專利名稱：含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (BMP2)是已知的所有生長因子中骨形成作用最強的一種，具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，可與多種不同性質(zhì)的載體復(fù)合組成各種類型的具有生物活性的修復(fù)材料。而BMP2蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位問題，在分子和細(xì)胞水平上研究BMP2促進(jìn)成骨細(xì)胞生長領(lǐng)域具有重要作用。傳統(tǒng)的應(yīng)用于BMP2蛋白定位方法主要有免疫熒光和免疫膠體金標(biāo)記兩種方法，免疫熒光方法主要是根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的原理，先將抗體BMP2標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的BMP2抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原或抗體復(fù)合物上含有各種顏色的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激光的照射而發(fā)出各種顏色的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。金標(biāo)法是用金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，在光鏡下呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，不需加外進(jìn)行染色。然而免疫熒光方法對儀器的要求比較高，在液相中，可以用來檢測的分光光度計昂貴，結(jié)果不能長期保存。而免疫膠體金標(biāo)記法需要較高濃度的標(biāo)記物，耗費抗體或抗原的量較多，而且需要較大直徑的金顆粒(40-50nm)，才能獲得較高的靈敏度，而且當(dāng)金顆粒過大時，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動聚集。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供 一種穩(wěn)定性較高的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，包括pEGFP-Cl載體及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-Cl載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟以pC1-neo-BMP2質(zhì)粒作為模板及序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2的DNA序列作為兩引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，純化后得到含Hind III酶切位點及Kpn I酶切位點的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因；分別對PCR擴(kuò)增的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與pEGFP-Cl載體使用限制性內(nèi)切酶Hind III和限制性內(nèi)切酶Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物；將酶切后的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與酶切后的pEGFP-Cl載體按照質(zhì)量比為3:1飛I的比例在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到所述含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，其中，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-Cl載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。在其中一個實施例中，所述PCR擴(kuò)增的條件是首先在94°C預(yù)變性2分鐘，然后以98°C變形10秒、56°C退火30秒、68°C延伸1. 5分鐘循環(huán)25次，再在72°C延伸10分鐘。在其中一個實施例中，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶。上述含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體在制備骨形成基因藥物上的應(yīng)用。通過將骨形成蛋白2基因與綠色熒光蛋白基因(GFP基因)構(gòu)成融合基因，利用載體上的啟動子和信號序列來控制融合基因的表達(dá)，可在熒光顯微觀察系統(tǒng)下檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)，靈敏度高，結(jié)果易于檢測，當(dāng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)時，也不需要破壞細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)即可觀察，因此穩(wěn)定性較高，可以長期觀察。


圖1為一實施方式的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法流程圖；圖2為目的基因PCR擴(kuò)增后的電泳檢測圖；圖3為pEGFP-Cl載體示意圖；圖4為轉(zhuǎn)化后的陽性菌落PCR擴(kuò)增后的電泳檢測圖；圖5為轉(zhuǎn)化后的陽性菌落 中重組質(zhì)粒提取后的電泳檢測圖。
具體實施例方式下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。一實施方式的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，包括pEGFP-Cl載體及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-Cl載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。如圖1所示，本實施方式的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟步驟S110，以pC1-neo-BMP2質(zhì)粒作為模板及序列表中SEQ ID NO.1和SEQID NO. 2的DNA序列作為兩引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，純化后得到含HindIII酶切位點及Kpn I酶切位點的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因。優(yōu)選的，本實施方式的PCR擴(kuò)增的條件是首先在94°C預(yù)變性2分鐘，然后以98°C變形10秒、56°C退火30秒、68°C延伸1. 5分鐘的循環(huán)共循環(huán)25次，再在72°C延伸10分鐘。步驟S120，分別對PCR擴(kuò)增的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與pEGFP_Cl載體使用限制性內(nèi)切酶Hind III和限制性內(nèi)切酶Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物。步驟S130，將酶切后的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與酶切后的pEGFP-Cl載體按照質(zhì)量比為3:1飛I的比例在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到所述含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體。優(yōu)選的，本實施方式連接過程中使用的DNA連接酶為T4DNA連接酶。通過將骨形成蛋白2基因(BMP2基因)與綠色熒光蛋白基因(GFP基因)構(gòu)成融合基因，利用載體上的啟動子和信號序列來控制融合基因的表達(dá)，可在熒光顯微觀察系統(tǒng)下檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)，靈敏度高，結(jié)果易于檢測，當(dāng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)時，也不需要破壞細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)即可觀察，因此穩(wěn)定性較高，可以長期觀察。該含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體可以廣泛應(yīng)用在制備骨形成基因藥物領(lǐng)域。以下為具體實施例部分一、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因(BMP2基因)的擴(kuò)增與純化1.擴(kuò)增上游引物5’-CCCAAGCTTCCATGGTGGCCGGGACCCGCT-3’(序列表中 SEQ ID NO.1),其中包含有限制性內(nèi)切酶Hind III的酶切位點(AAGCTT);下游引物5’ -CGGGGTACCCGACACCCACAACCCTCCA-3’(序列表中SEQ IDN0. 2)，其中包含有限制性內(nèi)切酶Kpn I的酶切位點(GGTACC)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以插入完整的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因的稀釋500倍的pC1-neo-BMP2質(zhì)粒(由香港大學(xué)趙曉麗博士提供)為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2分鐘，以98°C變性10秒、56°C退火30秒、68°C延伸I分鐘30秒共擴(kuò)增25個循環(huán)，再以72°C充分延伸10分鐘。體系體積為15ul，配制如表1:表I
權(quán)利要求
1.一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，其特征在于，包括pEGFP-Cl載體及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-Cl載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。
2.一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 以pC1-neo-BMP2質(zhì)粒作為模板及序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2的DNA序列作為兩引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，純化后得到含Hind III酶切位點及Kpn I酶切位點的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因； 分別對PCR擴(kuò)增的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與pEGFP-Cl載體使用限制性內(nèi)切酶HindIII和限制性內(nèi)切酶Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物； 將酶切后的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因與酶切后的pEGFP-Cl載體按照質(zhì)量比為3:1飛I的比例在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到所述含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，其中，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-Cl載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。
3.如權(quán)利要求2所述的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件是 首先在94°C預(yù)變性2分鐘，然后以98°C變形10秒、56°C退火30秒、68°C延伸1. 5分鐘循環(huán)25次，再在72°C延伸10分鐘。
4.如權(quán)利要求2所述的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶。
5.權(quán)利要求1所述的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體在制備骨形成基因藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體，其包括pEGFP-C1載體及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因連接在所述pEGFP-C1載體的Hind III酶切位點與Kpn I酶切位點之間。通過將骨形成蛋白2基因與綠色熒光蛋白基因構(gòu)成融合基因，利用載體上的啟動子和信號序列來控制融合基因的表達(dá)，可在熒光顯微觀察系統(tǒng)下檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)，靈敏度高，結(jié)果易于檢測，當(dāng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)時，也不需要破壞細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)即可觀察，因此穩(wěn)定性較高，可以長期觀察。此外，本發(fā)明還涉及一種含骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
文檔編號A61K48/00GK103060357SQ201210568239
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者岳建輝 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院