；將無菌凝膠與菌液按照體積比1:1～3:1充分混合，滴加至第一無菌氯化鈣溶液中，形成凝膠復(fù)合體小球，再轉(zhuǎn)移至第二無菌氯化鈣溶液中靜置6～12小時(shí)，置于新配置的培養(yǎng)液中，旋轉(zhuǎn)發(fā)酵2～3天，得到細(xì)菌纖維素復(fù)合基材；將細(xì)菌纖維素復(fù)合基材采用旋轉(zhuǎn)發(fā)酵或靜態(tài)發(fā)酵2～5天，得到類球狀或薄膜狀的細(xì)菌纖維素凝膠復(fù)合材料。其復(fù)合率高，材料利用率高。
文檔編號(hào)A61L31/04GK103028117SQ20121056702
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者胡陽, 高楠莎, 潘浩波, 呂小橋 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院