專利名稱：具有fret效應(yīng)的還原敏感型熒光納米膠束及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及藥物載體領(lǐng)域，特別是涉及一種具有FRET效應(yīng)的還原敏感型熒光納米膠束及其制備方法。
背景技術(shù)：
突光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonance Energy Transfer, FRET)技術(shù)作為一種經(jīng)典的熒光技術(shù)，與熒光成像技術(shù)結(jié)合，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測(cè)等方面具有廣泛的應(yīng)用。FRET是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，當(dāng)作為供體的熒光基團(tuán)與作為受體的熒光基團(tuán)的吸收光譜有一定重疊，并且這兩個(gè)熒光基團(tuán)的距離在廣10納米時(shí)，熒光能量由供體分子向受體分子轉(zhuǎn)移。使得供體分子的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多，而受體分子發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)。近年來，具有環(huán)境響應(yīng)性的智能型自組裝形成的聚合物膠束作為藥物載體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景，引起了越來越多科學(xué)工作者的關(guān)注。智能型聚合物納米膠束利用某些鏈段對(duì)環(huán)境的敏感性，在相應(yīng)條件下使其發(fā)生降解、聚合物結(jié)構(gòu)的相轉(zhuǎn)變或體積相轉(zhuǎn)變等，從而達(dá)到控制藥物釋放的目的。目前，已合成了多種基于一種或多種環(huán)境響應(yīng)型的智能化的聚合物納 米膠束，如Jun Chen等合成了一種pH值和還原敏感雙重響應(yīng)的聚合物，用于細(xì)胞內(nèi)的阿霉素運(yùn)輸，有效地增強(qiáng)了阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的釋放。但是，同時(shí)具有FRET效應(yīng)和還原敏感響應(yīng)的熒光納米膠束一直未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種同時(shí)具有FRET效應(yīng)和還原敏感響應(yīng)的熒光納米膠束及其制備方法。一種具有FRET效應(yīng)的還原敏感型熒光納米膠束的制備方法，包括:制備聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(mPEG-PCL);將mPEG-PCL溶于四氫呋喃(THF)中，加入三乙胺(TEA)并攪拌，再加入對(duì)硝基苯氯甲酸酯(4-nitrophenyl chlorformate, PNC),室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，經(jīng)純化處理得到mPEG-PCL-PNC ；將胱胺二鹽酸鹽(cystamine dihydrochlochloride)溶于二甲基亞諷(Dimethylsulfoxide, DMS0)和吡啶的混合液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，將所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亞砜，混合所述胱胺二鹽酸鹽和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35 50 V下連續(xù)攪拌反應(yīng)2 3天，在重蒸水中透析3 4天，收集透析產(chǎn)物，冷凍真空干燥后得到mPEG-PCL-s-s-NH2 ；將所述HiPEG-PCL-S-S-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC),所述 mPEG-PCL-s-s-NH2 與 FITC 的摩爾比為1: f 1: 5，常溫下攪拌，反應(yīng)過夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，轉(zhuǎn)移至重蒸水中繼續(xù)透析2 3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC ；
將所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入改性4- 二甲胺偶氮苯-4'-羧酸(Dabcyl),所述mPEG-PCL-s-s-NH2與所述改性Dabcyl的摩爾比為1:1 1:5,常溫下攪拌，反應(yīng)過夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，轉(zhuǎn)移至重蒸水中繼續(xù)透析2 3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl ；將所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分別溶于四氫呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC與mPEG-PCL-s-s-Dabcy的質(zhì)量比為1:1 1:3的比例混合得到混合溶液，在攪拌的過程中滴加重蒸水，將滴加了重蒸水的混合溶液轉(zhuǎn)移到重蒸水中透析2 3天，得到具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述改性Dabcyl通過以下步驟制備:將Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入體積為所述二甲基甲酰胺的5 10倍量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫下攪拌反應(yīng)過夜，離心取上清，得到改性Dabcyl。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述制備mPEG-PCL包括步驟:將
權(quán)利要求
1.一種具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，包括:制備 mPEG-PCL ； 將所述mPEG-PCL溶于四氫呋喃中，加入三乙胺并攪拌，再加入PNC，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，經(jīng)純化處理得到mPEG-PCL-PNC ； 將胱胺二鹽酸鹽溶于二甲基亞砜和吡啶的混合液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，將所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亞砜，混合所述胱胺二鹽酸鹽和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35 5(TC下連續(xù)攪拌反應(yīng)2 3天，在重蒸水中透析3 4天，收集透析產(chǎn)物，冷凍真空干燥后得到 mPEG-PCL-s-s-NH2 ； 將所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入FITC，所述mPEG-PCL-s-s_NH2與所述FITC的摩爾比為1: f 1: 5，常溫下攪拌，反應(yīng)過夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，轉(zhuǎn)移至重蒸水中繼續(xù)透析2 3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC ； 將所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入改性Dabcyl，所述mPEG-PCL-s-s-NH2與改性Dabcyl的摩爾比為1:1 1: 5，常溫下攪拌，反應(yīng)過夜，在二甲基甲酰胺中透析廣2天，轉(zhuǎn)移至重蒸水中繼續(xù)透析2 3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl ;及 將所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分別溶于四氫呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC與mPEG-PCL-s-s-Dabcy的質(zhì)量比為1:1 1:3的比例混合得到混合溶液，在攪拌的過程中滴加重蒸水，將滴加了重蒸水的混合溶液轉(zhuǎn)移到重蒸水中透析2 3天，得到具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述改性Dabcyl通過以下步驟制備:將Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入體積為所述二甲基甲酰胺的5 10`倍量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫下攪拌反應(yīng)過夜,離心后取上清,得到改性Dabcyl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述制備mPEG-PCL包括步驟: 將d用氫化鈣干燥，減壓蒸餾；取甲基化的聚乙二醇，于80°C抽真空I小時(shí)；往所述甲基化的聚乙二醇中加入辛酸亞錫和干燥的在氮?dú)獗Ｗo(hù)下140°C反應(yīng)8小時(shí)后，加入氯仿溶解反應(yīng)產(chǎn)物，再用正己烷沉淀，抽濾，真空干燥后得到mPEG-PCL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述mPEG-PCL與所述三乙胺的摩爾比為300:1 100:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述mPEG-PCL與所述PNC的摩爾比為0.1: f 1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述mPEG-PCL-PNC與胱胺二鹽酸鹽的摩爾比為0.01: f 0.1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述純化處理為將反應(yīng)過夜的反應(yīng)液經(jīng)離心除去三乙醇胺鹽酸鹽，取上清液，加入體積為所述上清液的I(T20倍的冰乙醚，抽濾，將固體物溶于四氫呋喃中，加入體積為所述四氫呋喃的1(T20倍的冰乙醚，抽濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述在攪拌的過程中滴加重蒸水的體積為所述混合溶液的體積的1/2 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束的制備方法，其特征在于，所述將滴加了重蒸水的混合溶液轉(zhuǎn)移到重蒸水中透析2 3天中采用透析袋進(jìn)行透析，所述透析袋為截留分子量為10001500的透析袋。
10.一種具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束，其特征在于，包括mPEG-PCL-s-s-FITC 和 mPEG-PCL-s-s-Dabcyl，其中，具有 FRET 效應(yīng)的供體 FITC 和受體Dabcyl 通過共價(jià)交聯(lián)接合到mPEG-PCL-s-s_NH2上，且所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl 的質(zhì)量比為 1:1 1:3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束及其制備方法。該具有FRET效應(yīng)的還原敏感型聚合物納米膠束包括mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl，其中，具有FRET效應(yīng)的供體FITC和受體Dabcyl通過共價(jià)交聯(lián)接合到mPEG-PCL-s-s-NH2上，且所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl的質(zhì)量比為1:1～1:3。
文檔編號(hào)A61K9/107GK103102479SQ201210568269
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者蔡林濤, 石碧華, 劉朋, 龔萍, 王碧 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院